鄧春浩，茍維超，孫良昱，陳坤明

(西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌　712100)

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不產(chǎn)氧光合細菌分離鑒定及其產(chǎn)氫菌株的快速篩選

鄧春浩，茍維超，孫良昱，陳坤明

(西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌712100)

為建立產(chǎn)氫不產(chǎn)氧光合菌株的快速篩選方法,從采自陜西、河南、安徽3個省8份不同水樣中分離出的不產(chǎn)氧光合細菌，通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、細菌特征峰及16S rDNA鑒定等方法進行初步鑒定獲得不產(chǎn)氧光合細菌，同時利用自制的產(chǎn)氫菌株快速篩選系統(tǒng)對其產(chǎn)氫能力進行檢測，并分析菌液終點氧化還原電位與細胞產(chǎn)氫的關(guān)系。結(jié)果表明：共分離得到31株光合細菌，其中18株沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)、5株莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)、4株球形紅細菌(Rhodobactersphaeroides)和2株固氮紅細菌(Rhodobacterazotoformans)，此外還有2株菌與Rhodobactersp.TCRI 14相似。這些光合細菌的產(chǎn)氫能力存在顯著差異，其中3株產(chǎn)氫性能較高，2株為沼澤紅假單胞菌，1株為球形紅細菌。通過菌液終點氧化還原電位與細胞產(chǎn)氫能力對比，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫較高的菌株其菌液的終點氧化還原電位也明顯較低。

不產(chǎn)氧光合細菌；分離鑒定；產(chǎn)氫；篩選

由于能源緊缺、環(huán)境污染等問題已成為制約社會發(fā)展的重要因素，越來越多的人開始關(guān)注可再生清潔能源，氫氣作為一種重要的清潔可再生能源已逐漸受到廣泛研究。隨著生物制氫技術(shù)的發(fā)展，微生物代謝制氫已顯示其重要的生態(tài)和社會價值，微生物代謝在產(chǎn)氫同時可降解水中各種有機物、亞硝酸鹽及硫化物等，在廢水的無害化處理、污染物的消除等方面具有廣闊的應用前景[1- 2]。目前，生物制氫技術(shù)中一種重要的制氫方法是利用不產(chǎn)氧光合細菌制氫[3-5]，不產(chǎn)氧光合細菌是一類可利用光照為其生長代謝供能的光合微生物，在光合作用中不生成氧氣，可在固氮酶及氫酶催化下產(chǎn)生氫氣，因此不產(chǎn)氧光合細菌產(chǎn)氫方面研究被許多研究者所重視，其中不產(chǎn)氧光合細菌的高效產(chǎn)氫菌株篩選顯得尤為重要[6-8]。然而，由于傳統(tǒng)光合細菌產(chǎn)氫試驗裝置需要通過排水法收集氣體，并利用氣相色譜儀分析氣體組分，因此，此類氫氣檢測裝置結(jié)構(gòu)及操作顯得異常復雜，不利于高效產(chǎn)氫菌株的大規(guī)模篩選。為此本研究從陜西、河南、安徽3個省份8份常年能受到光照的河流或污水水樣中分離的光合細菌，通過形態(tài)學、分子生物學等方法對其進行快速鑒定，同時設(shè)計一套簡易的產(chǎn)氫光合細菌分析裝置，對所分離光合細菌的產(chǎn)氫能力快速篩選，并結(jié)合細菌培養(yǎng)液氧化還原電位分析，對光合細菌產(chǎn)氫機制有更深入了解，為新能源的開發(fā)和光合細菌資源的利用提供重要的支持。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1樣品來源將采自陜西、河南、安徽3個省份常年能受到光照的河流或污水中8份不同水樣用于不產(chǎn)氧光合細菌的分離，采樣地點分別為河南省洛陽市洛河、河南省南陽市白河、陜西省楊凌區(qū)渭河及其支流、陜西省楊凌區(qū)蓮藕田、安徽省蕪湖市長江及青弋江(表1)。

