高　文，謝從華

(1. 河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南洛陽(yáng)　471003；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，武漢　430070)

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馬鈴薯StRab蛋白序列特征和亞細(xì)胞定位分析

高文1，謝從華2

(1. 河南科技大學(xué) 林學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院，武漢430070)

為進(jìn)一步探索StRab蛋白在脅迫反應(yīng)中的功能及其作用機(jī)制，采用生物信息學(xué)、洋蔥表皮亞細(xì)胞定位等方法進(jìn)行研究。結(jié)果表明，StRab核酸序列為889 bp，其中，編碼區(qū)為612 bp，編碼203個(gè)氨基酸；StRab蛋白為穩(wěn)定、可溶、非分泌的非跨膜蛋白，含有小G蛋白家族的全部序列特征， 且C端存在CAAX 基序。洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)表明，StRab蛋白定位于細(xì)胞膜。說(shuō)明：StRab蛋白是在細(xì)胞膜上發(fā)揮功能的膜附著蛋白，可能對(duì)馬鈴薯脅迫反應(yīng)有重要作用。

馬鈴薯；StRab；生物信息分析；亞細(xì)胞定位

GTP結(jié)合蛋白(GTP-binding proteins)，也稱(chēng)G蛋白，是指可與鳥(niǎo)苷酸可逆結(jié)合的蛋白質(zhì)家族，在細(xì)胞信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用。該蛋白主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)是與膜受體偶合的異三聚體G蛋白，包含α、β和γ 3個(gè)亞基，相對(duì)分子質(zhì)量為100×103左右；另一類(lèi)是存在于細(xì)胞不同部位的小G蛋白，以單體形式存在且相對(duì)分子質(zhì)量較小，一般為20×103～30×103[1]。小G蛋白大量存在于真核生物，因此被稱(chēng)為小G蛋白超級(jí)家族，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特征，又可分為5個(gè)家族，即 Ras家族、Rho家族、Rab家族、Ran家族和Arf家族[2-3]，但目前在植物中尚未發(fā)現(xiàn)Ras家族。

Rab蛋白是小G蛋白超級(jí)家族成員之一，在真核生物中分布很廣且數(shù)量較大，如擬南芥有57個(gè)[4]、水稻有52個(gè)[5]、人類(lèi)有60個(gè)以上[6]、酵母有11個(gè)[1]、秀麗隱桿線蟲(chóng)有29個(gè)[7]、果蠅有26個(gè)[7]， Rab蛋白的大量存在預(yù)示其可能在真核生物細(xì)胞發(fā)揮重要作用。同時(shí)，Rab蛋白除具備小G蛋白的結(jié)構(gòu)特征外，還存在5個(gè)Rab家族特異基序、4個(gè)Rab亞家族特異基序，尤其是C末端存在CCSS基序，其獨(dú)有的結(jié)構(gòu)特征對(duì)其特異性的功能發(fā)揮有重要作用[8]。有研究表明，Rab蛋白可作為分子開(kāi)關(guān)調(diào)控小泡運(yùn)輸?shù)母鞣矫妫缧∨菪纬?、移?dòng)、?？?、與目標(biāo)融合等[9-10]；Rab蛋白還有很多其他方面的功能，如參與植物光和激素反應(yīng)[11-12]、參與不同植物不同部位的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[13-19]及參與多種脅迫反應(yīng)[20-23]等。

