宋媛媛，呂　欣，高春時(shí)，王　瑞，張　鵬，任　明，李　波*

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病與統(tǒng)計(jì)教研室，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科)

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銀杏葉提取物對(duì)電離輻射下大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制研究

宋媛媛1，呂欣1，高春時(shí)1，王瑞1，張鵬1，任明2*，李波1*

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 流行病與統(tǒng)計(jì)教研室，吉林 長春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 骨科)

目的探討銀杏葉提取物(EGB)對(duì)輻射引起大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。方法利用全骨髓細(xì)胞貼壁法分離純化BMSCs，取第3代細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，并將其隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組(Control)、輻射對(duì)照組(IR)、輻射加EGB低劑量組(IR+EGBL)、輻射加EGB中劑量組(IR+EGBM)和輻射加EGB高劑量組(IR+EGBH)；分別給予不同的處理因素。采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率，Hoechst熒光染色法檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，利用熒光定量PCR法定量檢測(cè)凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)量，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)凋亡蛋白caspase3的活性。結(jié)果與正常對(duì)照組相比，輻射組和輻射加EGB低、中、高劑量組細(xì)胞存活率均顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Caspase3活性顯著升高(P<0.05)；與輻射對(duì)照組相比，輻射加EGB低、中、高劑量組細(xì)胞存活率均顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bax mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Caspase3活性顯著降低(P<0.05)，均以輻射加EGB中劑量組最顯著。結(jié)論EGB可以拮抗輻射導(dǎo)致的BMSCs細(xì)胞存活率降低，通過caspase3通路減少輻射后BMSCs細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕BMSCs細(xì)胞的輻射損傷。

銀杏葉提取物；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；電離輻射；細(xì)胞凋亡

(ChinJLabDiagn,2016,20:1235)

隨著核能、放射源和射線等在各種行業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，人們?cè)谌粘Ｉ钪性馐茈婋x輻射(Ionizing Radiation,IR)的機(jī)會(huì)越來越大[1,2]。輻射對(duì)人體損傷較大，主要可造成人體的血液、胃腸消化、神經(jīng)和皮膚等一個(gè)或多個(gè)系統(tǒng)損傷，并且與輻射劑量和時(shí)間密切相關(guān)[3]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stemcells,BMSCs) 具有自我更新、旁分泌和多向分化等特性，這些特性可以給為人類細(xì)胞移植或組織器官修復(fù)重建等提供可靠的自體或異體資源[4]。銀杏葉成分復(fù)雜，銀杏葉提取物(Ginkgo biloba L.extract,EGB)具有抗氧化、清除自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、抑制血小板凝聚酶、抗突變、抗衰老、抗癌、抗病毒等多方面的生理活性。有研究表明，EGB可降低受輻射小鼠骨髓細(xì)胞微核出現(xiàn)率和染色體畸變率[5]。本研究通過不同劑量EGB作用于受電離輻射大鼠，探討EGB對(duì)輻射引起大鼠BMSCs損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

出生5-7天Wista大鼠購自吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。銀杏葉提取物購自德國威瑪舒培博士藥廠，L-DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒、Hoechst染色試劑盒和Caspase-3酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司，TRIZOL購自美國Thermo Fisher Scientific公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自上海生工生物工程公司。

1.2大鼠BMSCs原代培養(yǎng)

采用全骨髓細(xì)胞貼壁法分離純化BMSCs。處死Wistar大鼠幼鼠，取出股骨，用L-DMEM培養(yǎng)液將骨髓沖出，制成單細(xì)胞懸液，以1×106ml-1的細(xì)胞密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入含10% FBS的L-DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后換半液，7天后細(xì)胞融合達(dá)80-90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

取第3代大鼠BMSCs細(xì)胞，將其隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組(Control)、輻射(IR)對(duì)照組、輻射加EGB低劑量組(IR+EGBL)、輻射加EGB中劑量組(IR+EGBM)和輻射加EGB高劑量組(IR+EGBH)。Control組不給予處理因素，除Control組外其它四組細(xì)胞均給予5.0 Gy的X射線照射，IR+EGBL組加入EGB至終濃度為100 μg/ml，IR+EGBM組加入EGB至終濃度為200 μg/ml，IR+EGBH組加入EGB至終濃度為400 μg/ml。

1.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將BMSCs細(xì)胞密度調(diào)整為5×104ml-1，每孔100 μl接種于96孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)80-90%時(shí)，于照射前1h輻射加EGB低、中、高劑量組分別加入EGB100 μg/ml、200 μg/ml和400 μg/ml，設(shè)置3復(fù)孔。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK-8，37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)光密度值(OD)。