1.1.2培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基[9]：NaCl 2 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NH4Cl 1 g、NaHCO32 g、KH2PO41.75 g、CH3COONa 3 g、酵母粉1 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基：富集培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂粉，pH 6.8～7.2，121 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)氫培養(yǎng)基[6]：CH3COONa 0.3 g， NaHCO30.2 g，谷氨酸鈉0.1 g，K2HPO40.02 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 0.2 g，酵母膏0.1 g，微量元素溶液1 mL，生長因子溶液1 mL，pH 7.0，加蒸餾水至100 mL。微量元素溶液為FeCl3·6 H2O 5 mg、CuSO4· 6H2O 0.05 mg、MnCl2·4H2O 0.05 mg、ZnSO4·7H2O 1 mg、H3BO41 mg、CO( NO3)·6H2O 0.5 mg，加蒸餾水至1 L；生長因子溶液為維生素B1 0.01 mg、尼克酸1 mg、生物素0.01 mg、對氨基苯甲酸0.1 mg，加蒸餾水至100 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2不產(chǎn)氧光合細菌的分離純化

1.2.1不產(chǎn)氧光合細菌的富集將采集得到的水樣及其底泥搖勻，取30～50 mL水樣倒入50 mL無菌錐形瓶中，沉淀4 h以上，去除上清，加入30 mL無菌富集培養(yǎng)基，之后倒入少許無菌液體石蠟封閉液面，并放入光照培養(yǎng)箱(光照度3 000 lx，溫度30 ℃)中培養(yǎng)5～7 d，可見培養(yǎng)基由清變紅。取1 mL富集培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接入新的含有富集培養(yǎng)基及液體石蠟的錐形瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d，并重復此富集2～3次。

1.2.2不產(chǎn)氧光合細菌的分離取1 mL富集產(chǎn)物做10倍梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7中3個稀釋液各100 μL分別涂布于3個分離培養(yǎng)基平板中。將平板倒扣于含有0.5 g焦性沒食子酸及0.5 g無水碳酸鈉混合物的玻璃板上，之后用加熱融化的固體石蠟將平板與玻璃板封合，利用焦性沒食子酸堿性條件下吸氧創(chuàng)造厭氧環(huán)境，將其置于光照培養(yǎng)箱(光照度3 000 lx，溫度30 ℃)中培養(yǎng)7～10 d，可見紅色菌落產(chǎn)生。

1.2.3不產(chǎn)氧光合細菌純化及編號挑取單克隆光合細菌，劃線接種于分離培養(yǎng)基平板上，而后將其放入玻璃干燥器中。事先在玻璃干燥器中放入一支點燃的蠟燭及適量焦性沒食子酸與無水碳酸鈉的混合物，蓋緊蓋子并用凡士林封口，創(chuàng)造無氧或低氧環(huán)境。最后將玻璃干燥器置于光照培養(yǎng)箱中，3 000 lx光照度下30 ℃培養(yǎng)5～7 d。對所純化的菌株按照省份及分離順序編號，從陜西樣品所分離得到的菌株命名為SX1～SXn，從河南樣品所分離得到的菌株命名為HN1～HNn，從安徽樣品中所分離得到的菌株命名為AH1～AHn。

1.3不產(chǎn)氧光合細菌鑒定

1.3.1菌落及細菌形態(tài)觀察在分離培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)菌株，3 000 lx光照度下30 ℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落顏色、大小及形態(tài)等指標。挑取分離培養(yǎng)基上的單克隆于載玻片上，通過革蘭氏染色檢驗細菌特性并用顯微鏡鏡檢。

1.3.2特征吸收峰檢測不產(chǎn)氧光合細菌由于具有光捕獲復合體，因此在800～875 nm處有吸收峰[10-14]，在厭氧光照下，將菌株接種于富集培養(yǎng)基中進行液體純培養(yǎng)，而后取純培養(yǎng)物在Epoch分光光度計里掃描600～900 nm處特征峰。

