宋玉萍,梁金鐘,王風青，梅劍秋

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

?

高分子聚合物γ-PGA對長雙歧桿菌的凍干保護作用

宋玉萍,梁金鐘*,王風青，梅劍秋

(哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院,黑龍江省高校食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076)

以長雙歧桿菌為實驗菌株,以高分子聚合物γ-PGA為主要保護劑進行凍干實驗。通過對凍干菌粉的存活率、發(fā)酵產酸能力,凍干菌粉和反復凍融3次后菌體形態(tài)的微觀變化進行研究。結果表明:用10%脫脂乳粉作為保護劑菌體存活率為47.3%,以2.5%γ-PGA為保護劑菌體存活率為54.8%。以10%脫脂乳粉和1.5%γ-PGA作為保護劑其存活率為79.8%,復合保護劑比10%脫脂乳粉單一保護劑存活率高25.0%左右。電鏡觀察采用復合保護劑菌體外層形態(tài)呈致密包裹結構,凍融3次后菌體形態(tài)完整,細胞結構未見嚴重損傷和變形,復水后作為菌種進行發(fā)酵,18 h時的酸度達到65.5°T,室溫貯藏90 d存活率仍能達到48.7%。

γ-PGA,冷凍干燥,長雙歧桿菌,凍干保護劑

γ-PGA(poly-γ-glutamic acid,γ-聚谷氨酸)是一種由微生物發(fā)酵合成的氨基酸高分子線型均聚物,由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基聚合而成[1],γ-PGA主鏈由酰胺鍵鏈接,且存在大量游離的親水性羧基[2],在分子內部或分子之間可形成大量氫鍵。由于γ-PGA特殊的分子結構賦予其具有極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、粘結性、懸浮性、增粘性、保濕性、極強吸水性、可食用性和可生物降解性[3],且具有極佳的抗冷凍性能[4]。雙歧桿菌是人類的腸道益生菌,具有多種生物學功能,能通過糖酵解產生大量有機酸,降低腸道環(huán)境的pH,可有效抑制腸道中腐敗菌和有害菌的生長繁殖[5],對人體健康有利。因此,近年來益生菌產品廣受人們青睞,但雙歧桿菌在凍干生產中細胞極易損傷而失活,在貯存期間其活性保持也較困難[6]。為提高益生菌凍干菌粉的存活率,需添加適當的凍干保護劑使菌體細胞免受凍干的損害。本文的目的就是研究不同濃度的γ-PGA及γ-PGA與脫脂乳粉作為復合凍干保護劑,研究γ-PGA在冷凍干燥過程中對雙歧桿菌存活率的影響,并對其作用機理進行分析探討。目前γ-PGA尚未被用于益生菌的凍干保護。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

PBS緩沖溶液:準確稱取NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、KH2PO40.24 g、Na2HPO4·12H2O 0.3628 g溶于800 mL蒸餾水中,用鹽酸調節(jié)pH為7.4,然后用蒸餾水定容至1000 mL,高壓滅菌后室溫保存。

混合鹽溶液:CaCl20.20 g/L、KH2PO41.00 g/L、K2HPO41.00 g/L、MgSO40.48 g/L、NaHCO310.00 g/L、NaCl 2.00 g/L。

γ-PGA純品由哈爾濱商業(yè)大學發(fā)酵自制;脫脂乳粉完達山乳業(yè)有限公司;半胱氨酸(L-Cysteine)(分析純)美國Amresco公司。

長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)由哈爾濱商業(yè)大學發(fā)酵學科組耐氧馴化培養(yǎng)得到。

菌體的活化、培養(yǎng)及保藏培養(yǎng)基(TPY培養(yǎng)基):酪蛋白胨12.0 g/L、胰蛋白胨3.0 g/L、大豆蛋白胨3.0 g/L、葡萄糖5.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、吐溫80 1.0 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、混合鹽溶液10.0 mL/L。500 mL三角瓶裝液量300 mL,121 ℃高壓滅菌20 min。

L535-1低速離心機湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司;FD5系列凍干機SIM西蒙國際儀器有限公司;DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司;超低溫保存箱Haier BIO-MEDICAL;SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;BS224S電子臺秤賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1活菌粉的制備工藝活化菌種→液體培養(yǎng)→菌體收集→PBS洗滌→離心收集→細胞懸浮液(添加凍干保護溶液)→布盤→冷凍干燥→凍干菌粉

