陳志忠,李結(jié)敏,陳尚良,梁潔貞,盧少芬,陳超紅,陸倩文,張　綺

(廣東省肇慶市中心血站　526020)

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·論著·

病毒滅活血漿殘余亞甲藍(lán)對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞免疫功能影響的體外研究*

陳志忠,李結(jié)敏,陳尚良△,梁潔貞,盧少芬,陳超紅,陸倩文,張綺

(廣東省肇慶市中心血站526020)

目的利用人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)研究用于血漿病毒滅活后殘余的亞甲藍(lán)是否對(duì)人體免疫細(xì)胞功能產(chǎn)生影響。方法采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，在T細(xì)胞特異性刺激因子Anti-CD3/CD28存在的條件下，加或者不加不同濃度的亞甲藍(lán)共培養(yǎng)，培養(yǎng)至72 h，收集培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞因子分泌情況；培養(yǎng)66 h后，加入CCK-8染料繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，于A450處測(cè)定細(xì)胞增殖情況。結(jié)果高濃度劑量亞甲藍(lán)(1.25、2.5、5 μmol/L組)對(duì)Anti-CD3/28刺激PBMC的增殖均有明顯抑制作用(P<0.01)，其OD值由0.897±0.385分別降至0.632±0.334、0.524±0.254、0.445±0.287，呈一定的劑量依賴效應(yīng)。高濃度亞甲藍(lán)(1.25、2.5、5 μmol/L組)可下調(diào)Anti-CD3/28誘導(dǎo)PBMC分泌細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-17a、IL-10、γ-干擾素(IFN)-γ，且呈劑量依賴效應(yīng)。1.25、2.5、5 μmol/L的亞甲藍(lán)影響PBMC分泌IL-17a，IL-17a水平由(406±57)pg/mL分別降至(276±38)、(192±31)、(134±24)pg/mL；影響PBMC分泌IL-10，IL-10水平由(184±15)pg/mL分別降至(132±13)、(110±12)、(42±8)pg/mL；影響PBMC分泌IFN-γ， IFN-γ水平由(4 512±187)pg/mL分別降至(2 876±143)、(2 234±153)、(1 988±112)pg/mL。結(jié)論高濃度亞甲藍(lán)(≥1.25 μmol/L)對(duì)人PBMC的增殖以及分泌細(xì)胞因子功能有顯著抑制作用，換而言之,血漿病毒滅活后殘余濃度(≤0.33 μmol/L)的亞甲藍(lán)對(duì)PBMC免疫功能無明顯影響，但該濃度的亞甲藍(lán)對(duì)人純T細(xì)胞免疫功能是否有影響需要進(jìn)一步評(píng)估研究。

病毒滅活血漿；亞甲藍(lán)；人外周血單個(gè)核細(xì)胞； T淋巴細(xì)胞；免疫功能

亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活血漿中病毒的效果已被證實(shí)，輸注病毒滅活血漿成為國(guó)內(nèi)外預(yù)防輸注血漿制品傳播疾病的有效措施[1-3]。亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活病毒最終血漿制劑中亞甲藍(lán)殘余濃度≤0.30 μmol/L[4]，即≤0.096 mg/L，與臨床的使用劑量(1～2)mg/kg體質(zhì)量相比，濃度是非常低的。但考慮到大量輸注血漿的患者多為危重病，如多發(fā)性創(chuàng)傷、心臟手術(shù)、多器官衰竭、凝血功能紊亂等患者，本身功能較衰弱，同時(shí)大量輸血本身也存在輸血后免疫抑制的風(fēng)險(xiǎn)[5]，故有必要考慮亞甲藍(lán)對(duì)人體免疫功能的影響。亞甲藍(lán)毒理實(shí)驗(yàn)證明其安全[6-7]，但體內(nèi)、外基因毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚不一致[8-9]。目前，亞甲藍(lán)一定程度的致突變性和其他不良反應(yīng)已被體外實(shí)驗(yàn)所證明[10]，然而其對(duì)人免疫細(xì)胞的影響尚未明確。為保障輸血安全，筆者對(duì)亞甲藍(lán)影響人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖以及分泌細(xì)胞因子功能進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料新鮮人靜脈血(枸櫞酸鈉抗凝)由肇慶市中心血站提供；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)柹锟萍加邢薰?；CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit-8)購(gòu)自日本株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Ebioscience公司；Anti-CD3、Anti-CD28購(gòu)自Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離人PBMC在離心管中加入20 mL淋巴細(xì)胞分離液；取枸櫞酸鈉抗凝靜脈血與等量RPMI-1640液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面；水平離心，2 000 r/min，20 min；用滴管吸出白色云霧層細(xì)胞，加入5倍體積的無菌PBS，1 500 r/min離心10 min，洗滌細(xì)胞2次；末次洗滌時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞用RPMI-1640重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。