1.3.3細菌16S rDNA鑒定以菌液為模板，擴增細菌16S rDNA。引物采用細菌16S rDNA鑒定通用引物，正向引物27f:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492r：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′[9]。PCR擴增體系(50 μL)：菌液模板1 μL，引物各2 μL，去離子水20 μL，2×PCR masterTaqMix 25 μL。PCR擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 2 min；35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物電泳檢測得到目的條帶后直接送至金斯瑞公司進行測序。測序結(jié)果用NCBI-Blast在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對(網(wǎng)址：http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)。

1.4不產(chǎn)氧光合細菌產(chǎn)氫能力篩選

1.4.1氫氣檢測系統(tǒng)的設(shè)計氫氣檢測系統(tǒng)包括3部分：氬氣控制裝置(A)、細菌培養(yǎng)及氫氣收集裝置(B)、氫氣檢測器(Ennix GS10-H2)(C)。其中氬氣裝置中包含1個氬氣鋼瓶及氣體流量計，所有連接靠硅膠管相連，細菌培養(yǎng)及氫氣收集系統(tǒng)由1個100 mL血清瓶、插有2個長注射器針頭的橡膠塞及1支1 mL注射器組成。

在培養(yǎng)菌株及收集氫氣時，裝置B靠頂部注射器及無菌注射器軟管保證培養(yǎng)時無雜菌污染，同時將部分氫氣收集在血清瓶中。檢測氫氣時，裝置A與B連接，首先拔去裝置B的注射器，裝置A中由氣體流量計伸出的硅膠管通過一支內(nèi)部裝有無菌棉花的無菌1 mL槍頭與B連接，每測1個樣品，換一支無菌槍頭；裝置B與C靠注射器軟管相連。

1.4.2氫氣檢測流程將待測菌株接種于富集培養(yǎng)基中，待菌株生長至對數(shù)期時，按φ=1%的量接種于含有50 mL產(chǎn)氫培養(yǎng)基的血清瓶中，而后組裝好細菌培養(yǎng)及氫氣收集裝置，將裝置充滿氬氣后放置于光照培養(yǎng)箱中，在30 ℃條件下3 000 lx 光照度培養(yǎng)，每12 h檢測1次氫氣濃度，每個待測菌株做3個重復。檢測氫氣時，首先拔去細菌培養(yǎng)及氫氣收集裝置頂部注射器，而后連接氬氣裝置及氫氣檢測儀，將氣體流量計快速調(diào)至60 mL/min，隨后讀取并記錄氫氣檢測儀中顯示的最大值，最后分離3部分裝置，將細菌培養(yǎng)及氫氣收集裝置重新放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進行下一瓶菌株氫氣檢測。

圖1　氫氣檢測系統(tǒng)及其示意圖

1.4.3培養(yǎng)液終點氧化還原電位測定對產(chǎn)氫測定結(jié)束的菌株，利用氧化還原(ORP)電極(Sartorius pb-10)測定每瓶培養(yǎng)液終點氧化還原電位，記錄數(shù)值。

1.5數(shù)據(jù)處理

分別記錄不同菌株培養(yǎng)瓶中氫氣濃度及培養(yǎng)液終點氧化還原電位，采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理并繪圖。

2　結(jié)果與分析

2.1不產(chǎn)氧光合細菌分離純化

通過富集培養(yǎng)基富集，分離培養(yǎng)基分離純化后，從陜西、河南、安徽8份不同水樣中共分離并純化出31株不產(chǎn)氧光合細菌，菌株分離地點及環(huán)境見表1。根據(jù)其菌落形狀、大小及顏色，主要分為6類。由圖2可以看出，所分離菌株菌落都為圓形，顏色有粉色、紅褐色和黃褐色，菌落大小為1～2 mm和3～5 mm。對所分離菌株進行革蘭氏染色及顯微鏡鏡檢，部分菌株形態(tài)如圖3所示，發(fā)現(xiàn)所有菌株均為革蘭氏陰性菌株(G-)，形態(tài)為球形或長短不等的桿狀。