1.2.2菌體的培養(yǎng)、收集以及細胞懸浮液的制備將活化的長雙歧桿菌以2%的接種量接種于5000 mL TPY液體培養(yǎng)基,37 ℃靜止培養(yǎng)36 h,3500 r/min離心20 min棄上清,將得到的菌體沉淀用PBS緩沖溶液洗滌2次。將離心得到的菌泥懸浮于100 mL的PBS緩沖溶液中。凍干前先進行厭氧活菌計數。

冷凍干燥:取10 mL的菌懸液于大平皿中,分別加入不同配方的保護劑溶液,用PBS定容至60 mL,使大平皿中保護劑的濃度為目標配方最終濃度。將樣品放置于4 ℃冰箱中預冷2 h,然后放入-70 ℃冰箱中冷凍24 h,最后在真空度為3～15 mb的條件下干燥約48 h左右,待樣品恢復至室溫取出。

儲存:將制得的菌粉立即轉入塑封袋中,抽真空塑封以隔絕空氣并防止水分變化,室溫放置每隔一段時間取出測活菌數。

1.2.3存活率的計算細胞懸浮液活菌數測定:每個厭氧管中加入5 mL的TPY固體培養(yǎng)基后充入氮氣封裝,121 ℃高壓滅菌20 min,在水浴鍋中維持溫度在65 ℃,注入0.5 mL稀釋適當倍數的菌液,在冰水浴中滾管,使固體培養(yǎng)基均勻凝固在厭氧管管壁上。37 ℃培養(yǎng)72 h,計厭氧管壁的菌落數。

凍干菌粉活菌數的測定:將制得的凍干菌粉加入含玻璃珠的100 mL無菌的PBS緩沖溶液中復水2 h后搖勻進行厭氧活菌數的測定。

式中:n1為10 mL原有長雙歧桿菌菌懸液的活菌數;n2為菌粉復水后活菌數。

1.2.4電鏡樣品的制備將復水菌懸液離心得到菌泥,加入2.5% pH7.2戊二醛并置于4 ℃冰箱中固定1.5 h,用磷酸緩沖溶液沖洗2次后用50%、70%、90%乙醇脫水各一次,100%乙醇脫水2次,100%乙醇與叔丁醇1∶1、純叔丁醇各置換一次,每個操作間隔15 min。然后將樣品放入-20 ℃冰箱中冷凍30 min再放入凍干機中干燥,大約4 h。將得到的干粉用導電膠帶粘在樣品臺上,濺射鍍上金屬膜。

1.2.5酸度滴定將前述菌懸液無菌稀釋至100 mL,作為未凍干處理的菌懸液。取未凍干處理的菌懸液和復水后的各種菌粉溶液2 mL分別接種于100 mL TPY培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。將得到的發(fā)酵液按GB5409-89[7]方法進行酸度測定。

2　 結果與分析

2.1 不同類型保護劑對長雙歧桿菌的凍干保護

以10%脫脂乳粉和2%的蔗糖、海藻糖、γ-PGA、甘露醇、谷氨酸為保護劑,以凍干菌粉的菌體存活率為依據,選取最佳的保護劑種類。實驗結果見圖1。

圖1　不同類型保護劑長雙歧桿菌凍干菌粉存活率的影響Fig.1　Effect of different cryoprotectants on the survival rate of Bifidobacterium longum after lyophilization

從圖1可以看出,脫脂乳粉、蔗糖、海藻糖和γ-PGA的保護效果比較好,這四種保護劑的保護效果大小為:γ-PGA>海藻糖>脫脂乳粉>蔗糖。其中2%γ-PGA的菌體存活率最高為54.8%。

γ-PGA具有極好的抗冷凍性、成膜性以及持水性,可能在凍干過程中能穩(wěn)定細胞膜和蛋白質結構,γ-PGA分子的大量羧基與菌體蛋白的羥基形成氫鍵[8],使蛋白質表面形成水化膜,穩(wěn)定蛋白質的高級結構,凍干過程中的冰晶不易損傷細胞。