1.2.2亞甲藍(lán)溶液的配制分析天平準(zhǔn)確稱取分析純亞甲藍(lán)試劑0.032 g，溶于10 mL RPMI-1640液，充分溶解后，溶液經(jīng)0.22 μm過濾器濾過除菌，即為亞甲藍(lán)溶液保存液(1 mmol/L)，-20 ℃保存?zhèn)溆?，根?jù)實(shí)驗(yàn)需要取保存液使用RPMI-1640液進(jìn)行稀釋使用。

1.2.3PBMC的培養(yǎng)96孔培養(yǎng)板加入Anti-CD3(1 μg/mL)、Anti-CD28(5 μg/mL)，每孔200 μL，4 ℃過夜；吸走包被上清液，每孔加入PBMC細(xì)胞懸浮液100 μL；加入不同濃度亞甲藍(lán)工作液(20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0 μmol/L)100 mL,最終培養(yǎng)體積為每孔200 mL，終濃度分別10、5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0 μmol/L，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，72 h后收集細(xì)胞或者上清液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子細(xì)胞培養(yǎng)第3天收集各組細(xì)胞上清液，以ELISA檢測(cè)γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素(IL)-17a和IL-10分泌情況。按照試劑盒說明，將捕獲抗體用包被緩沖液稀釋250倍，加入酶聯(lián)板，每孔100 μL，4 ℃包被過夜。次日PBS-T洗滌5次。加入檢測(cè)緩沖液，每孔200 μL，于室溫封閉1 h，PBS-T洗滌5次；分別加入待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液和倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(按1∶2 000稀釋)，每孔100 μL，室溫反應(yīng)1 h，PBS-T洗板5次。加入已稀釋的檢測(cè)抗體，每孔100 μL。于室溫反應(yīng) 1 h，PBS-T洗板5次。加入Avidin-HRP(按1∶250稀釋)，每孔100 μL。于室溫反應(yīng)30 min。PBS-T洗滌7次。加入TMB底物緩沖液，每孔100 μL。顯色5～10 min。最后用2 mol/L H2SO4顯色終止液終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處光密度(OD)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中細(xì)胞因子濃度。

1.2.5CCK-8法檢測(cè)MBL對(duì)PBMC增殖的調(diào)節(jié)作用按照1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)66 h后，加入20 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h，測(cè)450 nm處OD值。

2　結(jié)　　果

2.1亞甲藍(lán)抑制PBMC的增殖CCK-8法顯示高濃度劑量的亞甲藍(lán)對(duì)PBMC增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴效應(yīng)，見圖1。與對(duì)照組相比，亞甲藍(lán)濃度1.25、2.5、5 μmol/L組對(duì)Anti-CD3/28刺激PBMC的增殖均有明顯抑制作用(P<0.01)，其OD值由0.897±0.385分別降至0.632±0.334、0.524±0.254、0.445±0.287。

注：橫坐標(biāo)均表示亞甲藍(lán)濃度分組；+表示Anti-CD3/28刺激條件，-則表示無Anti-CD3/28。

2.2亞甲藍(lán)抑制特異性刺激因子(Anti-CD3/CD28)誘導(dǎo)PBMC分泌細(xì)胞因子在亞甲藍(lán)與Anti-CD3/28共處理PBMC細(xì)胞組，高濃度亞甲藍(lán)組(1.25、2.5、5 μmol/L組)可下調(diào)Anti-CD3/28所誘導(dǎo)PBMC分泌細(xì)胞因子IL-17a、IL-10、IFN-γ的分泌，且呈一定劑量依賴效應(yīng)。亞甲藍(lán)濃度1.25、2.5、5 μmol/L組影響PBMC分泌IL-17a，IL-17a水平由(406±57)pg/mL分別降至(276±38)、(192±31)、(134±24)pg/mL(圖2A)；影響PBMC分泌IL-10，IL-10水平由(184±15)pg/mL分別降至(132±13)、(110±12)、(42±8)pg/mL(圖2B)；影響PBMC分泌IFN-γ，IFN-γ水平由(4 512±187)pg/mL分別降至(2 876±143)、(2 234±153)、(1 988±112)pg/mL(圖2C)。