2.2不產(chǎn)氧光合細菌鑒定

分離出紅色或褐色菌落后，通過革蘭氏染色及顯微鏡檢查所分離菌株均為G-菌株。將菌株接入液體培養(yǎng)基純培養(yǎng)，利用Epoch分光光度計檢測菌液600～900 nm處特征峰，發(fā)現(xiàn)所分離菌株均在800～875 nm處存在不產(chǎn)氧光合細菌光捕獲復合體的特征峰，確定所分離菌株為不產(chǎn)氧光合細菌。最后擴增所分離菌株的16S rDNA并測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，發(fā)現(xiàn)所分離的不產(chǎn)氧光合細菌主要分布在紅細菌屬(Rhodobacter)和假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)2個屬，所有不產(chǎn)氧光合細菌鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，所分離的不產(chǎn)氧光合細菌大部分為紅假單胞菌屬的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，共有18株，有5株莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)，4株球形紅細菌(Rhodobactersphaeroides)，2株固氮紅細菌(Rhodobacterazotoformans)，此外還有2株菌與Rhodobactersp.TCRI 14相似。

表1　不產(chǎn)氧光合細菌分離地點

A.菌落呈圓形，直徑約1～2 mm，菌落為紅褐色Round colony ,1-2 mm in diameter,reddish-brown；B.菌落呈圓形，直徑約3～5 mm，菌落為紅褐色Round colony,3-5 mm in diameter,reddish-brown；C.菌落呈圓形，直徑約1～2 mm，菌落為黃褐色Round colony,1-2 mm in diameter ,tan；D.菌落呈圓形，直徑約1～2 mm，菌落為不透明粉色The colony were round,3-5 mm diameter,pink；E.菌落呈圓形，直徑約2～3 mm，菌落為黃褐色Round colonym,2-3 mm in diameter,tan

圖2不產(chǎn)氧光合細菌菌落形態(tài)

Fig.2 Colonial morphology of anoxygenic photosynthetic bacteria

圖3　不產(chǎn)氧光合細菌革蘭氏染色顯微形態(tài)(1 000×)

2.3不產(chǎn)氧光合細菌產(chǎn)氫性能篩選

利用自制光合細菌產(chǎn)氫系統(tǒng)，檢測所分離的各個菌株產(chǎn)氫能力，每株菌分別做3個重復，每12 h檢測1次細菌培養(yǎng)及收集裝置中氫氣濃度，由于所有菌株均在96 h時測得氫氣濃度最高，以96 h檢測濃度對比不同菌株的產(chǎn)氫能力，結(jié)果見圖4。

由圖4可以看出，相同菌株3個重復之間有良好的重復性，應用此系統(tǒng)可快速方便地分析出不同菌株的產(chǎn)氫能力。共分離出3株產(chǎn)氫較高的菌株，最高氫氣檢測量超過3.0×10-4；6株菌氫氣濃度介于2.0×10-4～3.0×10-4；其余菌株產(chǎn)氫能力較低。產(chǎn)氫較高的3個菌株分別是HN1、HN2、AH3，其中HN1和HN2為沼澤紅假單胞菌，AH3為球形紅細菌。所有分離的菌株中，產(chǎn)氫超過2.0×10-4的菌株有11株，其中9株為沼澤紅假單胞菌，1株球形紅細菌AH7，1株固氮紅細菌(Rhodobacterazotoformans) HN3；所分離的5株莢膜紅細菌產(chǎn)氫均未超過2.0×10-4。

表2　不產(chǎn)氧光合細菌鑒定

注：“+”表示在800～875 nm存在特征峰。

Note:“+” represent that the culture of this bacteria have characteristic peaks at 800-875 nm.

