鄭祥韜 戴駒驥 徐東宇 裘益輝 楊法鏡 虞冠鋒

細(xì)胞穿透型HO-1蛋白對(duì)協(xié)調(diào)性異種心臟移植急性排斥反應(yīng)的作用

鄭祥韜 戴駒驥 徐東宇 裘益輝 楊法鏡 虞冠鋒

目的 探討一種新型的細(xì)胞穿膜肽（PTD）整合的血紅素氧合酶-1（HO-1）蛋白對(duì)協(xié)調(diào)性異種心臟移植急性排斥的作用及初步機(jī)制。方法 將C57BL/6小鼠心臟移植至Wistar大鼠頸部，建立協(xié)調(diào)性異種心臟移植模型，將其隨機(jī)分成單純移植組（control）、PTD整合熒光蛋白對(duì)照組（移植術(shù)后腹腔注射PTD-GFP 10mg/d）和PTD-HO-1蛋白治療組（移植術(shù)后腹腔注射PTD-HO-1 1mg/d），觀察移植心臟存活時(shí)間。取移植后48h小鼠心臟，HE染色觀察心臟組織結(jié)構(gòu)，免疫組化染色觀察CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)情況，蛋白印記雜交法測(cè)定心臟移植物HO-1蛋白的表達(dá)。取移植后48 h大鼠血清，ELISA試劑盒檢測(cè)血清免疫復(fù)合物IgM水平及細(xì)胞炎癥因子IL-2和IFN-γ水平。結(jié)果 PTD-HO-1組移植心臟存活時(shí)間（6.17±1.17）d明顯高于單純移植組（2.67±0.52）d和PTD-GFP組（2.83±0.41）d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。移植術(shù)后48 h，PTD-HO-1組移植心臟組織結(jié)果破壞程度較其他兩組輕，CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)情況較其他兩組明顯減輕，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。PTD-HO-1組受體血清IgM、IL-2和IFN-γ水平明顯低于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而心臟移植物組織內(nèi)HO-1表達(dá)水平明顯高于其他兩組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 PTD整合的HO-1蛋白能延長(zhǎng)協(xié)調(diào)性異種移植心臟的存活，為HO-1在異種移植的臨床應(yīng)用提供了可能。

細(xì)胞穿膜肽 血紅素氧合酶-1 協(xié)調(diào)性異種心臟移植 急性排斥

作為治療終末期心臟衰竭患者的唯一有效手段，心臟移植在全世界得到了普遍的發(fā)展［1］。但供體器官來(lái)源的缺乏促使越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始嘗試異種移植的研究，來(lái)進(jìn)一步擴(kuò)大器官供池。在協(xié)調(diào)性異種移植中，移植術(shù)后數(shù)天內(nèi)發(fā)生的急性血管排斥反應(yīng)（acute vascular rejection，AVR）是導(dǎo)致移植失敗的主要原因之一［2］。因此，如何延緩或減輕AVR的發(fā)生成為協(xié)調(diào)性異種移植的關(guān)鍵。在先前的研究中合成了一種新型的細(xì)胞穿透型血紅素氧合酶-1蛋白（protein transduction domain heme oxygenase-1，PTD-HO-1），大量的前期數(shù)據(jù)證明該新型蛋白具備強(qiáng)大的穿透能力和細(xì)胞保護(hù)功能［3］。在本實(shí)驗(yàn)中，作者將該HO-1蛋白用于對(duì)抗協(xié)調(diào)性異種心臟移植的排斥反應(yīng)，并探討其保護(hù)作用的可能機(jī)制，為下一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 （1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性C57BL/6小鼠18只，體重20～25 g，作為供者；Wistar大鼠，體重250～300 g，作為受者，均由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。（2）試劑：PTD-HO-1蛋白和對(duì)照用熒光蛋白（PTD-GFP）由先前研究中生產(chǎn)，保存溫度-80℃。HO-1抗體、CD4和CD8抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Alpco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與心臟移植 （1）分組：將Wistar大鼠隨機(jī)分成A、B、C 3組，每組各6只。A組為空白對(duì)照組（control組），受者僅做單純移植處理；B組為無(wú)關(guān)蛋白對(duì)照組（PTD-GFP組），受者于移植當(dāng)天起腹腔內(nèi)注射PTD-GFP蛋白10mg/d；C組為治療組（PTDHO-1組），受者于移植當(dāng)天起腹腔內(nèi)注射PTD-HO-1蛋白10 mg/d。（2）心臟移植：遵循溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利和倫理的原則，采用二袖套法，將小鼠升主動(dòng)脈和肺動(dòng)脈分別與大鼠的右頸總動(dòng)脈和右頸外靜脈吻合［4］。移植后每天觸摸移植心臟跳動(dòng)情況，以心跳停止作為排斥反應(yīng)的終點(diǎn)。術(shù)后48h收割部分心臟移植物，保存于液氮中。

