盛　莉,康延海

(海南省人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科一區(qū),海南 ?？?70311)

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生脈注射液聯(lián)合表阿霉素對肝癌細胞HepG-2表阿霉素敏感性的影響

盛莉,康延海

(海南省人民醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科一區(qū),海南 ?？?70311)

表阿霉素是一種抗生素類抗腫瘤藥物，臨床應(yīng)用廣泛，可用于胃癌、肝癌、惡性淋巴瘤等疾病治療。該藥物通過抑制胞內(nèi)遺傳物質(zhì)增殖來發(fā)揮功效，肝癌是我國最常見的惡性腫瘤，HepG-2是肝組織的腫瘤細胞，有效抑制該細胞的增值是肝癌病情控制的關(guān)鍵。相關(guān)報道[1]指出單一化療藥物容易使患者產(chǎn)生耐藥性，且不良反應(yīng)較多，目前聯(lián)合用藥抑制肝癌細胞增值成為臨床應(yīng)用熱點。生脈注射液是從傳統(tǒng)經(jīng)典方劑生脈飲基礎(chǔ)上制成的中成藥，多數(shù)研究[2,3]提示其聯(lián)合化療藥物可提高機體免疫功能，減輕毒副反應(yīng)。本研究探討生脈注射液聯(lián)合表阿霉素對肝癌細胞HepG-2表阿霉素敏感性的影響，現(xiàn)報道如下：

1　材料與方法

1.1研究材料

試劑：RPMll640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、豬胰蛋白酶(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，注射用鹽酸表柔比星(表阿霉素，輝瑞制藥有限公司)，生脈注射液(山西太行藥業(yè)股份有限公司)，噻唑藍(MTT，美國AMRESCO公司)，凱基AnnexinV-FITC檢測試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)。主要儀器：酶標儀(奧地利安托斯儀器公司)，流式細胞儀(美國DB公司)。細胞株：人肝癌HepG-2細胞株(中國科學(xué)院上海細胞庫)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將肝癌HepG-2細胞放于100ml/L小牛血清、100Μ/L青霉素、100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37度恒溫培養(yǎng)箱中，細胞單層貼壁生長，長至80%-90%用豬胰蛋白酶溶液消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行相關(guān)試驗。

1.2.2流式細胞法取對數(shù)生長期肝癌HepG-2細胞，將其接種于24孔板，培養(yǎng)24h，將細胞分成對照組(正常條件)、給藥1組(30μl/ml生脈注射液)、給藥2組(0.03μg/ml表阿霉素)、給藥3組(30μl/ml生脈注射液+0.03μg/ml表阿霉素)，僅需培養(yǎng)24h，收集細胞，根據(jù)試劑盒操作說明處理細胞，流式細胞儀觀察檢測細胞凋亡率。

1.2.3MTT試驗取對數(shù)生長期的肝癌HepG-2細胞，用豬胰蛋白酶進行消化，將DMEM稀釋成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度5×104/ml，將其接種于96孔板，培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)基去掉，對照組(正常培養(yǎng))，給藥1組(生脈注射液，體積分數(shù)0、10、20、50、100、200μl/ml)，給藥2組(表阿霉素作用HepG-2細胞，濃度0、0.2、0.6、1.8、5.4μg/ml)，給藥3組(30μl/ml生脈注射液聯(lián)合濃度0、0.2、0.6、1.8、5.4μg/ml表阿霉素)，培養(yǎng)72h，每孔加入20μl5mg/mlMTT，培養(yǎng)4h，棄掉孔中培養(yǎng)基，加150μlDMSO，震蕩10min，酶標儀測定吸光度(492nm)。每組重復(fù)試驗5次，計算藥物IC50值。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1凋亡作用

對照組24h存活HepG-2細胞92.8%，給藥1組、2組和3組藥物作用24h后存活HepG-2細胞分別占93.6%、58.5%、35.4%，給藥2組和3組細胞存活率明顯少于給藥1組和對照組(P<0.05)，給藥1組同對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

2.2增敏效果

單用表阿霉素作用的IC50為(0.043±0.013)/(μg·ml-1)，聯(lián)合生脈注射液后表阿霉素IC50(0.003±0.001)/(μg·ml-1)，增效約14倍，具體見表2。

表1　生脈注射液聯(lián)合表阿霉素對肝癌 HepG-2 細胞凋亡作用

表2　生脈注射液對表阿霉素作用于肝癌細胞HepG-2的增敏效果

3　討論

通過MTT試驗發(fā)現(xiàn)生脈注射液對HepG-2有一定抑制作用，但需較高藥物體積分數(shù)才能發(fā)揮抑制效果，低體積分數(shù)生脈注射液對腫瘤細胞存活無顯著性影響，該結(jié)果和李斌[4]文獻中所得到的結(jié)果相一致。已有報道[5]對生脈注射液的增效減毒作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)其在不同腫瘤細胞中的增效作用各異。