注：橫坐標(biāo)均表示亞甲藍(lán)濃度分組；+表示Anti-CD3/28刺激條件，-則表示無Anti-CD3/28。

3　討　　論

近年有學(xué)者研究認(rèn)為，亞甲藍(lán)能在動(dòng)物模型中增加誘發(fā)胰腺癌的概率[8-9]，隨后有學(xué)者對(duì)其可能發(fā)生的機(jī)制進(jìn)一步研究后認(rèn)為，可能是亞甲藍(lán)介導(dǎo)的DNA損傷增加了腫瘤的發(fā)生概率[10]。2011年，日本學(xué)者報(bào)道了2例輸注亞甲藍(lán)病毒滅活血漿發(fā)生過敏性反應(yīng)從而致死的案例[11]，但其機(jī)制至今未明[12]。最近，國(guó)內(nèi)學(xué)者研究認(rèn)為病毒滅活殘余亞甲藍(lán)對(duì)人CIK細(xì)胞的體外殺傷功能以及增殖未見明顯影響[13]，國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)亞甲藍(lán)可影響PBMC細(xì)胞跨越內(nèi)皮的遷徙能力，并且呈劑量效應(yīng)[14-16]。但亞甲藍(lán)對(duì)PBMC免疫功能的影響，目前少見報(bào)道。

本研究通過分離健康志愿者PBMC與亞甲藍(lán)共培養(yǎng)，研究評(píng)估其對(duì)人T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。本研究發(fā)現(xiàn)高濃度的亞甲藍(lán)(≥1.25 μmol/L)對(duì)Anti-CD3/28所誘導(dǎo)PBMC細(xì)胞增殖以及細(xì)胞因子IL-17a、IL-10、IFN-γ的分泌量有顯著的抑制作用。IL-17a主要由Th17分泌，屬于Th17細(xì)胞因子，亞甲藍(lán)對(duì)PBMC分泌IL-17a有抑制作用，將影響Treg/Th17的平衡；IL-10主要由單核巨噬細(xì)胞和Th細(xì)胞分泌，屬于Th2細(xì)胞因子，主要生物效應(yīng)是刺激B淋巴細(xì)胞的分化增殖，產(chǎn)生抗體，亞甲藍(lán)對(duì)PBMC分泌IL-10有抑制作用，可能將加大大量輸血本身也存在輸血后免疫抑制的風(fēng)險(xiǎn)。IFN-γ主要由活化的Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞分泌，屬于Th1細(xì)胞因子，主要的生物學(xué)功能是刺激CTL細(xì)胞的分化增殖，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒效應(yīng)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，亞甲藍(lán)濃度低于1.25 μmol/L組對(duì)PBMC的增殖以及分泌細(xì)胞因子的功能無明顯影響。目前，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)病毒滅活血漿亞甲藍(lán)殘余濃度要求為≤0.33 μmol/L，僅為1.25 μmol/L的1/4濃度，且血漿輸入人體后，會(huì)被體內(nèi)血容量稀釋，故體內(nèi)實(shí)際濃度將更加低，由此可見，輸注亞甲藍(lán)病毒滅活血漿不會(huì)因殘余的亞甲藍(lán)對(duì)人體PBMC細(xì)胞免疫功能產(chǎn)生影響。