1.3 病理及血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) （1）組織病理學(xué)：取移植術(shù)后48h心臟移植物冰凍切片直接在熒光顯微鏡下觀察，同時(shí)行HE染色觀察組織病理改變。采用免疫組化ABC法檢測(cè)細(xì)胞和組織中的CD4+和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)，各切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野（×400），記錄陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。（2）血清學(xué)指標(biāo)：移植術(shù)后48h大鼠尾靜脈取血，制備血清，采用ELISA試劑盒對(duì)IgM、IL-2、IFN-γ含量進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。（3）HO-1蛋白測(cè)定：采用蛋白印記雜交法（WB）測(cè)定術(shù)后48 h心臟移植物HO-1蛋白的表達(dá)。以Sigma公司細(xì)胞組織快速裂解液裂解心臟移植物，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，依次孵育HO-1一抗及相應(yīng)二抗，以WB發(fā)光試劑檢測(cè)HO-1表達(dá)量，以蛋白區(qū)帶積分吸光度值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。各組移植心臟生存時(shí)間用Kaplan-Meier方法分析，血清細(xì)胞因子、IgM抗體水平、CD4+和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)采用方差分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組移植心臟的存活時(shí)間 Control組（2.67±0.52）d和PTD-GFP組（2.83±0.41）d 之間移植心臟的存活時(shí)間無(wú)明顯差異（P＞0.05），而PTDHO-1蛋白組（6.17±1.17）d移植心臟的存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 移植心臟病理學(xué)改變 PTD-HO-1蛋白組移植心臟內(nèi)心肌結(jié)構(gòu)基本正常，心肌細(xì)胞輕度腫脹。而其他兩組心肌細(xì)胞嚴(yán)重腫脹變性，部分組織出現(xiàn)溶解壞死，廣泛間質(zhì)出血，血管結(jié)構(gòu)崩解（圖1A，HE染色）。同樣，術(shù)后48h，PTD-HO-1組移植心臟炎癥浸潤(rùn)情況較其他兩組明顯減輕，CD4和CD8陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3/組，P＜0.01，圖1 A～C）。通過(guò)熒光顯微鏡對(duì)PTD-GFP組心臟移植物冰凍切片進(jìn)行觀察，未發(fā)現(xiàn)明顯綠色熒光，結(jié)果顯示PTD整合的熒光蛋白并未穿透進(jìn)入心臟組織。

圖1 移植心臟術(shù)后48h病理學(xué)改變（A：HE染色，CD4和CD8免疫組化，×200。B和C：CD4和CD8陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，各切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野（×400）。與contro1組比較，★P＜0.01；與PTD-GFP組比較，#P＜0.01）

2.3 移植術(shù)后受體血清學(xué)指標(biāo) 心臟移植術(shù)后48h， PTD-HO-1治療組血清IL-2和IFN-γ以及抗體IgM水平明顯低于其他兩組（n=3/組，P＜0.05），而其他兩組之間無(wú)明顯差異（圖2）。

圖2 心臟移植術(shù)后48h受體血清炎癥因子及抗體表達(dá)水平（A：ELISA檢測(cè)血清IL-2水平。B：ELISA檢測(cè)血清IFN-γ水平。C：ELISA檢測(cè)抗體IgM水平。與contro1組比較，★P＜0.05；與PTD-GFP組比較，#P＜0.05）

2.4 移植心臟內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)情況 通過(guò)WB檢測(cè)術(shù)后48h心臟移植物內(nèi)HO-1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PTD-HO-1組的HO-1表達(dá)明顯高于其他兩組（n=3/

圖3 移植心臟術(shù)后48h HO-1蛋白表達(dá)水平。（A：HO-1表達(dá)量以蛋白區(qū)帶積分吸光度值。B：蛋白印跡圖。與contro1組比較，★P＜0.01；與PTD-GFP組比較，#P＜0.01）