1.5Hoechst染色

按細(xì)胞凋亡-Hoechst染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，具體步驟如下。

1.5.1吸盡培養(yǎng)液，加入固定液，固定10 min。

1.5.2去固定液，用冷PBS洗2遍，3 min/次。

1.5.3加入Hoechst33258染色液，染色5 min。

1.5.4去染色液，用冷PBS洗2遍，3 min/次。

1.5.5滴加抗熒光猝滅劑封閉

1.5.6采用激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長460 nm，熒光顯微鏡下觀察并拍照

1.5.7計(jì)數(shù)1000個(gè)BMSCs細(xì)胞中發(fā)射凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡百分率。

1.6熒光定量PCR法檢測(cè)Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)

1.6.1總RNA提取：按照Invitrogen TRIZOL試劑說明書進(jìn)行操作，提取細(xì)胞總RNA。

1.6.2cDNA的合成：按照M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書配置反應(yīng)液：取總RNA 1 μg，加入1 μl隨機(jī)引物，用無RNA酶水定容至12 μl，65℃溫浴5 min，冰浴30 s，然后在反應(yīng)液中加入5×Recation Buffer 4 μl、RNase Inhibitor 1 μl、dNTP Mix 2 μl、M-MuLV RT 1 μl，混勻后25℃溫浴10 min，42℃溫浴60 min，70℃加熱10 min。

1.6.3熒光定量PCR：按照2×SG Fast qPCR Master Mix試劑盒說明書配置反應(yīng)液：取cDNA 0.2 μl，加入2×SG Fast qPCR Master Mix 10 μl、上/下游引物各0.4 μl(10 μM each)、雙蒸水定容至20 μl。目的基因Bax、Bcl-2及內(nèi)參基因GAPDH引物序列見表1。反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，反應(yīng)重復(fù)35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳及繪制熔解曲線檢測(cè)其擴(kuò)增效果。反應(yīng)完畢后數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法處理。

表1　目的基因Bax、Bcl-2及內(nèi)參基因GAPDH引物序列

引物序列按5’→3’排序，F(xiàn)：上游引物，R：下游引物

1.7ELISA法檢測(cè)Caspase3活性

按照Caspase3活性測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下。

1.7.1吸取培養(yǎng)液，胰酶消化貼壁細(xì)胞，并收集至備用的細(xì)胞培養(yǎng)液中。

1.7.2600 g 4℃離心5 min，收集細(xì)胞，吸除上清，PBS洗滌。

1.7.3加入50 μl裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min。

1.7.44℃ 20,000 g離心10 min，收集上清液。

1.7.5加入Ac-DEVD-pNA (2 mM)。

1.7.637℃孵育60-120 min。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)，測(cè)定A405。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1CCK-8法檢測(cè)EGB對(duì)電離輻射下BMSCs細(xì)胞存活率的影響

輻射可顯著降低BMSCs細(xì)胞存活率，IR+EGB組細(xì)胞存活率顯著高于IR組，尤其是IR+EGBM組最為明顯(P<0.05)，見圖1。提示EGB對(duì)輻射下的BMSCs細(xì)胞有保護(hù)作用。

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

圖1EGB對(duì)電離輻射下BMSCs細(xì)胞存活率的影響

2.2Hoechst染色法檢測(cè)EGB對(duì)電離輻射下BMSCs細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，BMSCs細(xì)胞在正常狀態(tài)下細(xì)胞核呈圓形，輻射后BMSCs細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)濃集，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光。圖3的結(jié)果表明與Control組相比，IR組、IR+EGBL組、IR+EGBM和IR+EGBH組BMSCs細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，EGB能顯著降低因輻射所致升高的細(xì)胞凋亡率，尤其是IR+EGBM組最為明顯(P<0.05)。

圖2　各組細(xì)胞Hoechst熒光染色圖片(×200)

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

圖3EGB對(duì)電離輻射下BMSCs細(xì)胞凋亡的影響

2.3各組細(xì)胞Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)

如圖4所示，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳呈獨(dú)立、清晰的條帶，長度與設(shè)計(jì)預(yù)期相符合；擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線呈單峰，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物符合設(shè)計(jì)預(yù)期要求。

如圖5所示，與Control組相比，IR組、IR+EGBL組、IR+EGBM和IR+EGBH組BMSCs細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與IR組相比，IR+EGBL組、IR+EGBM和IR+EGBH組BMSCs細(xì)胞抗凋亡基因Bcl-2mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，以IR+EGBM組最顯著。

圖4熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳(A)及熔解曲線(B)

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

2.4各組細(xì)胞Caspase3活性

輻射可激活BMSCs細(xì)胞Caspase3通路，Caspase3活性顯著升高，IR+EGB組細(xì)胞Caspase3活性顯著低于IR組，尤其是IR+EGBM組最為明顯(P<0.05)，見圖6。

