姚漢云，文芳，董新宇

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·論著·

急性腦梗死患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9與頸動脈斑塊及血管內(nèi)皮功能的相關(guān)性

姚漢云1，文芳2，董新宇3

目的：探討血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達(dá)與急性腦梗死（ACI）頸動脈斑塊及血管內(nèi)皮功能的相關(guān)性。方法：ACI患者126例，經(jīng)頸動脈行彩超診斷分為無斑塊（NCP）組40例、穩(wěn)定斑塊（SCP）組44例及不穩(wěn)定斑塊（UCP）組42例，采用ELISA測定血清中MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），采用流式細(xì)胞儀檢測血漿中內(nèi)皮顆粒，RT-PCR測定MMP-9 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)，Logistic回歸分析MMP-9與血管內(nèi)皮功能相關(guān)性。結(jié)果：ACI患者在住院后第2天和第15天的血清中MMP-9、TIMP-1、VEGF均呈現(xiàn)不同程度的升高，其中SCP組、UCP組的MMP-9、TIMP-1、VEGF與NCP組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；NCP組中CD31+/CD42－陽性率為12.34%，SCP組、UCP組分別為28.22%、43.17%，與NCP組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SCP組與UCP組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；UCP組的MMP-9 mRNA、VEGF mRNA均明顯高于NCP組、SCP組。結(jié)論：腦梗死患者M(jìn)MP-9的表達(dá)與VEGF表達(dá)呈現(xiàn)協(xié)同關(guān)系，其表達(dá)量隨著腦梗死患者頸動脈斑塊的不穩(wěn)定性增加出現(xiàn)明顯的升高趨勢，其表達(dá)量與內(nèi)皮細(xì)胞受損程度呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。

血清基質(zhì)金屬蛋白酶-9；急性腦梗死；頸動脈斑塊；血管內(nèi)皮

動脈粥樣硬化是引起腦梗死、冠心病的病變發(fā)生基礎(chǔ)，動脈粥樣硬化形成的斑塊引起頸動脈狹窄，斑塊破裂是引起腦梗死的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。不穩(wěn)定斑塊（unstable carotid plaque，UCP）會隨著血液流經(jīng)心腦血管，引起栓塞，從而引起心肌梗死或者腦梗死。目前，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)粥樣硬化斑塊的破裂與基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達(dá)增多有密切關(guān)系[2]，UCP中MMP-9高表達(dá)會刺激血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）高表達(dá)，進(jìn)而引起斑塊出現(xiàn)纖溶，導(dǎo)致斑塊松動、破裂。我院發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化導(dǎo)致的腦梗死患者血清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)異常。但是，動脈粥樣硬化發(fā)展不同階段與MMP-9表達(dá)的相關(guān)性，MMP-9在腦梗死患者發(fā)展的不同階段與血管內(nèi)皮功能的關(guān)系目前報(bào)道較少。本研究旨在探討MMP-9在腦梗死患者發(fā)展的不同階段與血管內(nèi)皮功能的關(guān)系，報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2012年4月至2013年7月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）患者126例，均符合衛(wèi)生部制定的《中國腦血管病防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，男71例，女55例；年齡47～78歲，平均（64.2±8.9）歲。所有患者根據(jù)頸動脈彩超結(jié)果分為3組：①無斑塊（no carotid plaque，NCP）組40例，男23例，女17例；平均年齡（64.1±9.1）歲；腦梗死體積（9.23±3.36）cm3；②穩(wěn)定斑塊（stable carotid plaque，SCP）組44例，男25例，女19例；平均年齡（65.4± 8.9）歲；腦梗死體積（9.37±3.41）cm3；③UCP組42例，男23例，女19例；平均年齡（65.9±10.6）歲；腦梗死體積（9.47±3.69）cm3。各組腦梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。另外選取來院經(jīng)體檢合格的患者39例為對照組，男22例，女17例；平均年齡（66.2±10.5）歲，無頸動脈內(nèi)膜增厚，血液指標(biāo)檢測均正常。受試者入院后均進(jìn)行空腹血糖、血脂、頸動脈彩超及肝腎功能檢測，且簽訂知情協(xié)議書。4組年齡、性別方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2方法

