陳佩宣,李漢秋,吳細(xì)妹,陳志娟,劉建國

(廣東省東莞廣濟(jì)醫(yī)院　523690)

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免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用研究

陳佩宣,李漢秋,吳細(xì)妹,陳志娟,劉建國

(廣東省東莞廣濟(jì)醫(yī)院523690)

目的探討免疫比濁法在檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用。方法收集2014年1～10月東莞廣濟(jì)醫(yī)院皮膚科血清標(biāo)本480份，用免疫比濁法、梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)分別進(jìn)行檢測，陽性結(jié)果與TPPA檢測不符的標(biāo)本采用熒光螺旋體抗體吸附試驗(yàn)(FTA-ABS)進(jìn)行驗(yàn)證；另選擇10份TPPA檢測滴度為1∶1 280陽性標(biāo)本，用生理鹽水按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280進(jìn)行稀釋，用免疫比濁法和ELISA分別進(jìn)行檢測。結(jié)果TPPA檢出陽性標(biāo)本70份，免疫比濁法檢出陽性標(biāo)本69份，ELISA檢出陽性標(biāo)本73份，4份與TPPA陽性結(jié)果不相符的標(biāo)本經(jīng)FTA-ABS確認(rèn)全部為陰性；10份滴度為1∶1 280的陽性標(biāo)本稀釋后用免疫比濁法和 ELISA對(duì)各個(gè)滴度進(jìn)行檢測，其敏感性分別為78.3%和96.7%。結(jié)論免疫比濁法、ELISA與TPPA3種方法特異性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，免疫比濁法可以取代TPPA作為梅毒血清學(xué)初篩陽性標(biāo)本的確認(rèn)試驗(yàn)在臨床上推廣應(yīng)用；敏感性方面免疫比濁法比ELISA低，在檢測低濃度標(biāo)本時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，免疫比濁法不能取代ELISA作為梅毒螺旋體抗體過篩試驗(yàn)。

梅毒螺旋體抗體；免疫比濁法；梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

梅毒是由梅毒螺旋體感染引起的一種慢性傳染病，主要通過性接觸直接傳播，還可以通過胎盤、接吻、手術(shù)、輸血、哺乳、接觸污染物等途徑進(jìn)行傳播。梅毒螺旋體感染人體后可侵犯人體的所有器官，對(duì)人類健康危害極大。梅毒臨床表現(xiàn)可分為早期梅毒、晚期梅毒和潛伏梅毒。早期梅毒和潛伏梅毒可無臨床癥狀[1]，診斷主要靠實(shí)驗(yàn)室檢查，尤其是梅毒血清學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)室檢測梅毒血清抗體的方法有很多種，不同檢測方法的臨床應(yīng)用有所不同。免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體是一種新開展的檢測方法，對(duì)本方法進(jìn)行研究和評(píng)價(jià)具有十分重要的臨床意義。本研究通過對(duì)免疫比濁法與梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的特異性和敏感性進(jìn)行比較分析，探討免疫比濁法在檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1標(biāo)本來源收集東莞廣濟(jì)醫(yī)院2014年1～10月皮膚科進(jìn)行梅毒血清學(xué)檢查的血清標(biāo)本480份，其中男性300份、女性180份，年齡2～84歲、平均33歲。

1.2儀器與試劑日立7180全自動(dòng)生化分析儀，徠卡DM750熒光顯微鏡，雷杜RT-6000酶標(biāo)分析儀，匯松PW-9600全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒(免疫比濁法)由北京邁譽(yù)森生物科技有限公司提供，ELISA試劑購自北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，TPPA試劑購自日本富士瑞必歐株式會(huì)社，F(xiàn)TA-ABS試劑購自德國歐蒙公司。所有試劑都在有效期內(nèi)使用。

1.3方法用免疫比濁法、TPPA和ELISA分別對(duì)480份標(biāo)本進(jìn)行檢測，陽性結(jié)果與TPPA檢測不符的標(biāo)本采用熒光螺旋體抗體吸附試驗(yàn)(FTA-ABS)進(jìn)行驗(yàn)證；另選擇10份TPPA檢測滴度為1∶1 280陽性標(biāo)本，用生理鹽水按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280進(jìn)行稀釋，用免疫比濁法和ELISA分別進(jìn)行檢測。操作嚴(yán)格按照試劑說明書和SOP文件進(jìn)行。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1免疫比濁法檢測出陽性標(biāo)本69份，其中68份結(jié)果與TPPA檢測結(jié)果相符；ELISA檢測出陽性標(biāo)本73份，其中70份與TPPA檢測結(jié)果相符。4份與TPPA陽性結(jié)果不相符的標(biāo)本經(jīng)FTA-ABS(IgG) 確認(rèn)全部為陰性；1份比濁法檢測為陰性而TPPA和ELISA分別檢測為陽性的標(biāo)本經(jīng)FTA-ABS(IgG)確認(rèn)為陽性。TPPA、免疫比濁法與ELISA的特異度分別為100.0%、99.8%和99.2%；敏感度分別為100.0%、97.1%和100.0%，結(jié)果見表1。