3 討論

在心臟移植中，供體的嚴(yán)重不足極大的限制了其發(fā)展。隨著對(duì)排斥反應(yīng)機(jī)理的深入研究，人們對(duì)異種移植（xenotransplantation）的興趣和研究快速升溫［5］。異種移植需要面臨移植后快速出現(xiàn)的兩大免疫學(xué)障礙：超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）和AVR［6］。目前，HAR的發(fā)生機(jī)制已基本研究清楚，近年大量研究工作顯示該免疫學(xué)障礙有望得到突破性發(fā)展［7］。于是AVR逐漸成為異種移植面臨的主要障礙，其特點(diǎn)是開(kāi)始于移植后再灌注的24h內(nèi)，并在數(shù)天破壞移植物，而且傳統(tǒng)免疫抑制劑效果不理想［8］。因此，成功跨越AVR屏障對(duì)于異種移植研究具有重要意義。

HO-1是人體內(nèi)一種重要的應(yīng)激酶，研究證明誘導(dǎo)動(dòng)物體內(nèi)HO-1的過(guò)表達(dá)能起到抗排斥的作用［9］，在已有的異種移植中，HO-1能明顯延長(zhǎng)移植物的生存時(shí)間［10］，但其臨床應(yīng)用卻存在極大的限制。因?yàn)樯袩o(wú)一種試劑能特異性誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，而在利用HO-1的代謝產(chǎn)物CO或膽綠素時(shí)，由于其毒性將其應(yīng)用限制在一個(gè)狹小的治療窗內(nèi)。另外由于HO-1基因治療的不可控性，目前相關(guān)研究仍局限在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。本資料中，作者利用該蛋白對(duì)抗協(xié)調(diào)性異種心臟移植中的AVR，以期利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)為HO-1在抗排斥的臨床應(yīng)用上開(kāi)辟新途徑。

本資料結(jié)果顯示，PTD-HO-1蛋白能有效延長(zhǎng)協(xié)調(diào)性異種移植心臟的存活。根據(jù)各組移植心臟的病理表現(xiàn)，PTD-HO-1治療組T細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯減輕，說(shuō)明PTD-HO-1能明顯抑制排斥中的炎癥反應(yīng)。當(dāng)AVR發(fā)生時(shí)，隨著異種T細(xì)胞的激活，繼而產(chǎn)生IL-2和IFN-r等效應(yīng)細(xì)胞因子。通過(guò)對(duì)各組血中細(xì)胞因子水平的檢測(cè)，較之其他兩組，術(shù)后48 h PTD-HO-1能明顯抑制IL-2和IFN-r水平，表明PTD-HO-1可能通過(guò)抑制T細(xì)胞進(jìn)而抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)血清IgM的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)移植后PTD-HO-1組抗體水平較其他兩組更低，進(jìn)一步證明該新型HO-1蛋白延長(zhǎng)移植心臟存活時(shí)間的作用機(jī)制可能通過(guò)抑制早期體內(nèi)IgM抗體的生成。另外，WB檢測(cè)顯示PTDHO-1組移植心臟內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)水平明顯增高，由于作者是通過(guò)腹腔注射PTD-HO-1，因此其可能生效途徑為PTD-HO-1誘導(dǎo)了供心的HO-1表達(dá)或PTDHO-1蛋白通過(guò)某種途徑到達(dá)移植心臟內(nèi)。在本資料中作者利用PTD-GFP熒光蛋白作為對(duì)照，通過(guò)對(duì)心臟切片的觀察，并未在組織中發(fā)現(xiàn)綠色熒光，因此作者更傾向于認(rèn)為PTD-HO-1通過(guò)影響受體從而誘導(dǎo)移植心臟HO-1表達(dá)的上升。

然而，該研究仍有一定的局限性，首先該新型蛋白的抗AVR機(jī)制并未得到完全的揭示，其次并未觀察不同濃度PTD-HO-1蛋白對(duì)排斥的影響，另外該蛋白的毒副作用也未做進(jìn)一步的觀察。因此，有待更多研究進(jìn)一步驗(yàn)證該蛋白功能。即使本實(shí)驗(yàn)存在眾多的局限，仍驗(yàn)證了一種可行的HO-1應(yīng)用途徑，該新型蛋白能通過(guò)抑制供心T細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制移植受體血清IL-2和IFN-r表達(dá)水平，抑制體內(nèi)抗體IgM產(chǎn)生和促進(jìn)移植心臟HO-1蛋白表達(dá)來(lái)延長(zhǎng)協(xié)調(diào)性異種移植心臟的存活。作為一種可產(chǎn)量化的蛋白制劑，PTD整合型蛋白為HO-1的臨床應(yīng)用提出了新的思路。

1 Bennett LE，Keck BM，Hertz MI，et a1.Wor1dwide thoracic organ transp1antation： a report from the UNOS/ISHLT internationa1 registry for thoracic organ transp1antation.C1in Transp1，1995.35～48.