本研究供試的StRab蛋白是通過(guò)快速克隆cDNA末端技術(shù)(RACE)從接種晚疫病菌(Phytophthorainfestans)的馬鈴薯水平抗性材料中獲得，其mRNA在GenBank的登錄號(hào)為EF091-876[24]。馬鈴薯是全球重要的糧食作物，其適應(yīng)性強(qiáng)、生育期短、營(yíng)養(yǎng)全面，是解決全球糧食短缺問(wèn)題的重要作物[25]。2016年，中國(guó)啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，預(yù)計(jì)到2020年馬鈴薯種植面積將超過(guò)666萬(wàn)hm2，適宜主食加工的品種種植比例將達(dá)到30%，主食消費(fèi)占馬鈴薯總消費(fèi)量的30%，即馬鈴薯作為糧食產(chǎn)業(yè)的重要性將得到很大提升。但目前晚疫病仍是影響全球馬鈴薯生產(chǎn)的重要病害[26]。在中國(guó)，每年因晚疫病造成的產(chǎn)量損失約10%～15%[25]，因此，提高馬鈴薯品種晚疫病抗性、培育抗病新品種是全球馬鈴薯生產(chǎn)中亟需解決的重要問(wèn)題。以前曾采用RT-qPCR對(duì)超量表達(dá)StRab的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其相對(duì)表達(dá)量遠(yuǎn)高于野生型；結(jié)合Southern雜交分析，選擇單拷貝且表達(dá)量高的株系進(jìn)行表型鑒定，結(jié)果顯示，StRab超表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)晚疫病菌的抗性增強(qiáng)[24]。

為進(jìn)一步了解StRab基因的功能和作用機(jī)理，本研究擬采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)分析StRab氨基酸序列，并采用分子生物學(xué)方法構(gòu)建其與GFP融合的植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌侵染方式轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，研究結(jié)果將為深入分析該基因的功能及其可能的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α；根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404；克隆載體pMD18-T[寶生物工程(大連)有限公司]，其抗性標(biāo)記為氨芐青霉素(Ampr)；具Kanr抗性標(biāo)記的植物表達(dá)載體pBI121。ZEISS ImagerA1熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡ZEISS LSM510 META(德國(guó)，卡爾·蔡司股份公司)。

1.2基因分離

首先，設(shè)計(jì)EST(GenBank登錄號(hào)DR751954)序列的特異引物gR3 (5′-CAGCCTCAAACTCTGCCAAGCCTCC-3′)，然后，根據(jù)SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增。再設(shè)計(jì)引物gR7(5′-CGCGGATCCCGGTAAATCCCTCCGTCAC-3′，帶下劃線的堿基為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，其前面的CGC為保護(hù)堿基。下同)和gR8(5′-GGCGAGCTC- CAAACTTCCCTAATGTTCAATCAG-3′，帶下劃線的堿基為SacⅠ酶切位點(diǎn)，其前面的GGC為保護(hù)堿基。下同)， 并擴(kuò)增獲得StRab基因序列。

1.3生物信息學(xué)分析

通過(guò)ExPASy(http://www.expasy.ch)的ProtParam分析StRab蛋白的相對(duì)分子量和等電點(diǎn)等基本信息；采用TMHMM Server 2.0分析StRab蛋白的可能跨膜區(qū)域位置；采用SingalP 3.0分析StRab蛋白的信號(hào)肽；采用TargetP預(yù)測(cè)StRab蛋白的亞細(xì)胞定位情況；采用NLStrandamus預(yù)測(cè)StRab蛋白的核定位信號(hào)；采用MEGA4.0軟件的Neibor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；采用CD-Search分析StRab蛋白的結(jié)構(gòu)域。通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的BLASTN進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.4融合表達(dá)載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物gR7(5′-CGCGGATCCCGGTAAATCCCTCCGTCAC-3′)、StRab3′-fusion(5′-GTTCTTCTCCTTTACTCATGGATGAGCAA- CAGCCACCA-3′)、gfp5′-fusion(5′-TGGTGGCTGTTGCTCATCCATGAGTAAAGGAGA- AGAAC-3′)、gfp3′(5′-GGCGAGCTCAATTTTGTATAGTTCATCCAT-3′)，結(jié)合重疊延伸法，獲得融合表達(dá)載體pBI121-StRab-gfp。同時(shí)，設(shè)計(jì)引物gfp1(5′-CGCGGATCCATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3′)和gfp2(5′-GGCGAGCTC- AATTTTGTATAGTTCATCCAT-3′)，構(gòu)建陽(yáng)性對(duì)照載體pBI121-gfp。經(jīng)檢驗(yàn)正確后保存。

1.5洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)