表1　　3種方法檢測結(jié)果比較(n)

表2　　10份1∶1 280陽性標(biāo)本稀釋后免疫比濁法與ELISA檢測結(jié)果比較(n)

注：+表示陽性，-表示陰性。

2.2在10份TPPA檢測滴度為1∶1 280的陽性標(biāo)本稀釋至1∶40、1∶80、1∶160、1∶320時(shí)免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)兩種方法檢測結(jié)果都為陽性；稀釋至1∶640時(shí)免疫比濁法檢測7份陽性、3份陰性，ELISA檢測10份都為陽性；稀釋至1∶1 280時(shí)免疫比濁法檢測均為陰性，ELISA檢測8份陽性、2份陰性。統(tǒng)計(jì)二者的敏感度分別為78.3%和96.7%，結(jié)果見表2。免疫比濁法特異性低于TPPA但高于ELISA，不過其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，敏感性方面免疫比濁法比ELISA低，特別是在檢測低濃度標(biāo)本時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3　討　　論

梅毒螺旋體是引起梅毒的病原體，人體感染了梅毒螺旋體后可產(chǎn)生多種抗體。梅毒螺旋體人工培養(yǎng)較為困難，實(shí)驗(yàn)室診斷主要以血清學(xué)為主。梅毒血清學(xué)檢測試驗(yàn)根據(jù)抗原不同分為兩類：一類為非特異性抗體檢測，另一類是特異性抗體檢測。梅毒非特異性抗體檢測常用于對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行初篩、臨床療效觀察、復(fù)發(fā)或再感染的檢查，其缺點(diǎn)是不能反映既往感染，且受其他因素影響較大，易產(chǎn)生假性結(jié)果；梅毒特異性抗體檢測常用于對(duì)非特異性抗體初篩陽性標(biāo)本進(jìn)行復(fù)檢確認(rèn)，此類方法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，且不能作為療效觀察指標(biāo)。對(duì)上述血清學(xué)試驗(yàn)如何選擇應(yīng)用，世界衛(wèi)生組織(WHO)和美國疾病預(yù)防控制中心(CDC)都推薦用梅毒螺旋體非特異性抗體試驗(yàn)對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行過篩試驗(yàn)，出現(xiàn)陽性者用梅毒螺旋體特異性抗體試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，這是傳統(tǒng)的梅毒血清學(xué)檢測方案，缺點(diǎn)是對(duì)過往感染者易產(chǎn)生漏檢；目前國內(nèi)外一些臨床實(shí)驗(yàn)室為了降低漏檢率和提高工作效率逐漸采用梅毒血清學(xué)“逆向程序檢測方案”[2]，即先用梅毒螺旋體特異性抗體試驗(yàn)對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行過篩試驗(yàn)，出現(xiàn)陽性者用梅毒螺旋體非特異性抗體試驗(yàn)進(jìn)行現(xiàn)癥確認(rèn)。

目前國內(nèi)大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室在檢測梅毒螺旋體特異性抗體常采用ELISA和TPPA。ELISA是在聚苯乙烯微孔條上預(yù)包被梅毒螺旋體抗體的基因重組抗原，配以酶標(biāo)記抗原、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)及過氧化物等試劑，檢測人血清或血漿中梅毒螺旋體抗體。ELISA試劑具有價(jià)廉、保存時(shí)間長且穩(wěn)定、不污染環(huán)境、敏感性高、可批量操作等優(yōu)點(diǎn)，被推薦為梅毒血清學(xué)篩查的理想方法[3]，也是我國血站篩查梅毒抗體的指定方法。TPPA是將梅毒螺旋體Nichols株的精制菌體成分包被在人工載體明膠粒子上，這種致敏粒子和樣品中的梅毒螺旋體抗體進(jìn)行反應(yīng)發(fā)生凝集，產(chǎn)生粒子凝集反應(yīng)，由此可以檢測出血清和血漿中的梅毒螺旋體抗體，并且可用來測定抗體效價(jià)。TPPA具有高特異性，目前國內(nèi)外臨床實(shí)驗(yàn)室常用它作為初篩陽性或可疑標(biāo)本的確證試驗(yàn)[4]。免疫比濁法是以純化的梅毒螺旋體抗原包被在乳膠表面上，利用這種致敏顆粒與標(biāo)本中的梅毒螺旋體抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)發(fā)生乳膠凝集，凝集反應(yīng)引起吸光度變化，通過測定反應(yīng)前后吸光度變化量檢測梅毒螺旋體抗體的濃度。免疫比濁法與ELISA和TPPA都是檢測梅毒螺旋體特異性抗體，所以本研究通過采用免疫比濁法與TPPA和ELISA這兩種相對(duì)成熟的方法在特異性和敏感性方面進(jìn)行比較分析，探討免疫比濁法在檢測梅毒螺旋體抗體的臨床應(yīng)用。

