楊淑莉，司麗慧，吳　琦，馬語(yǔ)紅，林瑞新

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

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96gp負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞聯(lián)合化療抗耐藥卵巢癌的研究

楊淑莉，司麗慧，吳琦，馬語(yǔ)紅，林瑞新*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130041)

目的探討96gp負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞聯(lián)合化療抗耐藥卵巢癌的效果。方法使用樹(shù)突狀細(xì)胞中的96gp多肽復(fù)合物作為抗原來(lái)刺激樹(shù)突細(xì)胞從而增加抗原遞呈作用，加大對(duì)卵巢癌細(xì)胞的殺傷力，為臨床治療卵巢惡性腫瘤提供依據(jù)。選取一定的人卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)和耐藥卵巢癌細(xì)胞(SKOV3/DDP)，從中提取gp96多肽復(fù)合物，對(duì)其進(jìn)行鑒定，然后使用臍血將樹(shù)突細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)后進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞成熟后將其和gp96相結(jié)合制成gp96-DC復(fù)合物，然后分別將一般DC和載有抗原的DC分別與臍血有核細(xì)胞、人外周血T淋巴細(xì)胞相結(jié)合，比較分析兩者對(duì)卵巢癌細(xì)胞和耐藥卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用效果。結(jié)果gp96為熱休克蛋白，它與DC結(jié)合后的抗原樹(shù)突細(xì)胞對(duì)卵巢癌以及耐藥卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用更大，單純DC對(duì)兩種癌細(xì)胞殺傷力較弱。結(jié)論gp96-DC在卵巢癌細(xì)胞和耐藥卵巢癌細(xì)胞中有很強(qiáng)的殺傷作用，為臨床卵巢癌的治療提供科學(xué)依據(jù)。

熱休克蛋白；gp96-肽復(fù)合物；樹(shù)突狀細(xì)胞；卵巢癌細(xì)胞；耐藥卵巢癌細(xì)胞

(ChinJLabDiagn,2016,20:1267)

卵巢癌在婦科的惡性腫瘤中屬于發(fā)病率較高、較為常見(jiàn)的疾病，5年內(nèi)的生存率僅達(dá)20%-30%[1]。卵巢癌的高死亡率、發(fā)現(xiàn)晚并且預(yù)后差的特點(diǎn)嚴(yán)重危害了廣大女性的身體健康。卵巢癌的發(fā)病率占女性婦科惡性腫瘤疾病的20%左右[2]。死亡率在其他惡性腫瘤中排名第一。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，致癌因素的增加，但具體的發(fā)病原因尚未得到確切的理論認(rèn)證，所以一些學(xué)者將研究熱點(diǎn)轉(zhuǎn)移到從腫瘤組織細(xì)胞中提取一種gp96的多肽物質(zhì)，該物質(zhì)為熱休克蛋白[3]，通過(guò)該抗原提取物和樹(shù)突細(xì)胞結(jié)合參與卵巢癌細(xì)胞的治療當(dāng)中，探討其殺傷癌細(xì)胞的作用效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

本次實(shí)驗(yàn)所用的臍帶血來(lái)自于我院足月分娩的產(chǎn)婦，將臍帶血收集后放入無(wú)菌的真空血袋中，血袋提前加入抗凝劑，密封好后于4℃冰箱里存儲(chǔ)24 h。而實(shí)驗(yàn)所需要的人體卵巢癌細(xì)胞以及耐藥卵巢癌細(xì)胞的樣本來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用層析法提取蛋白質(zhì)所需的試劑來(lái)源于美國(guó)Phamacia公司[4]，電泳試劑來(lái)源于Sigma公司，gp96檢測(cè)所使用的試劑來(lái)源于MBL公司，淋巴細(xì)胞的分離液來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司。

1.2方法

1.2.1從卵巢癌細(xì)胞中提取gp96-肽復(fù)合物(1)將卵巢癌的細(xì)胞株濃度調(diào)為1×109/ ml，使用加熱器加熱至43℃，放置2 h后，再將細(xì)胞株重新加熱至37℃，放置2 h。(2)將加熱后的細(xì)胞株放入超聲細(xì)胞粉碎儀進(jìn)行粉碎，時(shí)間為0.5 h，時(shí)間到后取出細(xì)胞液體備用。(3)將卵巢癌細(xì)胞液離心提取上清液，分別經(jīng)過(guò)0.8、0.65、0.45、0.22 μm這四個(gè)不同直徑的微孔濾膜過(guò)濾，透析、過(guò)夜，換液兩次后分裝備用。(4)裂解后的卵巢癌細(xì)胞株，會(huì)沉淀出硫酸銨，經(jīng)過(guò)鈉鹽的洗脫[5]，再使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度的測(cè)定。

