王紅月，張　洋，劉　麗，顧春梅

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130031)

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PCI-neo-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)脂多糖刺激的大鼠腎小球系膜細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)的影響

王紅月，張洋，劉麗，顧春梅*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130031)

目的探討PCI-neo-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (PCI-neo-HGF) 對(duì)脂多糖(LPS)刺激的大鼠腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá)是否有抑制作用，以及這種抑制作用是否與對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的抑制有關(guān)。方法體外培養(yǎng)GMCs并分為5組，(1)Ctrl：對(duì)照；(2) C+L：GMCs+ LPS(10 μg/ml)；(3)C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+ PCI-neo(2 μg)；(4)C+L+P-n-H2：GMCs+LPS(10 μg/ml) +PCI- neo-HGF(2 μg)；(5)C+L+P-n-H8：GMCs+ LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(8 μg);用RT-PCR的方法測(cè)定α-SMA及β-actin mRNA的表達(dá),用Western方法檢測(cè)及α-SMA,TGF-β1及β-actin的蛋白表達(dá)。結(jié)果與Ctrl 組相比，C+L及C+L+P-n 組α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)增多(P<0.05)，TGF-β1蛋白表達(dá)增多(P<0.05)；與C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8組α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)均減少(P<0.05)，TGF-β1蛋白的表達(dá)減少(P<0.05)。與C+L組比較，加入TGF-β1抑制劑組α-SMA 蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)CI-neo-HGF可抑制LPS刺激的GMCs的α-SMA 的mRNA及蛋白表達(dá)，且這種抑制作用可能與其對(duì)TGF-β1表達(dá)的抑制有關(guān)。

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子；腎小球系膜細(xì)胞；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

(ChinJLabDiagn,2016,20:1264)

慢性腎臟病是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，在它的進(jìn)展過(guò)程中有很多機(jī)制參與其發(fā)病，如系膜細(xì)胞的過(guò)度增生、細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積[1]等。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)腎臟的保護(hù)作用有很多研究，目前認(rèn)為其可通過(guò)加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解[2]，阻斷小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及促進(jìn)細(xì)胞增殖[3，4]等實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟的保護(hù)作用。目前研究認(rèn)為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)是腎小球性損傷中扮演重要角色。關(guān)于HGF對(duì)腎小球系膜細(xì)胞(GMCs)α-SMA表達(dá)的影響尚不明確，本研究主要探討HGF對(duì)脂多糖(LPS)刺激的大鼠GMC的α-SMA的表達(dá)是否有抑制作用，以及這種抑制作用是否與對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的抑制有關(guān)。

1　材料與方法

1．1大鼠GMC的培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠腎小球系膜細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第4代用于實(shí)驗(yàn)，質(zhì)粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，于轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞備用。LPS在轉(zhuǎn)染之前6小時(shí)加入。TGF-β1抑制劑在加入脂多糖后4小時(shí)加入。

1.2分組將傳代培養(yǎng)的GMC分為如下5組： (1)Ctrl：對(duì)照；(2) C+L：GMCs+ LPS(10 μg/ml)；(3)C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo(2 μg)；(4)C+L+P-n-H2：GMCs+ LPS(10 μg/ml) +PCI-neo-HGF (2 μg)；(5)C+L+P-n-H8：GMCs+ LPS(10 μg/ml)+ PCI-neo-HGF(8 μg)。加入TGF-β1抑制劑后分2組：(1)C+L：GMCs+LPS(10 μg/ml)；(2)C+L+i-T-β1：GMCs+LPS (10 μg/ml)+ TGF-β1抑制劑(8 μg)。

1.3α-SMA mRNA的表達(dá)

采用RT-PCR的方法檢測(cè)，首先提取RNA，合成cDNA，計(jì)算RNA濃度。PCR擴(kuò)增α-SMA基因，β-actin為內(nèi)參。PCR特異性引物及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用Phoretix ID凝膠圖像分析軟件測(cè)定電泳條帶的吸收度，用內(nèi)參校準(zhǔn)。