將含有目標(biāo)質(zhì)粒(pBI121-stRab-gfp)、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒(pBI121-gfp)、陰性對(duì)照質(zhì)粒(pBI121)的根癌農(nóng)桿菌LBA4404活化，侵染經(jīng)過(guò)預(yù)處理的洋蔥表皮，于MS固體培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)1～2 d(16 h光/8 h暗)。經(jīng)ZEISS ImagerA1熒光顯微鏡進(jìn)行GFP熒光的預(yù)觀察后，再通過(guò)激光共聚焦顯微鏡ZEISS LSM510 META觀察，濾光片為505～550 nm，激發(fā)光為488 nm。

2　結(jié)果與分析

2.1目的基因獲取

通過(guò)RACE擴(kuò)增獲得StRab基因(圖1)，結(jié)果顯示，StRab核苷酸序列為889 bp，其中，編碼區(qū)為612 bp，編碼203個(gè)氨基酸。GenBank登錄號(hào)為EF091876。

2.2StRab蛋白基本信息

對(duì)StRab蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(http://www.expasy.ch/cgi-bin/protparam)，結(jié)果顯示，其分子式為C990H1560N268O312S7，相對(duì)分子質(zhì)量為22.4×103，理論等電點(diǎn)為5.51，水溶液中的消光系數(shù)為24 535 mol·L-1·cm-1，脂肪系數(shù)為82.17，不穩(wěn)定系數(shù)為30.14，平均疏水系數(shù)為-0.268，說(shuō)明StRab蛋白性質(zhì)比較穩(wěn)定。進(jìn)一步通過(guò)ExPASy(http://www.expasy.ch/tools)的SOSUI進(jìn)行疏水性分析顯示，StRab蛋白為可溶性蛋白。而經(jīng)SignalP3.0 和TMHMM Server v2.0軟件分析發(fā)現(xiàn)，StRab蛋白既無(wú)信號(hào)肽也無(wú)跨膜區(qū)域。說(shuō)明：StRab蛋白是穩(wěn)定、可溶、非分泌的非跨膜蛋白質(zhì)。

2.3StRab系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用MEGA4.0軟件分析StRab蛋白與小G蛋白不同家族中的部分氨基酸序列[27]在分類(lèi)和進(jìn)化上的關(guān)系(圖2)，結(jié)果表明，StRab蛋白屬于Rab家族。因此，將馬鈴薯中的Rab蛋白序列命名為StRab(GenBank 序列號(hào)ABK96799)。

實(shí)線表示引物位置，虛線表示基因編碼區(qū)　Solid lines show the position of primers, and dotted lines show coding region of StRab

圖2　小G蛋白的進(jìn)化分析

2.4蛋白序列特征分析

通過(guò)多序列比對(duì)分析(圖3)，獲得StRab蛋白序列特征。結(jié)果表明，該序列具有小G蛋白的一般特征，如保守的GTP/GDP結(jié)合位點(diǎn)G3、G4，GTPase活性位點(diǎn)G1、G2，與下游效應(yīng)子相互作用的位點(diǎn)41、43～45、60、69～70、73、77、79～82、169，及G結(jié)構(gòu)域中的分子開(kāi)關(guān)區(qū)域Ⅰ(33、38～46)和Ⅱ(66、68～78)。同時(shí)，該序列不僅具有Rab家族的具體特征，如RabF1：41～45；RabF2：58～62；RabF3：69～74；RabF4：77～81；RabF5：86～91，還具有Rab亞家族的特征，如RabSF1：7～10；RabSF2：23～34，37～39；RabSF3：112～118；RabSF4：167～172，這些特點(diǎn)對(duì)于鑒別Rab蛋白具有重要作用。另外，在StRab蛋白序列中還發(fā)現(xiàn)鳥(niǎo)苷酸交換因子(GEF)的作用位點(diǎn)38、42～49、56、58，GDP解離抑制劑(GDI)的作用位點(diǎn)41～42、44、62～63、70、72、74～76、79，及Rab護(hù)送蛋白(REP)的作用位點(diǎn)69～81。更重要的是，在StRab蛋白序列C端發(fā)現(xiàn)膜定位信號(hào)，即CCSS基序。通過(guò)ExPASy(http://www.expasy.ch/tools)的PrePS軟件分析顯示，在CCSS基序中的半胱氨酸殘基(C)上可以進(jìn)行異戊二烯化修飾。異戊二烯化修飾在Rab蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位和功能發(fā)揮中有關(guān)鍵作用[28]。