1.2.1頸動脈超聲檢查[4]采用GE Ultrasound Vivid 8型彩色多普勒超聲儀檢查患者頸總動脈雙側(cè)、分叉部位以及頸內(nèi)動脈等，分析判斷頸動脈有無斑塊以及斑塊性質(zhì)。測量標(biāo)準(zhǔn)：①測量頸動脈內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness，IMT），IMT<1.0 mm為正常，IMT 為1.0～1.5 mm為增厚，IMT≥1.5 mm為斑塊形成；綜合考慮殘余管徑、血流速度、頻譜形態(tài)、彩色血流情況等評估狹窄率；②根據(jù)斑塊回聲強(qiáng)度及病理學(xué)檢測分析斑塊性質(zhì)：脂質(zhì)型軟斑塊、纖維型斑塊、鈣化型硬斑塊及潰瘍型斑塊4種，其中纖維型斑塊、鈣化型硬斑塊為SCP，脂質(zhì)型軟斑塊與潰瘍型斑塊為UCP。

1.2.2樣本采集和處理 受試者在入院后次日清晨及15 d后清晨空腹取肘靜脈血3 mL，在無菌離心管中以2 000 r/min離心30 min，收集血清，保存于－70℃冰箱中待檢。

1.2.3血清中相關(guān)因子檢測 采用ELISA法檢測血清中MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）及VEGF，操作方法嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.2.4血漿內(nèi)皮微顆粒（endothelial microparticles，EMP）檢測 受試者在入院后次日清晨及15 d后清晨空腹另取肘靜脈血3 mL置于真空EDTA-K2抗凝管中，以1 000r/min離心獲取富血小板血漿，然后以1 800r/min離心7 min獲取血小板貧瘠血漿。取其中50 μL血小板貧瘠血漿，加入特異性熒光抗體（CD31＋/CD42－），在室溫下孵育30 min后，加入1 mL及5 μL Flow-CountTM熒光微球即上流式細(xì)胞儀待測。收集6 000個(gè)顆粒后停止計(jì)數(shù)，獲得EMP的所占百分含量。

1.2.5熒光定量 PCR測定 MMP-9 mRNA、VEGF mRNA ①血漿中總RNA提?。簩CI患者各取200 μL血漿，加入10 μL的Proteinase K消化液進(jìn)行消化，然后按照Trizol LS試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)操作，使用NanoDrop 1000檢測血漿中總RNA的濃度。②MMP-9 mRNA、VEGF mRNA測定：將所提總RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳確定有無降解。采用紫外分光光度計(jì)檢測吸光度值，以此為RNA含量。RT條件為：37℃孵育1.5 h，95℃進(jìn)行5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳和拍照，采用光密度掃描儀進(jìn)行掃描，以GAPDH的光密度值作為參照，計(jì)算MMP-9 mRNA、VEGF mRNA光密度值與其對比所得相對值。引物序列：MMP-9正向 引物為 5'-GCGGATCCAGCGCCCAGAGAGACAC-3'，MMP-9反向引物為5'-TTAAGTTCCACTCCGGGCAGGATT-3'；VEGF正向引物為5'-AAGATCCGCAGACGTGTAAATGTT-3'，VEGF反向引物為5'-CGGCTTGTCACATGCAAGTA-3'；NAPDH正向引物為5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，NAPDH反向引物為5'-GCCGATAGTGATGACCTGACCGT-3'。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包及ImageJ4.2對數(shù)據(jù)及圖片進(jìn)行處理；對計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)量結(jié)果以（）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1病歷資料比較

ACI患者與對照組在收縮壓、舒張壓、年齡及空腹血糖等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），體質(zhì)指數(shù)及血脂相關(guān)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1　各組臨床資料比較（）

表1　各組臨床資料比較（）

注：與對照組比較，①P<0.05；與NCP組比較，②P<0.05

組別 例數(shù)　收縮壓/mmHg舒張壓/mmHg 體質(zhì)指數(shù)/ (kg/m2)空腹血糖/ (mmol/L)對照組　39　124.8±10.3　78.1±7.9　22.4±4.8　4.7±1.1　1.2±0.4　1.7±0.4　5.0±1.2 NCP組　40　126.7±11.5　82.7±9.7　24.3±5.3　5.1±1.1　2.2±0.5　1.5±0.4　5.3±1.4 SCP組　44　129.8±10.3　85.7±10.1　26.9±4.7①　5.2±1.2　2.2±0.5　1.4±0.3　5.1±1.7 UCP組　42　130.5±10.3　83.9±10.6　25.1±4.8①　5.7±1.3①　2.9±0.7①②　1.7±0.3　5.2±1.4總膽固醇/ (mmol/L)甘油三酯/ (mmol/L)高密度脂蛋白/(mmol/L)