表1　PCR特異性引物及擴(kuò)增條件

1.4TGF-β1及α-SMA蛋白水平

用Western印記法檢測(cè)。轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解緩沖液，離心，提取總蛋白，測(cè)定蛋白含量電泳、移膜，封閉。加入一抗、二抗室溫孵育1 h。晾干拍照。應(yīng)用ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X線膠片上曝光、顯影和定影。測(cè)定TGF-β1及α-SMA蛋白表達(dá)條帶的灰度值，用β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算比值。

2　結(jié)果

2.1各組 GMC的α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)

48 h時(shí)PCI-neo-HGF對(duì)LPS刺激的GMC的α-SMA 的mRNA表達(dá)及半定量分析(圖1，A、B),蛋白表達(dá)及半定量分析(圖1，C、D)。與Ctrl 組相比，C+L及C+L+P-n 組α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)，C+L及C+L+P-n兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明LPS可刺激GMC α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)，而PCI-neo對(duì)α-SMA的表達(dá)無(wú)影響；與C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8組α-SMA mRNA及蛋白的表達(dá)均減少，說(shuō)明PCI-neo-HGF對(duì)LPS刺激的GMC的α-SMA的表達(dá)有抑制作用，且隨著劑量的增加抑制作用增強(qiáng)。

2.2各組 GMC的TGF-β1蛋白的表達(dá)

48 h時(shí)PCI-neo-HGF對(duì)LPS刺激的GMC的TGF-β1蛋白表達(dá)及半定量分析(圖2)。與Ctrl 組相比，C+L及C+L+P-n 組TGF-β1蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05)，C+L及C+L+P-n兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，說(shuō)明LPS可刺激GMC TGF-β1蛋白的表達(dá)，而PCI-neo對(duì)TGF-β1的表達(dá)無(wú)影響；與C+L相比，C+L+P-n-H2及C+L+P-n-H8組TGF-β1蛋白的表達(dá)均減少，說(shuō)明PCI-neo-HGF對(duì)LPS刺激的GMC的TGF-β1的蛋白表達(dá)有抑制作用，且隨著劑量的增加抑制作用增強(qiáng)。與PCI-neo-HGF對(duì)α-SMA蛋白表達(dá)抑制作用趨勢(shì)一致。

注：A)、B) 各組α-SMA mRNA的表達(dá)(RT-PCR);C)、D)各組α-SMA蛋白的表達(dá)(Western blot)。 與Ctrl組比較，*P<0.05，與C+L組比較，#P<0.05。

圖1LPS刺激后各組α-SMA mRNA及蛋白表達(dá)

注： 與Ctrl組比較，*P<0.05，與C+L組比較，#P<0.05。

2.3TGF-β1抑制劑對(duì)LPS 刺激的GMC α-SMA 表達(dá)的影響

在48 h時(shí)，TGF-β1抑制劑對(duì)LPS 刺激的GMC α-SMA 蛋白表達(dá)及半定量分析(圖3)。與C+L組比較，加入TGF-β1抑制劑組α-SMA 蛋白表達(dá)水平明顯下降。由此得出，TGF-β1抑制劑能抑制LPS刺激的GCM α-SMA的表達(dá)。也就是說(shuō)，LPS誘導(dǎo)后GMC α-SMA表達(dá)的升高與TGF-β1表達(dá)升高有關(guān)。

注：與C+L 組比較 #P<0.05。

3　討論

LPS可刺激腎小球系膜細(xì)胞的增生，且研究認(rèn)為PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的腎小球系膜細(xì)胞的增生，而且這用抑制作用與對(duì)TGF-β1的抑制有關(guān)[5]。