G1～G5. GTP/GDP結(jié)合區(qū)GTP/GDP binding domain；C. 異戊二烯化位點(diǎn)Prenylation loci；RabF. Rab家族特異的基序The motifs of Rab family；LeRab1A (AAA80678)、 NpRab (CAA69701)、CaRab (BAA76422) 和AtRab1C (CAB78756)序列均來(lái)自NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)LeRab1A (AAA80678)、NpRab (CAA69701)、CaRab (BAA76422) and AtRab1C (CAB78756) come from the NCBI database

圖3StRab蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

Fig.3Conservative structure analysis of StRab proteins

2.5StRab亞細(xì)胞定位的軟件預(yù)測(cè)

通過(guò)psort(http://www.psort.org)的PSORT 6.4、SLP-Local等軟件對(duì)StRab進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果不盡相同。其中，PSORT 6.4的預(yù)測(cè)結(jié)果為：細(xì)胞質(zhì)(cytoplasm)；SLP-Local的預(yù)測(cè)結(jié)果為：細(xì)胞核(nucleus)或細(xì)胞溶膠(cytosol)；Plant-mPLoc 和Euk-mPLoc 2.0的預(yù)測(cè)結(jié)果均為：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum)，或高爾基體(Golgi apparatus)，或線粒體(Mitochondrion)，或細(xì)胞核(Nucleus)。那么，StRab究竟位于細(xì)胞何處？為明確StRab亞細(xì)胞定位，本研究通過(guò)洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.6StRab亞細(xì)胞定位的試驗(yàn)分析

洋蔥表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)圖4。觀察非轉(zhuǎn)化的洋蔥材料(圖4-A、圖4-B和圖4-C均為陰性對(duì)照)和由空載體轉(zhuǎn)化的洋蔥材料(圖4-D、圖4-E和圖4-F均為陰性對(duì)照)，在其細(xì)胞內(nèi)未發(fā)現(xiàn)熒光分布，說(shuō)明供試材料不同并不會(huì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果形成干擾，均可使用。觀察經(jīng)pBI121-gfp載體轉(zhuǎn)化的洋蔥材料(圖4-G、圖4-H和圖4-I均為陽(yáng)性對(duì)照)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞內(nèi)有GFP熒光分布，說(shuō)明pBI121-gfp載體和洋蔥材料均不影響GFP表達(dá)，方法可靠可行。觀察經(jīng)pBI121-StRab-gfp載體轉(zhuǎn)化的洋蔥材料(圖4-J、圖4-K和圖4-L)，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞膜或細(xì)胞壁有GFP熒光分布，說(shuō)明StRab蛋白可能定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞壁，再經(jīng)進(jìn)一步質(zhì)壁分離試驗(yàn)(圖4-M、圖4-N和圖4-O)確認(rèn)GFP熒光存在于細(xì)胞膜。說(shuō)明StRab蛋白定位于細(xì)胞膜。

A、D、G、J、M. 明場(chǎng)下照片Bright light vision in left panels；B、E、H、K、N. 暗場(chǎng)下的熒光照片The GFP fluorescence in dark field vision in the middle of panels；C、F、I、L、O. 前2幅圖的合成圖Merged fluorescent signals in right of panels；在每行圖片DEF、GHI、JKL、MNO前是與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)化載體The vectors, before the images DEF, GHI, JKL, MNO, are their corresponding transformation vector；ABC前是空白，表明沒(méi)有使用載體Blank, before the image ABC shows vector they did not use

圖4洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)

