文　嵐，朱彩明，曹可珂，黃非凡，田　斌

(長沙市疾病預防控制中心　410001)

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長沙市食品從業(yè)人員致瀉大腸埃希菌實時熒光多重PCR檢測結(jié)果分析

文嵐，朱彩明，曹可珂，黃非凡，田斌△

(長沙市疾病預防控制中心410001)

目的了解長沙市食品從業(yè)人員致瀉大腸埃希菌感染、分布及毒力基因攜帶情況。方法抽取長沙市9個單位258例食品從業(yè)人員為研究對象，采用實時熒光多重聚合酶鏈反應(PCR)檢測致瀉大腸埃希菌。結(jié)果致瀉大腸埃希菌感染率為15.5%(40/258)，其中腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)占10.9%(28/258)，腸致病性大腸埃希菌(EPEC)占3.1%(8/258)，腸出血性大腸埃希菌(EHEC)占1.6%(4/258)，未檢出腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)和腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)。28株EAEC攜帶uidA基因26株，aggR+pic基因13株，astA基因27株，攜帶率分別為92.9%、46.4%、96.4%；8株EPEC全部攜帶eae和uidA基因；4株EHEC中3株攜帶eae基因，且都攜帶stx1+stx2基因。結(jié)論建立持續(xù)監(jiān)測致瀉大腸埃希菌的機制和深入研究其分子流行病學理論，除了為監(jiān)管部門制訂和評價公共衛(wèi)生措施提供基礎數(shù)據(jù)，對評價食品安全狀況，有效控制傳染源、保護人民群眾健康具有重要意義。

致瀉大腸埃希菌;食品從業(yè)人員;實時熒光多重PCR;長沙

大腸埃希菌(EC)是腸道中較為重要的正常菌群，能為宿主提供一些具有營養(yǎng)作用的合成代謝物質(zhì)[1]。一些血清型的大腸埃希菌獲得了致病能力，可引起腸道內(nèi)感染，故稱為致瀉大腸埃希菌[2](DEC)。致瀉大腸埃希菌是重要的食品安全危害因素，受到消費者和食品加工企業(yè)的廣泛關(guān)注。

致瀉大腸埃希菌引起的腹瀉是全球許多國家重要的公共衛(wèi)生問題[3]。通常分為6個群：腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC)、腸聚集性大腸埃希菌(EAEC)和擴散黏附大腸埃希菌(DAEC)等。搜索萬方、維普和中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)關(guān)于長沙市致瀉大腸埃希菌的報道較少，關(guān)于長沙市食品從業(yè)人員致瀉大腸埃希菌的文獻更為鮮見。為了解長沙市食品從業(yè)人員致瀉大腸埃希菌感染、分布及毒力基因攜帶情況，本研究采用實時熒光多重聚合酶鏈反應(PCR)檢測食品從業(yè)人員肛門拭子，分離培養(yǎng)標本，并對結(jié)果進行分析。

1　資料與方法

1.1一般資料用整體抽樣的方法于2015年5～10月抽取長沙市9個單位食品從業(yè)人員為研究對象，共258例。其中供職衛(wèi)生等級為A級餐飲單位的從業(yè)人員203例，占78.7%，其余55例供職于衛(wèi)生等級為B級的餐飲單位。工作單位性質(zhì)為大學食堂、大型餐館和中型餐館的分別為55、186例和17例，分別占調(diào)查人數(shù)的21.3%、72.1%和6.6%。從業(yè)人員的工種涉及廚師、服務員、切菜、切配菜工、洗菜工、蒸飯及其他。年齡16～60歲，平均(35.23±12.06)歲；工齡20 d至35年，平均(7.73±8.26)年。性別、文化程度和民族信息見表1。

1.2試劑與儀器熒光多重PCR檢測采用北京卓誠惠生生物科技有限公司生產(chǎn)的5種致瀉性大腸埃希菌實時熒光多重PCR檢測試劑盒(適用Roche 480Ⅱ)。儀器為Roche 480Ⅱ。