3　討論

現(xiàn)今，人們不可避免的生活在各種程度的電離輻射下。而電離輻射不僅可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷[6]，在一次照射一定劑量時(shí)對(duì)人及動(dòng)物也產(chǎn)生損傷，低劑量電離輻射對(duì)植物和動(dòng)物也會(huì)產(chǎn)生一定的刺激作用[7]。

研究發(fā)現(xiàn)，輻射造成的長期骨髓抑制主要依賴殘留的造血干細(xì)胞和BMSCs進(jìn)行恢復(fù)[8,9]。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠BMSCs為研究對(duì)象，用CCK-8法檢測(cè)EGB對(duì)電離輻射下BMSCs細(xì)胞存活率的影響。研究發(fā)現(xiàn)輻射組BMSCs細(xì)胞存活率明顯低于對(duì)照組，BMSCs細(xì)胞凋亡率顯著升高，加入不同劑量EGB可提高電離輻射后的BMSCs細(xì)胞存活率，其中IR+EGBM中劑量組效果最好，顯著降低因輻射所致升高的BMSCs細(xì)胞凋亡率。提示EGB對(duì)BMSCs細(xì)胞存活具有保護(hù)作用。Caspase家族蛋白酶在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，Caspase3是效應(yīng)Caspase分子的重要代表，是凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，被稱為“死亡蛋白酶”，Caspase3被激活后即發(fā)生下游的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使凋亡不可避免[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，沉默Caspase3 可加快BMSCs的生長速度并提高一定條件下其抗凋亡能力[11]。

*:與Control組相比，P<0.05；#:與IR組相比，P<0.05；△:與IR+EGBM組相比，P<0.05

圖6EGB對(duì)電離輻射下BMSCs細(xì)胞Caspase3通路的影響

本研究顯示，電離輻射可激活BMSCs的Caspase3通路，Caspase3活性顯著升高，加入EGB后 Caspase3活性顯著低于IR組，其中EGB中劑量組效果最明顯，提示EGB可以通過作用于Caspase3通路來降低輻射后BMSCs的細(xì)胞凋亡率，為EGB的進(jìn)一步臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

4.1EGB可以拮抗電離輻射造成的BMSCs細(xì)胞存活率降低。

4.2EGB通過caspase 3通路減少輻射后BMSCs細(xì)胞凋亡，進(jìn)而減輕BMSCs細(xì)胞的輻射損傷。

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The protective effects of Ginkgo biloba extract on ionizing radiation-induced rat bone marrow mesenchymal stem cells injury

SONG Yuan-yuan1,LV Xin1,GAO Chun-shi1,et al.

(1.DepartmentofEpidemiologyandBiostatistics,SchoolofPublicHealth,JilinUniversity,Changchun,Jilin130021,China;2.DepartmentofOrthopedics,SecondHospital,JilinUniversity)

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism on radiation-induced rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) damage.MethodsUsing the method of whole bone marrow adherent cells isolated purified BMSCs,3rd passage cells as experimental study,and were randomly divided into five groups,namely normal control group (Control),radiation control group (IR),radiation and EGB low dose group (IR+EGBL),radiation and EGB medium dose group (IR+EGBM) and radiation and EGB high dose group (IR+EGBH),were given different treatment factors respectively.Cell viability was detected Using CCK-8 method,the apoptotic rate was detected by Hoechst Staining,mRNA expression of Bax and Bcl-2 were detected by quantitative real-time PCR and caspase3 activity was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsCompared with normal control group,the cell survival rate of IR,IR+EGBL,IR+EGBM and IR+EGBH group were significantly lower (P<0.05),the apoptosis rate were significantly higher (P<0.05),mRNA expression of antiapoptotic gene Bcl-2 were significantly lower (P<0.05),and mRNA expression of promote apoptosis gene Bax were significantly higher (P<0.05),Caspase3 activity were significantly higher (P<0.05);Compared with the radiation group,the cell survival rate of the IR+EGBL,IR+EGBM and IR+EGBH group were significantly higher (P<0.05),the apoptosis rate were significantly lower (P<0.05),the mRNA expression of Bcl-2 were significantly higher (P<0.05),the mRNA expression of Bax were significantly lower (P<0.05),Caspase3 activity were significantly lower (P<0.05),IR+EGBM group had the most significant change.ConclusionEGB can antagonize the cell viability lowing of BMSCs reduced by radiation,through inhibiting caspase 3 path reducing to BMSCs apoptosis after radiation,thereby reducing radiation damage of BMSCs cells.

Ginkgo biloba extract;Bone marrow mesenchymal stem cells;Ionizing radiation;Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81503531)；吉林省教育廳"十二五"科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字[2015]第536號(hào))；吉林省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目〔2015Q024〕；吉林大學(xué)白求恩計(jì)劃項(xiàng)目(2015404)

1007-4287(2016)08-1235-05

R285.5

A

2016-05-15)