圖4　不產(chǎn)氧光合細菌產(chǎn)氫能力篩選結(jié)果

2.4產(chǎn)氫培養(yǎng)基終點氧化還原電位分析

產(chǎn)氫試驗后，利用ORP來檢測菌液終點氧化還原電位。如圖5所示，不同菌株培養(yǎng)液的氧化還原電位都為負值，但存在較大差異。對比圖4中菌株產(chǎn)氫能力發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氫量高的菌株的培養(yǎng)液明顯具有相對更低的氧化還原電位，而產(chǎn)氫能力低的菌株培養(yǎng)液氧化還原電位相對較高。

圖5　產(chǎn)氫菌株菌液氧化還原電位

3　討 論

本研究利用不產(chǎn)氧光合細菌富集培養(yǎng)基及分離培養(yǎng)基，結(jié)合平板厭氧及干燥器厭氧2種方法，快速地從河南省洛陽市洛河、河南省南陽市白河、陜西省楊凌區(qū)渭河及其支流、陜西省楊凌區(qū)蓮藕田、安徽省蕪湖市長江及青弋江的8份水樣中分離得到31株光合細菌。通過菌落形態(tài)、革蘭氏染色、細菌特征峰分析，快速確定所分離菌株為不產(chǎn)氧光合細菌，結(jié)合16S rDNA鑒定技術(shù)，確定所分離菌株的種屬。通過本研究發(fā)現(xiàn)，不同地域分離出的部分不產(chǎn)氧光合細菌16S rDNA序列完全一致，如HN1及SX9與RhodopseudomonaspalustrisDX-1相似度為100%，HN3及SX11均與Rhodobacterazotoformans strain JCM 9340菌株相似度同樣為100%，但其產(chǎn)氫特性卻差異很大，說明不同環(huán)境下的不產(chǎn)氧光合細菌具有明顯的代謝多樣性，因此從不同環(huán)境中獲得并大規(guī)模篩選產(chǎn)氫菌株是非常必要的。同時本研究對比菌株產(chǎn)氫能力與其環(huán)境(正常水質(zhì)或污水)，發(fā)現(xiàn)二者并無明顯關(guān)系，可能與采集水體樣本不夠豐富有關(guān)。由于不產(chǎn)氧光合細菌代謝多樣性，從不同環(huán)境中篩選得到的不產(chǎn)氧光合細菌產(chǎn)氫特征可能存在較大差異，例如碳源、氮源、金屬離子、pH等因素對不同菌株的影響也不同[15-19]，因此，未來對產(chǎn)氫菌株進行大規(guī)模選育時，可通過調(diào)整培養(yǎng)基成分，以期獲得不同環(huán)境及底物下最適產(chǎn)氫菌株。對具有特定研究意義及價值的菌株，可對其進一步通過生理生化特征、脂肪酸圖譜分析、DNA-DNA雜交特征及特異分子標記信息等方式鑒定[20]，以進一步深入研究其環(huán)境適應及產(chǎn)氫機制。

本研究產(chǎn)氫試驗中，菌株培養(yǎng)時快速氫氣檢測系統(tǒng)氬氣裝置與細菌培養(yǎng)及氫氣收集裝置分離，同時將細菌培養(yǎng)及氫氣收集簡化為單個血清瓶，可同時檢測多個菌株產(chǎn)氫能力，并通過試驗重復減少系統(tǒng)誤差，適合產(chǎn)氫菌株的大規(guī)模篩選。由于此系統(tǒng)細菌培養(yǎng)及氫氣收集裝置在細菌培養(yǎng)時與外界連通，同時需要在檢測氫氣時向其中通入氬氣，因此無法準確測得菌株氫氣產(chǎn)生量。所以在實際應用中，可首先通過該氫氣檢測系統(tǒng)對產(chǎn)氫菌株大規(guī)模篩選，比較其產(chǎn)氫能力差異后，最后利用傳統(tǒng)氫氣檢測裝置對候選菌株的產(chǎn)氫能力及特點進行分析，可明顯提高產(chǎn)氫光合菌株的篩選效率。