1.2.2 制備gp96-DC復(fù)合物將臍血有核細(xì)胞進(jìn)行分離后加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，2.5 d進(jìn)行一次換液，4d后將DC分為2組：一組為gp96-DC、另一組為無(wú)抗原DC。分別培養(yǎng)，在第3、6、9 d后于顯微鏡下觀察、拍照。比較含有抗原的DC組和不含有抗原的DC組分別對(duì)卵巢癌細(xì)胞以及耐藥卵巢癌細(xì)胞的殺傷作用。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0對(duì)所得資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，兩組比較P<0.05表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1gp96的鑒定

經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳的分析得出，在分子量96 kD有一條清晰的染色帶，經(jīng)過(guò)初步的鑒定該色帶為熱休克蛋白gp96，及從卵巢癌細(xì)胞中提取出來(lái)的物質(zhì)就是熱休克蛋白gp96。

2.2DC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察和DC細(xì)胞表型分析

在顯微鏡下觀察的第3 d，臍血有核細(xì)胞聚集后形成細(xì)胞聚體，一部分細(xì)胞成為聚體后會(huì)變形、拉長(zhǎng)，觀察的第9 d發(fā)現(xiàn)明顯的樹(shù)枝狀凸起的樹(shù)突細(xì)胞，疏松的貼壁生長(zhǎng)或者懸浮生長(zhǎng)，該細(xì)胞鑒定為典型的DC細(xì)胞。流式細(xì)胞儀的作用是鑒定DC培養(yǎng)后的特異性標(biāo)志物，與DC細(xì)胞培養(yǎng)前比較，CD1a、CD83、刺激的分子CD86與MHCⅡ類(lèi)分子HLA-DR的表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度都有很大程度的提高，兩組前后比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

2.3經(jīng)過(guò)激發(fā)的DC對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果

DC經(jīng)過(guò)一定的抗原刺激以后，較之前對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力更強(qiáng)，作用效果更為明顯，詳見(jiàn)表1。

表1　DC激發(fā)臍血有核細(xì)胞體外對(duì)腫瘤的殺傷作用

注：有核細(xì)胞組為對(duì)照組，DC+有核細(xì)胞組與對(duì)照組比較P<0.05；DC+Ag+T細(xì)胞組與對(duì)照組比較P<0.01；DC+Ag+有核細(xì)胞組與DC+有核細(xì)胞組比較P<0.01.

2.4經(jīng)過(guò)DC活化后的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用效果

經(jīng)過(guò)抗原刺激后的DC細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力明顯增加，而經(jīng)過(guò)DC活化后的T細(xì)胞同樣對(duì)腫瘤細(xì)胞有顯著的殺傷力，詳見(jiàn)表2。

3　討論

腫瘤組織中的熱休克蛋白gp96可以激發(fā)抗腫瘤的排斥反應(yīng)，從而開(kāi)始誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的CTL[6]，將腫瘤細(xì)胞殺除。gp96與免疫抗原相結(jié)合成為多肽復(fù)合物后，對(duì)癌細(xì)胞殺傷作用更強(qiáng)。DC屬于抗原提呈細(xì)胞，它的抗原提呈功能最強(qiáng)[7]，在抗原細(xì)胞和免疫應(yīng)答細(xì)胞之間充當(dāng)橋梁的作用，DC分泌細(xì)胞因子、抗原肽小體，根據(jù)需要進(jìn)行體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)。gp96與DC結(jié)合后，大大減少了溶酶體的降解作用，從而保存了gp96的完整性[8]，對(duì)CD8+T細(xì)胞有直接激活作用，gp96在抗原提呈這一過(guò)程中成為關(guān)鍵因素。

臍帶血的有核細(xì)胞經(jīng)過(guò)抗原提呈以后，對(duì)卵巢細(xì)胞和耐藥卵巢細(xì)胞有一定的殺傷作用。DC刺激臍帶血有核細(xì)胞以后，它的殺傷活性更甚[9]，兩組比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而gp96-DC要比單純DC殺傷力更強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以看出，二者對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷作用有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。通過(guò)臍帶血有核細(xì)胞的殺傷效果中可以推斷出卵巢癌患者以及耐藥卵巢癌患者究竟是否可以輸入臍血，是否可以通過(guò)對(duì)帶有熱休克蛋白gp96抗原的DC進(jìn)行刺激來(lái)實(shí)施臨床的免疫法治療卵巢癌患者和耐藥卵巢癌患者。研究顯示[10]，臍帶血有核細(xì)胞可以被體內(nèi)的DC所刺激從而變成有殺傷力的效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行殺除，這一作用機(jī)理尚未得到確切理論說(shuō)明。

表2　經(jīng)過(guò)DC活化后的T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用

注：T細(xì)胞組為對(duì)照組，DC+T細(xì)胞組與對(duì)照組比較P<0.05；DC+Ag+T細(xì)胞組與對(duì)照組比較P<0.01；DC+Ag+T細(xì)胞組與DC+T細(xì)胞組比較P<0.05.