本研究結(jié)果顯示，LPS可刺激GMC的α-SMA 的mRNA及蛋白表達(dá)，而PCI-neo-HGF可抑制LPS刺激的GMC的α-SMA 的mRNA及蛋白表達(dá)，且隨著劑量的增加抑制作用增強(qiáng)。α-SMA誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞活化是基質(zhì)沉積、腎小球硬化性損傷的重要環(huán)節(jié)[6]，由此得出HGF可通過(guò)對(duì)腎小球系膜細(xì)胞α-SMA表達(dá)的抑制而實(shí)現(xiàn)對(duì)腎臟的保護(hù)。我們研究也顯示，PCI-neo-HGF可抑制脂多糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞TGF-β1蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步研究HGF對(duì)α-SMA表達(dá)的抑制是否與其抑制TGF-β1的表達(dá)有關(guān)，我們?cè)贚PS刺激的GMC中加入TGF-β1抑制劑，觀察到α-SMA的表達(dá)明顯下降，由此我們得出，HGF對(duì)LPS刺激的腎小球系膜細(xì)胞α-SMA的抑制作用與其對(duì)TGF-β1表達(dá)的抑制有關(guān)。

[1]Grupp C,Troche I,Klass C,et al.A novel model to study renal myofibroblast formationin vitro[J].Kidney Int,2001,59(2):543.

[2]Dai C,Liu Y.Hepatocyte growth factor antagonizes the profibrotic action of TGF-beta 1 in mesangial cells by stabilizing Smad transcriptional corepressor TGIF[J].J Am SocNephrol,2004,15(6):1402.

[3]Li Y,Yang J,Dai C,et al.Role for integrin-linked kinase inmediating tubular epithelial tomesenchymal transition and renal intersttial fibrogenesis[J].J Clin Invest,2003,112(4):503.

[4]Weidong Wang,Chunling Li,et al.Role of AQP1 in endotoxemia-induced acute kidney injury[J].Am J Physiol Renal Physiol,2008,294:1473.

[5]王紅月，顧春梅，崔明姬.PCI-neo-肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生及對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響[J].中華腎臟病雜志，2011，27(5)：376.

[6]Chunsun Dai,Junwei Yang,Sheldon Bastacky,et al.Intravenous Administration of Hephtocyte Growth Factor Gene Ameliorates Diabetic Nephropathy in Mice[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(10):2637.

The Effects of PCI-neo- HGF on the express of α-SMA in rat glomenrulus mesangial cells stimulated by LPS

WANG Hong-yue，ZHANG Yang，LIU Li，et al.

(DepartmentofNephrology,FirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130031，China)

ObjectiveTo inquire whether PCI-neo-hepatocyte growth factor (HGF) could inhabit the express of α-smooth muscle actin (α-SMA) in rat glomenrulus mesangial cells (GMCs) stimulated by lipopolysaccharide (LPS),and whether this effect was associated with transforming growth factor-β1 (TGF-β1).MethodsGMCs were divided into the following groups:Ctrl:control;C+L:GMCs+ LPS(10 μg/ml);C+L+P-n:GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo(2 μg);C+L+P-n-H2：GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(2 μg);C+L+P-n-H8：GMCs+LPS(10 μg/ml)+PCI-neo-HGF(8 μg).α-SMA and β-actin mRNA expressions were detected by RT-PCR.The protein expressions of α-SMA,β-actin and TGF-β1 were detected by Western.ResultsCompared with Ctrl group,the mRNA and protein expresses of α-SMA increased (P<0.05),and the protein express of TGF-β1 increased(P<0.05)in C+L group and C+L+P-n group.Compared with C+L group,the mRNA and protein expresses of α-SMA increased (P<0.05),and the protein express of TGF-β1 increased(P<0.05)in C+L+P-n-H2 group and C+L+P-n-H8 group.Compared with C+L group,the express of α-SMA protein decreased in adding inhibition of TGF-β1 group(P<0.05).ConclusionPCI-neo-HGF could inhibit mRNA and protein expresses of α-SMA in rat GMCs stimulated by LPS,and this effect maybe was associated with inhibiting TGF-β1.

Hepatocyte growth factor;Glomenrulus mesangial cells; α- smooth muscle actin;transforming growth factor-β1

吉林省衛(wèi)生廳基金(2009ZC041)

1007-4287(2016)08-1264-04

Q51

A

2015-12-21)