本研究在檢測菌株產(chǎn)氫能力的同時，檢測菌液的終點氧化還原電位，通過對比菌株之間產(chǎn)氫趨勢與氧化還原電位趨勢之間的關(guān)系(圖4和圖5)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氫高的菌株培養(yǎng)液終點氧化還原電位更低。由于光合細菌在產(chǎn)氫過程中要消耗大量的電子及還原力[21-22]，試驗結(jié)果也證實菌株產(chǎn)氫能力與菌液氧化還原狀態(tài)有密切聯(lián)系[23]，因此氧化還原狀態(tài)對光合細菌自身氫代謝具有重要的作用。值得注意的是，部分菌株培養(yǎng)液的氧化還原電位明顯低于其他產(chǎn)氫能力相似菌株，如SX7菌株氧化還原電位明顯低于SX1，除了系統(tǒng)誤差外，還可能是該研究所對比的是菌株在84～96 h的產(chǎn)氫能力，而終點氧化還原電位可能與菌液的總產(chǎn)氫量直接相關(guān)。

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Corresponding authorCHEN Kunming,male,Ph.D,professor,doctoral supervisor.Research area:cellular and molecular physiology and regulation of plant stress,photosynthesis and bioenergy.E-mail:kunmingchen@nwsuaf.edu.cn

(責任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

Isolation and Identification of Anoxygenic Photosynthetic Bacteria and Quick Screening of Hydrogen Productive Strains

DENG Chunhao,GOU Weichao,SUN Liangyu and CHEN Kunming

(College of Life Sciences,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

To establish a quick method for screening hydrogen productive anoxygenic photosynthetic bacteria strains at a large scale,8 water samples from 3 provinces were used for bacteria isolation.According to the clonal morphology,gram staining,absorption peak as well as 16s rDNA detection,the anoxygenic photosynthetic bacteria strains were preliminary identified and its hydrogen productive ability detected by a self-made hydrogen detection system were examined and also compared with the redox state of the bacterium solution.The results showed that 31 anoxygenic photosynthetic bacteria strains were isolated and identified and it was classified mainly into 4 categories,of which 18 belonged toRhodopseudomonaspalustris,5Rhodobactercapsulatus,4Rhodobactersphaeroidesand 2Rhodobacterazotoformanstrains,however,there were 2 strains similar withRhodobactersp.TCRI 14.The hydrogen production ability greatly differed among the those strains ,which of them only 3 strains had highly hydrogen productive ability.Two of them wereRhodopseudomonaspalustrisand one belonged toRhodobactersphaeroides.By comparing the redox states with hydrogen production ability,we found that the strains had higher hydrogen production ability were in lower redox state in the bacterium solution.

Anoxygenic photosynthetic bacteria; Isolation and identification; Hydrogen production;Screening

2015-05-28Returned2015-08-28

Program for Surporting New Century Excellent Talents of Ministry of Education of P.R.China (No.NCET-11-0440); the Scientific Research Start-up Fund for the Returned Overseas Chinese Scholars, Ministry of Education of P.R.China.

DENG Chunhao,male，master student.Research area:anoxygenic photosynthetic bacteria and it’s hydrogen production mechanism.E-mail:dchdr@163.com

2015-05-28

2015-08-28

教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-11-0440)；教育部留學回國人員科研啟動費。

鄧春浩，男，碩士研究生，從事光合細菌及其產(chǎn)氫機制研究。E-mail：dchdr@163.com

陳坤明，男，博士，教授，博士生導師，主要從事植物細胞逆境分子生理與調(diào)控及光合作用與生物能源的研究。E-mail：kunmingchen@nwsuaf.edu.cn

Q939.9

A

1004-1389(2016)08-1187-08

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-07-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1104.022.html