Gp96-肽復(fù)合物致敏的DC能夠活化卵巢癌細(xì)胞外周血的T淋巴細(xì)胞，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生殺傷性。gp96-DC要比單純的DC殺傷效果更好，其原因在于T細(xì)胞活化后可以提高殺傷力[11]，DC還具有激活靶細(xì)胞的能力，這一研究結(jié)果為日后DC疫苗研發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)，針對(duì)長(zhǎng)期化療后耐藥的卵巢癌患者，gp96-DC疫苗的研發(fā)最適合[12]。

綜上所述，gp96-DC比單純DC作用卵巢癌細(xì)胞效果更強(qiáng)、更為有效。免疫治療在卵巢癌細(xì)胞和耐藥卵巢癌細(xì)胞治療上已經(jīng)取得了一定程度的進(jìn)展，它的關(guān)鍵核心在于解決卵巢癌患者耐藥性，gp96-DC疫苗將成為未來(lái)新的課題方向。

[1]楊淑莉,金月梅,付莉,等.負(fù)載gp96多肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞抗耐藥卵巢癌細(xì)胞株作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)婦幼保健,2008,23(33):4759.

[2]張峰琴.以樹(shù)突狀細(xì)胞為介導(dǎo)的卵巢癌特異性免疫治療的實(shí)驗(yàn)研究[D].廣西醫(yī)科大學(xué),2007.

[3]馬薇.臍血樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞株HO-8910免疫治療的體外實(shí)驗(yàn)研究[D].蘭州醫(yī)學(xué)院,2001.

[4]馬靜.樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)抗子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞毒性反應(yīng)的體外研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2007.

[5]葉楓,陳懷增,謝幸,等.卵巢癌細(xì)胞株凍融抗原負(fù)載的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTL抗卵巢癌免疫應(yīng)答的體外研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2004,24(12):964.

[6]李金鳳,張震宇,王淑珍,等.卵巢癌細(xì)胞和臍血樹(shù)突狀細(xì)胞融合瘤苗抗腫瘤免疫效應(yīng)的初步研究[J].中國(guó)腫瘤臨床,2007,34(14):789.

[7]李琳,張震宇,王淑珍,等.臍血樹(shù)突狀細(xì)胞經(jīng)卵巢癌細(xì)胞刺激后抗卵巢癌免疫應(yīng)答的體外研究[J].北京醫(yī)學(xué),2006,28(8):452.

[8]Li QL,Bu N,Yu YC,et al.Exvivo Experiments of Human Ovarian Cancer Ascites-Derived Exosomes Presented by Dendritic Cells Derived from Umbilical Cord Blood for Immunotherapy Treatment[J].Clin Med Oncol,2008,2:461.

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Study of 96gp dendritic cells loaded with chemotherapy resistant ovarian cancer

YANG Shu-li,SI Li-hui,WU Qi,et al.

(TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130041,China)

ObjectiveTo investigate the 96gp pulsed dendritic cells combined with chemotherapy resistant ovarian cancer effect.Methodsuse of dendritic cells in the 96gp peptide complexes as anti the original stimulus dendritic cells and antigen presentation function，increase the lethality of ovarian cancer cells，so as to provide basis for clinical treatment of ovarian malignant tumor.Selection of human ovarian cancer cells SKOV3 and resistant ovarian cancer cells (SKOV3/DDP)，from extraction gp96 peptide complexes，carries on the appraisal，and the use of umbilical cord blood dendritic cells (DC) after induction were cultured，until the mature cells will gp96 and its combination made gp96-DC complex，then the general DC and carrying of dendritic cell (DC) respectively and umbilical cord blood have combination of nuclear cells and human peripheral blood T lymphocytes，a comparative analysis of both on ovarian cancer cells and resistant ovarian cancer cell killing effects.Resultsgp96 heat shock protein，it combined with DC after antigen dendritic cells in ovarian cancer and the killing effect of resistant ovarian cancer cells more，with DC of two cancer cells lethal weak.Conclusiongp96-DC has strong killing effect on ovarian cancer cells and ovarian cancer cells，provide scientific basis for clinical treatment of ovarian cancer.

heat shock protein;gp96- peptide complex;dendritic cells;ovarian cancer;ovarian cancer cells

吉林省衛(wèi)生廳課題(2009Z065)

1007-4287(2016)08-1267-03

R737.31

A

2016-03-15)