免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體是一種新開展的檢測方法。本研究采用免疫比濁法、ELISA和TPPA分別檢測480份血清標(biāo)本，陽性結(jié)果與TPPA檢測不符的標(biāo)本采用FTA-ABS進(jìn)行驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)3種檢測方法的特異性和敏感性；選擇10份TPPA檢測滴度為1∶1 280陽性標(biāo)本，用生理鹽水按照1∶40、1∶80……1∶1 280進(jìn)行稀釋，用免疫比濁法和ELISA分別進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)兩種方法在檢測低濃度標(biāo)本時(shí)的敏感性。從檢測結(jié)果中可以看出：免疫比濁法特異性低于TPPA但高于ELISA，不過其差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這與相關(guān)報(bào)道相一致[5]；敏感性方面免疫比濁法比ELISA低，特別是在檢測低濃度標(biāo)本時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。由此可見，免疫比濁法可作為梅毒血清學(xué)初篩陽性標(biāo)本的確認(rèn)試驗(yàn)，由于其整個(gè)操作過程可在全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行，操作簡單，人為影響因素少，易于標(biāo)準(zhǔn)化，且可以定量，無論是大批量標(biāo)本還是單個(gè)標(biāo)本的檢測，都可以做到隨到隨測，非常方便，所以本研究認(rèn)為免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體完全可以取代TPPA在臨床上加以推廣應(yīng)用。在本次研究中也可以看出，在70例陽性標(biāo)本中免疫比濁法存在2例漏檢，在對(duì)低濃度標(biāo)本檢測敏感性明顯比不上ELISA，這可能是受其方法學(xué)的局限所致(免疫比濁法的最小檢測限為μg水平[6]，而ELISA則可達(dá)到ng甚至pg水平[7])。人感染梅毒螺旋體后的臨床表現(xiàn)十分復(fù)雜，有的甚至不出現(xiàn)任何臨床癥狀，及早發(fā)現(xiàn)對(duì)梅毒進(jìn)行及時(shí)治療有很大幫助，因此在對(duì)梅毒血清學(xué)篩查時(shí)更看重檢測方法的敏感性，所以本研究認(rèn)為免疫比濁法不能取代在“逆向程序檢測方案”中常用于梅毒螺旋體抗體篩查的ELISA。

在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)：免疫比濁法誤判為陽性的標(biāo)本有輕微脂血，而脂血是影響本法假性升高的重要因素之一，因此凡是能引起濁度變化的標(biāo)本，比如高血脂、反復(fù)凍融、細(xì)菌污染、變質(zhì)等標(biāo)本均不宜用此法檢測梅毒螺旋體抗體；ELISA誤判為陽性的3例標(biāo)本中有1例標(biāo)本溶血，1例標(biāo)本來自78歲的老年男性，1例原因不明。溶血標(biāo)本中的血紅蛋白可非特異的吸附到反應(yīng)孔上，在洗板不徹底的情況下，血紅蛋白的亞鐵血紅素具有類過氧化酶活性，作用于底物引起假陽性；老年患者用ELISA檢測梅毒螺旋體抗體易出現(xiàn)假陽性，這可能與一些交叉抗原和其自身免疫狀況有關(guān)[8]；原因不明的假陽性標(biāo)本極有可能是由一些非特異物質(zhì)干擾引起，但也有可能是感染梅毒螺旋體時(shí)間不長，或者是一些自身免疫缺陷患者抗體滴度極低所致，像此類患者需定期進(jìn)行隨訪復(fù)查或采用其他方法(如直接鏡檢、基因測定等)做進(jìn)一步檢查。

綜上所述，免疫比濁法檢測梅毒螺旋體抗體有較高的特異性，有操作簡單方便、速度快、可定量等優(yōu)點(diǎn)，可作為對(duì)梅毒血清學(xué)初篩陽性標(biāo)本的確認(rèn)試驗(yàn)加以推廣應(yīng)用；而要求有高敏感性的梅毒螺旋體抗體過篩試驗(yàn)，免疫比濁法卻有所欠缺，加上價(jià)格昂貴，因此不主張加以推廣。免疫比濁法所測定的定量結(jié)果對(duì)梅毒療效觀察意義不大，陽性結(jié)果濃度的高低對(duì)陽性預(yù)測值的判斷有一定的幫助。免疫比濁法的檢測結(jié)果與其他血清學(xué)檢測方法一樣，陽性僅提示標(biāo)本中有梅毒螺旋體抗體存在，不能作為臨床診斷的絕對(duì)依據(jù)，陰性也不能完全排除梅毒螺旋體感染，診斷須結(jié)合病史、臨床癥狀、實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行綜合分析。

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10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.045

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1673-4130(2016)16-2316-03

2016-02-22

2016-05-24)