1.3方法每例研究對象采集1份肛門拭子于卡-布(Cary-Blair)運送培養(yǎng)基內(nèi)，至實驗室后立即接種于1塊麥康凱(MAC)瓊脂平板，(36±1)℃培養(yǎng)24 h，挑取5個大腸埃希菌可疑菌落(粉紅色或紅色，光滑、不透明、突起、濕潤)分別接種營養(yǎng)瓊脂，置于(36±1)℃培養(yǎng)24 h,刮取營養(yǎng)瓊脂平板上的新鮮培養(yǎng)物，進行實時熒光多重PCR檢測。

表1　　研究對象一般信息

1.4統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析。計數(shù)資料采用數(shù)量和百分比描述，行列表的統(tǒng)計采用Fisher精確檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　　果

2.1實時熒光多重PCR檢測結(jié)果研究對象258例中檢出致瀉大腸埃希菌40例，感染率為15.5%(40/258)。其中EAEC 28例(10.9%，28/258)，EPEC 8例(3.1%，8/258)，EHEC 4例(1.6%，4/258)，未檢出EIEC和ETEC。未發(fā)現(xiàn)同一研究對象檢出一種以上致瀉大腸埃希菌的現(xiàn)象，40例致瀉大腸埃希菌中構(gòu)成比最高的是EAEC，占70%(28/40)，EPEC和EHEC分別占20%(8/40)和20%(4/40)。致瀉大腸埃希菌陽性結(jié)果在不同衛(wèi)生等級、單位性質(zhì)和工種中的分布見表2和表3。

另外，統(tǒng)計結(jié)果還顯示致瀉大腸埃希菌陽性結(jié)果在不同性別間的差異無統(tǒng)計學意義，F(xiàn)isher精確檢驗P=0.754(95%CI:0.745～0.762)。致瀉大腸埃希菌陽性結(jié)果各年齡均有，從17～55歲，無聚集傾向，F(xiàn)isher精確檢驗P=0.956(95%CI:0.952～0.960)；與工齡長短亦無明顯相關(guān)，工齡跨度從1個月到26年，也無聚集性傾向，F(xiàn)isher精確檢驗P=0.236(95%CI:0.228～245)。

表2　　不同衛(wèi)生等級和單位性質(zhì)研究對象實時熒光多重PCR檢測結(jié)果[n(%)]

注：1.衛(wèi)生等級為A、B兩組檢測結(jié)果經(jīng)Fisher精確檢驗P=0.056(95%CI:0.051～0.060);2.大學食堂、大型餐館和中型餐館檢測結(jié)果經(jīng)Fisher精確檢驗P=0.064(95%CI:0.059～0.068)。

表3　　不同工種研究對象實時熒光多重PCR檢測結(jié)果[n(%)]

注：不同工種檢測結(jié)果經(jīng)Fisher精確檢驗P=0.455(95%CI:0.445～0.465)。

2.240株致瀉大腸埃希菌毒力基因攜帶情況28株EAEC攜帶uidA基因26株，aggR+pic基因13株，astA27株，攜帶率分別為92.9%、46.4%、96.4%；8株EPEC全部攜帶eae和uidA基因；4株EHEC中3株攜帶eae基因，且都攜帶stx1+stx2基因。見表4。

表4　　40株致瀉大腸埃希菌毒力基因攜帶情況(n)

注：+表示陽性，-表示陰性。

3　討　　論

致瀉大腸埃希菌是許多國家和地區(qū)細菌性腹瀉的常見病原菌，占腹瀉病原菌的40.3%左右[4]，監(jiān)測中發(fā)現(xiàn)急性腹瀉標本中致瀉大腸埃希菌的檢出率約為7.19%[5]，也有報道成人腹瀉標本檢出率為8.24%[6]，并且發(fā)現(xiàn)小于1歲的兒童中占有較大比重。致瀉大腸埃希菌在細菌性食物中毒中扮演重要角色[7-9]，因此對致瀉大腸埃希菌監(jiān)測是非常重要的工作。