2 Verheyen J，Vermeu1en T，Janssen Van Doorn K，et a1.Treating humora1 rejection after cardiac transp1antation .Acta Cardio1，2011，66（2）：263～266.

3 Ma J，Lau CK，Tsui TY，et a1.A ce11 penetrating heme oxygenase protein protects heart graft against ischemia/reperfusion injury .Gene Ther，2009，16（3）：320～328.

4 Li C，Qi F，Liu T，et a1.Improved Cuff Technique for Estab1ishing a Mouse-Rat Heterotopic Cardiac Xenotransp1antation Mode1.Transp1ant Proc，2015， 47（6）：2026～2031.

5 Cooper DK， Ekser B， Tector AJ. A brief history of c1inica1 xenotransp1antation. Int J Surg，2015，23（Pt B）：205～210.

6 Byrne GW， McGregor CG.Curr Opin Organ Transp1ant，2012， 17（2）：148～154.

7 De Sa1vatore S，Segreto A，Chiusaro1i A，et a1.Ro1e of xenotransp1antation in cardiac transp1antation .J Card Surg，2015，30（1）：111～116.

8 Samstein B，P1att JL.Physio1ogic and immuno1ogic hurd1es to xenotransp1antation .J Am Soc Nephro1，2001，12（1）：182～193.

9 Edemir B，Kurian SM，Eisenacher M，et a1.Activation of counterregu1atory mechanisms in a rat rena1 acute rejection mode1 .BMC Genomics，2008，9（1）：71.

10 Lee HS，Lee JG，Chung YS，et a1.The introduction of hunman heme oxygenase-1 and so1ub1e tumor necrosis factor-ɑ receptor type I with human IgG1 fc in porcine is1ets pro1ongs is1et xenograft surviva1 in humanized mice .American Journa1 of Transp1ant，2015，1：1～14.

Objective To investigate the inhibitory effect of a novel protein transduction domain（PTD）fused heme oxygenase-1（HO-1）protein on acute rejection of concordant cardiac xenograft，and its preliminary potential mechanism. Methods Stable concordant cervical cardiac xenotransplantation model of C57BL/6 mice to Wistar rats was successfully established. Randomly divided the transplanted rats into three groups：untreated group（control），PTD-GFP treated group（the rats were treated with 10mg/d PTD-GFP by intraperitoneal injection after transplantition）and PTD-HO-1 treated group（the rats were treated with 10mg/d PTD-HO-1 by intraperitoneal injection after transplantition）.The survival time of xenografts were measured and the xenografts were harvested at 48 hours after transplantation. The cardiac tissue structure were observed by haematoxylin-eosin staining. Infiltration of CD4+ T cells and CD8+ T cells in the cardiac xenografts were detected by immunohistochemistry. Expression of HO-1 in the cardiac xenografts was determined by Western blotting.The serum were collected at 48 hours after transplantition.Serum immune complex of IgM and inflammatory cytokines expression including IL-2 and TNF-α were measured by ELISA. Results Compared with the control group （2.67±0.52）d and PTD-GFP treated group（2.83±0.41）d，the survival time of xengrafts in PTD-HO-1 treated group（6.17±1.17）d improved significantly（P＜0.01）. At 48 hours after transplantition，the group treated with PTD-HO-1 exhibited lower degree of damagment in xenogragts tissue structure. And the infiltration of CD4+ T cell and CD8+ T cell in xengrafts were reduced with the treatmet of PTD-HO-1（P＜0.01）. Meanwhile，the group under PTD-HO-1 treatment result in a decrease in serum IgM，IL-2 and TNF-α campared with the other two groups（P＜0.05）. Furthermore，the protein level of HO-1 expression in xengrafts was increased with the treatment of PTD-HO-1 campared with the other two groups（P＜0.01）. Conclusions PTD fused HO-1 protein can significantly prolong concordant cardiac xenograft survival time.Protein transduction technique makes the application of HO-1 in clinical xenotransplantation for possible.

Protein transduction domain Heme oxygenase-1 Concordant cardiac xenograft Acute rejection

浙江省溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140147）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科（鄭祥韜戴駒驥 裘一輝 楊法鏡 虞冠鋒）

20246 德國(guó)漢堡大學(xué)UKE院校（徐東宇）