Fig.4Onion epidermal cells transient expression assay

3　討 論

不同亞細(xì)胞定位軟件的分析原理不同，分析結(jié)果存在一定差異，并且軟件分析結(jié)果僅為預(yù)測(cè)性結(jié)果，不一定準(zhǔn)確，因此必須通過(guò)試驗(yàn)加以確認(rèn)，如擬南芥的乙烯受體ETR1[29]具有跨膜區(qū)域，與乙烯結(jié)合后可定位于細(xì)胞膜，但軟件分析卻未發(fā)現(xiàn)ETR1的跨膜標(biāo)識(shí)。并且軟件不能確定定位的具體位置，如軟件分析PF40[30]可能定位于膜上，但具體定位于哪種膜，是核膜、細(xì)胞膜，還是葉綠體膜、線粒體膜，或者是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體？尚不能給出明確結(jié)果，必須通過(guò)試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

本研究采用不同的亞細(xì)胞定位軟件對(duì)StRab蛋白進(jìn)行分析，結(jié)果不盡相同。通過(guò)洋蔥表皮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)分析顯示，StRab蛋白定位于細(xì)胞膜。另外，PrePS軟件分析發(fā)現(xiàn)，在StRab蛋白的C末端有1個(gè)轉(zhuǎn)錄后修飾位點(diǎn)CCSS，諸多研究[31-33]認(rèn)為，此位點(diǎn)被修飾后可形成一個(gè)與細(xì)胞膜相連的疏水區(qū)，進(jìn)而將StRab蛋白附著于細(xì)胞膜來(lái)執(zhí)行相關(guān)功能。但StRab蛋白是否通過(guò)CCSS修飾定位于細(xì)胞膜，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞既可采用基因槍法，也可用農(nóng)桿菌侵染法。這2種方法的結(jié)果存在一定差異，如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法定位的表達(dá)蛋白可能較集中，而基因槍法定位的結(jié)果可能較分散。但無(wú)論采用何種方法，均需要通過(guò)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照來(lái)區(qū)別材料自發(fā)熒光與GFP熒光，以免得出錯(cuò)誤結(jié)論。

植物在受到生物或非生物脅迫時(shí)，首先是細(xì)胞膜受到傷害。受傷的細(xì)胞膜可通過(guò)Rab蛋白控制的小泡運(yùn)輸進(jìn)行修復(fù)，從而調(diào)節(jié)或適應(yīng)脅迫[34]。本研究顯示，StRab蛋白定位于細(xì)胞膜，提示其可能參與脅迫產(chǎn)生的胞吞或胞吐作用，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Analysis of StRab Protein Sequence Features and Subcellular Localization

GAO Wen1and XIE Conghua2

(1.College of Forestry,Henan University of Science and Technology,Luoyang Henan 471003,China;2.College of Horticulture and Forestry,Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China)

To further explore the functional mechanism of StRab protein in stress response of potato,the bioinformatics analysis and onion epidermal subcellular location assay were conducted.The results of sequence analysis showed that nucleotide sequence of StRab is 889 bp,which 203 amino acids were encoded in coding region of 612 bp.The StRab was a stable,soluble,non-secretedand non-transmembrane protein.It contained all sequence features of the small GTP-binding protein family,and the C terminal CAAX motif.The StRab was fused with gfp for locating test,the results indicate that StRab is located on the cell membrane.Therefore,the StRab is a membrane attachment protein,and may play an important role in potato stress response.

Potato; StRab; Bioinformatics analysis; Subcellular localization

2016-01-01Returned2016-03-28

The Potato Industry Technology System (No.CARS-10-P06).

GAO Wen,male,Ph.D,lecturer.Research area:mainly engaged in biotechnology and breeding in potato.E-mail:tommoto@163.com

2016-01-01

2016-03-28

國(guó)家馬鈴薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-10-P06)。

高文，男，博士，講師，從事馬鈴薯生物技術(shù)與繁育工作。E-mail：tommoto@163.com

S532；Q81

A

1004-1389(2016)08-1180-07

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-07-14

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160714.1103.018.html