本研究探討了生脈注射液對表阿霉素的增敏作用。通過流式細胞分析，單用生脈注射液細胞凋亡率4.7%，同正常培養(yǎng)的細胞凋亡率無明顯差異，該結(jié)果說明低體積分數(shù)生脈注射液對HepG-2細胞的傷害微小。單用表阿霉素作用HepG-2細胞，細胞凋亡率40.5%，可證實表阿霉素對HepG-2細胞有較好的殺傷作用，可促進細胞凋亡。表阿霉素作用機制是嵌入到脫氧核糖核酸堿基對之間，以此來干擾DNA轉(zhuǎn)錄，對信使RNA的形成受到抑制，同時還可以抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ[6]，是治療肝癌的重要藥物之一。生脈注射液聯(lián)合表阿霉素作用HepG-2細胞，細胞凋亡率達到64.1%，提高約20%，說明生脈注射液可能促進了表阿霉素抑制腫瘤增值的作用。生脈注射液的主要成分是紅參、麥冬、五味子，紅參主要含人參皂苷，相關(guān)研究指出人參皂苷對人肝癌細胞具有誘導(dǎo)分化作用，Rh2可抑制癌細胞擴散[7]，增強機體免疫功能，同時可改善心肌功能。而表阿霉素的主要毒副作用是心肌傷害[8]，其正好用以減輕該傷害。麥冬主要含多種甾體皂苷，其主要用于抗腫瘤、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)等方面。五味子主要含聯(lián)苯環(huán)辛烯類物質(zhì)，主要是五味子乙素，五味子乙素可上調(diào)細胞抗氧化防御機制，廣泛保護機體組織。相關(guān)研究[9]指出人參皂苷Rb1和五味子乙素可改變P-gp蛋白表達，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性，適合配伍抗腫瘤藥物使用。生脈注射液成分的上述作用提示其對抗腫瘤藥物可能有好的增敏作用，研究進一步分析了生脈注射液對表阿霉素的增敏作用，配伍用藥后表阿霉素的IC50值明顯降低，增效近14倍，說明配伍生脈注射液后，提示小劑量的表阿霉素就可以達到殺滅腫瘤細胞的作用，這樣就可以減少表阿霉素的用藥劑量，減輕不良反應(yīng)，這對肝癌患者的臨床治療有重要的意義。表阿霉素作為抗腫瘤的有效藥物，療效較好，但心肌毒性較大，限制了其在臨床上的應(yīng)用[10]。

[1]苗苗，李嵚，劉雅茹.生脈注射液對不同化療藥物的增敏作用[J].中草藥，2013，44(7):875.

[2]王偉，姚朝輝.生脈注射液對晚期非小細胞肺癌患者化療毒副反應(yīng)及免疫功能的影響[J]．臨床肺科雜志,2012,17(5):876.

[3]張力，龔明玉，李毅學(xué)，等．放療聯(lián)合熱療誘導(dǎo)肝癌HepG2細胞凋亡及其與Bcl-2和Bax蛋白表達關(guān)系的研究[J]．中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(20)：627．

[4]李斌.干擾TIGAR基因增強肝癌細胞對表阿霉素化療敏感性的機制研究[D].鄭州大學(xué)附屬二院，2011.

[5]YinQH,YanFX,ZuXY,etal.Anti-proliferativeandpro-apoptoticeffectofcarvacrolonhμmanhepatocellμlarcarcinomacelllineHepG-2[J].Cytotechnology,2012,64(1):43.

[6]凌華毓，顧康生．尼妥珠單抗聯(lián)合表阿霉素對人肝癌細胞株HepG2體外生長的影響[J].臨床腫瘤學(xué)雜志，2011，16(2) ：113.

[7]WangB1,Xμnsun,LiuJY,etal.TheeffectofcellcycleandexpressionofcyclinB1andcyclinCproteininhepatocellμlarcarcinomacelllineHhepG2andSMMC-7721aftersilencingβ-cateningene[J].Hepatogastroenterology,2012,59(114):515.

[8]肖廣顯，丁素銀，程英俊，等．索拉非尼聯(lián)合熱療對肝癌HepG-2細胞中Bax，Bcl-2表達的影響[J]．解放軍醫(yī)藥雜志，2011，23(5)：1.

[9]朱開梅，李美波，駱彩珍，等.構(gòu)樹葉總黃酮對人肝癌HepG-2細胞增殖及其細胞周期的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014,20(3):153.

[10]VanGeelenCM,PennarunB,EkWB,etal.Downregulationofactivecaspase8asamechanismofacquiredTRAILresistanceinmismatchrepair-proficientcoloncarcinomacelllines[J].IntJOncol,2010,37(4):1031．

海南省自然科學(xué)基金(SQ2014ZRJJ0136)

1007-4287(2016)08-1325-02

2016-02-18)