本文結(jié)果顯示長沙市食品從業(yè)人員致瀉大腸埃希菌陽性檢出率為15.5%，種群包括EAEC、EPEC和EHEC，以EAEC為主，EPEC和EHEC次之，未發(fā)現(xiàn)EIEC和ETEC。鄧艷華[10]報道，采用分子生物學的方法監(jiān)測食品從業(yè)人員致瀉大腸埃希菌的感染率為6.49%，檢出了EIEC和EPEC，且以EIEC為主。陳沖等[5]報道結(jié)果顯示EPEC和EAEC為主，EPEC感染率高于EAEC。與上述研究相比較長沙市致瀉大腸埃希菌感染率和種群分布都不同。

研究檢測出的致瀉大腸埃希菌在單位性質(zhì)、衛(wèi)生等級和不同工種的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。另外年齡和工齡因素對食品從業(yè)人員致瀉大腸埃希菌感染亦無影響。這與其他研究人員的研究結(jié)果基本一致[10-12]，這可能與調(diào)查人群基本屬于機體免疫力較強的中年和壯年人群有關(guān)。

致瀉大腸埃希菌的致病性和分類與其質(zhì)粒攜帶的毒力基因的轉(zhuǎn)移和溶原性噬菌體的序列整合密切相關(guān)。本研究檢測出的陽性菌株所攜帶的毒力基因情況如下：28株EAEC攜帶uidA基因26株，aggR+pic基因13株，astA基因27株，攜帶率分別為92.9%、46.4%、96.4%；8株EPEC全部攜帶eae和uidA基因；4株EHEC中3株攜帶eae基因，且都攜帶stx1+stx2基因。說明長沙市食品從業(yè)人員所感染致瀉大腸埃希菌毒力基因中uidA、astA、aggR+pic較為常見，eae和stx1+stx2亦有發(fā)現(xiàn)。

因此，建立持續(xù)監(jiān)測致瀉大腸埃希菌的機制和深入研究其分子流行病學理論，除了為監(jiān)管部門制訂和評價公共衛(wèi)生措施提供基礎數(shù)據(jù)，對評價食品安全狀況，有效控制傳染源、保護人民群眾健康也具有重要意義。

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Analysis on detection results of diarrheogenic Escherichia coli among food practitioners in Changsha City by real time fluorescence multiple PCR

WENLan,ZHUCaiming,CAOKeke,HUANGFeifan,TIANBin△

(ChangshaMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Changsha,Hunan410001,China)

ObjectiveTo investigate the infection and distribution situations of diarrheogenic Escherichia coli among food practitioners in Changsha City and to understand the carrying status of its virulence genes.MethodsTotally 258 food practitioners from 9 units of Changsha City were extracted as the research subjects.Diarrheogenic Escherichia coli was detected by adopting the real time fluorescence multiple PCR.ResultsThe infection rate of diarrheogenic Escherichia coli was 15.5%(40/258),in which EAEC accounted for 10.9% (28/258),EPEC for 3.1%(8/258) and EHEC for 1.6%(4/258) respectively,EIEC and ETEC were not found.Among 28 strains of EAEC,26 strains carried uidA gene,13 strains carried aggR+pic gene and 27 strains carried astA gene,the carrying rates were 92.9%,46.4% and 96.4% respectively;eight strains of EPEC all carried eae and uidA genes;among 4 strains of EHEC,3 strains carried eae gene,moreover all 4 strains carried stx1+stx2 gene.ConclusionEstablishing a mechanism for continuously monitoring diarrheogenic Escherichia coli and deeply studying its molecular epidemiologic theory not only provide the essential data for the supervisory departments formulating and evaluating the public health measures,but also has an important significance for evaluating the food safety status,which can effectively control infectious source and protect the people′s health.

diarrheogenic Escherichia coli;food practitioner;real time fluorescence multiplex PCR;Changsha

文嵐，男，副主任技師，主要從事病原微生物研究工作?！?/p>

，E-mail:t.b2002@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.021

A

1673-4130(2016)16-2260-03

2016-01-20

2016-06-07)