2.2血清中相關(guān)因子檢測結(jié)果比較

ACI患者在住院后第2天清晨的血清中MMP-9、TIMP-1、VEGF均不同程度升高，其中SCP組、UCP組與對照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），UCP組的MMP-9、TIMP-1、VEGF與NCP組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；15 d后，上述指標(biāo)均有所下降，SCP組及UCP組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），見表2。

2.3血漿EMP結(jié)果分析

NCP組中CD31+/CD42-陽性率為12.34%，SCP組、UCP組分別為28.22%、43.17%，與NCP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；SCP組與UCP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖1。

2.4血漿中MMP-9 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)情況

UCP組血漿中VEGF-mRNA水平最高，其次為SCP組，NCP組最低，SCP組、UCP組血漿中VEGF-mRNA高于NCP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；UCP組患者的MMP-9 mRNA水平最高，其次為NCP組，SCP組最低，SCP組與NCP組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），NCP組與UCP組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.5MMP-9與血管內(nèi)皮功能相關(guān)性

ACI患者M(jìn)MP-9與VEGF呈正相關(guān)（SCP組：r= 0.786，P=0.000；UCP組：r=0.986，P=0.000）；與TIMP-1呈正相關(guān)（SCP組：r=0.751，P=0.000；UCP組：r=0.901，P=0.000）；與EMP表達(dá)率呈正相關(guān)（SCP組：r=0.867，P=0.000；UCP組：r=0.948，P=0.000）。

表2　各組MMP-9、TIMP-1、VEGF比較（）

表2　各組MMP-9、TIMP-1、VEGF比較（）

注：與對照組比較，①P<0.05；與NCP組比較，②P<0.05；與SCP組比較，③P<0.05

圖1　流式細(xì)胞術(shù)檢測ACI患者血漿EMP結(jié)果

圖2　RT-PCR檢測血漿中MMP-9 mRNA、VEGF mRNA（A）和統(tǒng)計(jì)結(jié)果（B）

3　討論

心腦血管病的病因病理是目前研究的熱點(diǎn)，其中動脈粥樣硬化斑塊的形成及其穩(wěn)定性的影響因素越來越受到眾多學(xué)者的重視[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，入院的126例ACI患者中有86例（68.5%）出現(xiàn)頸動脈斑塊，其中不穩(wěn)定斑塊42例（33.3%），這提示，頸動脈斑塊在動脈粥樣硬化引起的腦梗死或缺血性腦血管病中起重要作用，因此在臨床上檢測動脈粥樣硬化患者頸動脈斑塊的形成及破裂有重要的意義。MMPs是一種鋅離子依賴性的蛋白酶超家族，在降解心腦血管系統(tǒng)的細(xì)胞外基質(zhì)中起重要作用，可被體內(nèi)多種細(xì)胞分泌，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞等[6]。MMP-9也被稱為明膠酶B，主要參與血管新生、炎癥反應(yīng)及多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等[7]。有研究證實(shí)，冠脈旋切術(shù)斑塊中MMP-9呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，尤其在不穩(wěn)定型心絞痛患者斑塊中的表達(dá)率更高[8]。本研究采用ELISA測定血清中MMP-9的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，住院后48 h內(nèi)，對照組中該蛋白的表達(dá)量明顯低于ACI患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；UCP組其表達(dá)量明顯高于NCP組及SCP組?；颊咴谌朐?5 d后，MMP-9的表達(dá)量降低，這一結(jié)果尚未能做出更好解釋，但ACI患者血清中MMP-9的表達(dá)仍高于對照組。這提示，MMP-9在隨著動脈粥樣硬化的發(fā)展期表達(dá)量呈升高趨勢，這也印證了動脈粥樣硬化斑塊的性質(zhì)越不穩(wěn)定，發(fā)生腦梗死的可能性將越大。