PBMC是從人外周血中分離得到，其主要由淋巴細(xì)胞構(gòu)成，而且T淋巴細(xì)胞占其主要部分。本研究中使用了特異性T淋巴細(xì)胞刺激因子為共培養(yǎng)的PBMC提供共刺激信號(hào)，一般認(rèn)為只有CD3+T細(xì)胞會(huì)被活化增殖，執(zhí)行相應(yīng)的生物學(xué)功能。T淋巴細(xì)胞是獲得性免疫系統(tǒng)中最重要的細(xì)胞，不僅影響免疫應(yīng)答強(qiáng)度，而且影響機(jī)體免疫應(yīng)答的類型，闡明亞甲藍(lán)對(duì)人T細(xì)胞免疫功能的影響具有重要意義。T淋巴細(xì)胞是獲得性免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞，不僅參與細(xì)胞免疫，而且輔助體液免疫；不僅激活免疫應(yīng)答，而且誘導(dǎo)免疫耐受。一方面初始T細(xì)胞通過其抗原識(shí)別受體(TCR)/CD3復(fù)合物識(shí)別抗原提呈細(xì)胞(APC)提呈的抗原肽后，活化并分化為效應(yīng)T細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮效應(yīng)和(或)調(diào)節(jié)功能。另一方面，T細(xì)胞通過Th1/Th2亞群分化的影響，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的類型。故本研究實(shí)際上間接評(píng)估了亞甲藍(lán)對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。

但鑒于PBMC除T細(xì)胞外，還有B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞等，因此亞甲藍(lán)上述的抑制作用不一定是其對(duì)T細(xì)胞的作用。因此在后續(xù)的研究中，將采用免疫磁珠負(fù)選法，分離獲得純化的T細(xì)胞，進(jìn)一步明確亞甲藍(lán)對(duì)T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響。

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In vitro study on influence of residual methylene blue after virus inactivation plasma on immune function of human PBMC cells*

CHENZhizhong,LIJiemin,CHENShangliang△,LIANGJiezhen,LUShaofen,CHENChaohong,LUQianwen,ZHANGQi

(ZhaoqingMunicipalBloodCenter,Zhaoqing,Guangdong526020,China)

ObjectiveTo study the influence of residual methylene blue after plasma viral inactivation on the human immune cell function by using the peripheral blood mononuclear cell(PBMC).MethodsPBMC were isolated by adopting the Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation method and co-cultured for 72 h in presence of specific T cell stimulating factors(Anti-CD3/28 and Anti-CD28),with or without different concentration of methylene blue.The culture supernatant was collected and detected the cytokines secretion situation by ELISA.After 66 h culture,CCK-8 dye was added and continueously cultured for 4-6 h,the proliferation was determined at A450.ResultsThe high-concentration doses of methylene blue (1.25,2.5,5 μmol/L groups) had significantly inhibiting effect on the proliferation of PBMC stimulated by Anti-CD3/28(P<0.01),its OD value was decreased from 0.897±0.385 to 0.632±0.334,0.524±0.254 and 0.445±0.287 respectively,showing certain dose dependent effect.The high concentrations of methylene blue (1.25,2.5,5 μmol/L groups) could down-regulate interleukin(IL)-17a,IL-10 and interferon(IFN)-γ secreted by anti-CD28 induced PBMC,moreover showing a dose dependent effect.1.25,2.5,5 μmol/L methylene blue affected the IL-17a level secreted by PBMC from (406±57)pg/mL descending to (276±38),(192±31),(134±24)pg/mL respectively;affected PBMC to secrete IL-10,its level was reduced from (184±15) pg/mL to (132±13),(110±12),(42±8)pg/mL;affected PBMC to secrete IFN-γ,its level was deduced from (4 512±187)pg/mL to (2 876±143),(2 234±153),(1 988±112)pg/mL respectively.ConclusionHigh concentrations of methylene blue (≥1.25 μmol/L) has the significant inhibiting effect on the proliferation and cytokine secretion functions of PBMC.In other words,the residual methylene blue concentration in viral inactivation plasma (≤0.33 μmol/L) has no obvious effect on the immune function of PBMC,but whether this concentration of methylene blue having the effect on human pure T cell immune function needs to be further evaluated and studied.

virus inactivation plasma;methylene blue;the peripheral blood mononuclear cell;T lymphocyte;immune function

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2015238)。

陳志忠，男，副主任技師，主要從事采供血管理和血液安全研究。△

，E-mail:fimmu2000@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.16.001

A

1673-4130(2016)16-2205-03

2016-03-10

2016-06-20)