基質(zhì)金屬蛋白酶組織-抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是MMPs家族中內(nèi)源性特異性抑制因子，當(dāng)MMP-TIMP以復(fù)合體的形式結(jié)合后，將阻斷MMPs與底物的結(jié)合，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解[9]。TIMP-1是MMP-9、MMP-1特異性結(jié)合的糖基化蛋白[10]。本研究顯示不穩(wěn)定頸動脈斑塊中MMP-9、TIMP-1及MMP-9/TIMP-1比值明顯增加，與既往的報(bào)道基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)UCP組血清中TIMP-1相對于NCP、SCP組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而NCP組和SCP組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示TIMP-1的急劇增加是不穩(wěn)定斑塊破裂的原因所在。

VEGF是重要的促血管新生因子，通過與內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管形成等[11]。研究顯示，在動脈粥樣硬化等多種疾病中，VEGF參與病理性的血管新生，在不穩(wěn)定頸動脈斑塊中VEGF染色陽性細(xì)胞數(shù)目表達(dá)量增多[12]，因此，目前有學(xué)者認(rèn)為斑塊處新生血管的增多是導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)甚至破裂的原因[13,14]。有研究顯示缺氧及炎性反應(yīng)是促進(jìn)斑塊內(nèi)VEGF表達(dá)的主要原因，MMP-9、MMP-1在炎性反應(yīng)中起重要作用[15,16]。本研究通過RT-PCR分析血漿中MMP-9 mRNA、VEGF mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)UCP組血漿中兩者的表達(dá)量明顯高于SCP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Logistic分析發(fā)現(xiàn)，MMP-9的表達(dá)與VEGF的表達(dá)呈正相關(guān)。這提示，腦梗死患者頸動脈斑塊的不穩(wěn)甚至破裂與MMP-9和VEGF協(xié)同作用有關(guān)。EMP是直接反映血管內(nèi)皮受損的標(biāo)志，其在多種疾病，如動脈粥樣硬化、全身炎癥反應(yīng)綜合征、糖尿病等表達(dá)均明顯增高。本研究顯示，UCP組EMP CD31+/CD42－表達(dá)明顯高于SCP組。本研究未采集對照組血漿行流式細(xì)胞術(shù)和RT-PCR檢測，因此有一定欠缺。

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（本文編輯：王晶）

Correlation of Serum Matrix Metalloproteinase-9 and Carotid Artery Plaques and Endothelial Function in Acute Cerebral Infarction Patients

YAO Han-yun1,WEN Fang2,DONG Xin-yu3.1.Department of Neurology,Wuhan No.1 Hospital,Wuhan 430022,China;2.Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China;3.Wuhan University Hospital,Wuhan 430072,China

AbstractObjective:To investigate the correlation of serum matrix metalloproteinase-9(MMP-9)expression with carotid plaques and vascular endothelial function in acute cerebral infarction(ACI)patients.Methods:One hundred and twenty-six ACI patients diagnosed by the carotid artery ultrasound were divided into Groups No-plaque(NCP,n=40),Stable-plaque(SCP,n=44),and Unstable-plaque(UCP,n=42).ELISA was used to detect serum MMP-9,tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1),and vascular endothelial growth factor(VEGF). Endothelial plasma particles were measured by flow cytometry.And the expressions of MMP-9 mRNA, VEGF-mRNA were detected by RT-PCR.The correlation of MMP-9 with vascular endothelial function was analyzed byLogisticregression.Results:The serum MMP-9,TIMP-1,VEGF expressions were increased in ACI patients on days 2 and 15 after hospitalization.Compared with the NCP group,the levels of MMP-9,TIMP-1,and VEGF in the groups SCP and UCP were significantly different(P<0.05).The positive rate of CD31+/CD42-was 12.34%in the NCP group,while 28.22%in the SCP group,43.17%in the UCP group(P<0.05).with a significant difference between the SCP group and the UCP group(P<0.05).The expressions of MMP-9 mRNA,VEGF mRNA in the UCP group were significantly higher than those in the groups NCP and SCP.Conclusion:The expressions of MMP-9 in the ACI patients correlate with VEGF expression,which are up-regulated with the increased instability of carotid artery plaques in patients with cerebral infarction.The expressions of MMP-9 correlate with the damage of endothelial cells.

serum matrix metalloproteinase-9;acute cerebral infarction;carotid plaque;vascular endothelial

R741;R741.02

A

10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.01.006

1.武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

武漢430022

2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

武漢430060

3.武漢大學(xué)醫(yī)院

武漢430072

2014-07-09

姚漢云

hbyan1979@126. com