2.2不同濃度γ-PGA對長雙歧桿菌的凍干保護

實驗以不同濃度的γ-PGA作為保護劑,通過對長雙歧桿菌凍干菌粉存活率的考察,確定γ-PGA作為凍干保護劑的最佳濃度。實驗結果見圖2。

圖2　γ-PGA濃度對長雙歧桿菌凍干菌粉存活率的影響Fig.2　Effect of γ-PGA concentration on the survival rate of Bifidobacterium longum after lyophilization

從圖2可以看出,γ-PGA的添加明顯提高了長雙歧桿菌凍干菌粉的存活率,其中添加量為1%時菌體存活率提高效果顯著,添加量4%處達到最大,繼續(xù)增大γ-PGA添加量,影響效果逐漸減少。由于γ-PGA分子易附著于細胞表面[9],在凍干過程中細胞中的水分子緩慢向細胞表面遷移并和γ-PGA的親水基團結合,極大的減少游離水的含量進而減緩冰晶的生長,因而減輕了細胞的損傷。但實驗過程中發(fā)現(xiàn)隨著γ-PGA添加量的增加,菌粉的吸潮也越來越加重,而且γ-PGA價格比較高[10],綜合考慮將γ-PGA的添加量確定在2.5%以內。

2.3γ-PGA與脫脂乳粉復配對長雙歧桿菌的凍干保護

用濃度0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%γ-PGA分別與10%脫脂乳粉復配,以長雙歧桿菌凍干菌粉中菌體存活率為指標,確定最佳的保護劑配方濃度。不同配方的保護劑對長雙歧桿菌凍干菌粉中菌體的存活率影響見圖3。

圖3　不同配方保護劑對長雙歧桿菌凍干存活率的影響Fig.3　Effect of different cryoprotectants on survival rate of Bifidobacterium longum after lyophilization

從圖3可以看出,10%脫脂乳粉添加γ-PGA的保護劑較單一脫脂乳粉的保護效果明顯提高,在γ-PGA濃度1.5%左右達到最高,之后隨著γ-PGA濃度的增大,凍干菌粉的存活率幾乎不再增大。而且添加脫脂乳粉后,樣品吸潮有所緩解,基于保存條件和成本效益的綜合考慮,確定采用10%脫脂乳粉和1.5%γ-PGA的復合保護劑,菌體存活率達到79.8%。

2.4添加保護劑凍干菌體微觀形態(tài)的電鏡觀察

為了從微觀探討保護劑的作用,選擇未添加保護劑的對照樣、添加2.5%γ-PGA的凍干樣、添加脫脂乳粉的對照樣與1.5%γ-PGA和10%脫脂乳粉的復配凍干樣品四種凍干菌粉進行掃描電鏡觀察,結果如圖4。

圖4　長雙歧桿菌凍干菌粉的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4　Picture of different cryoprotectants on structure of bacterial powder after lyophilization注:A：未添加保護劑的空白樣;B：2.5% γ-PGA凍干樣; C：10%脫脂乳粉凍干樣; D：10%脫脂乳粉+1.5%γ-PGA凍干樣。

冷凍干燥中,當細胞的生理條件和胞外環(huán)境相同時,菌體死亡的可能性表達為:P=cS(P為菌體死亡的可能性,c為常數,S為暴露在介質中的區(qū)域)[11],說明菌體死亡的可能性與暴露在外部的區(qū)域面積有很大的關系。從圖4中可以看出,B中菌體被保護劑均勻包裹,而且分散性良好,菌體與保護劑呈沙琪瑪狀態(tài)分布;C中保護劑與菌體呈海綿狀,雖然保護劑將長雙歧桿菌包裹的很致密,但仍有部分菌體暴露在空氣和介質中;D中保護劑與菌體呈現(xiàn)墻體結構,保護劑對長雙歧桿菌的包裹不僅致密而且?guī)缀鯖]有菌體露在表面,包裹的涂層均勻且致密。說明10%脫脂乳粉中添加1.5%γ-PGA能提供良好的物理屏障來抵御惡劣的外界環(huán)境,極大的減少了菌體暴露在介質中的面積,有效地保護細胞免受冷凍傷害。

2.5反復凍融后的菌體形態(tài)

將制得的凍干菌粉反復凍干復水,即將得到的菌粉進行復水洗滌去保護劑,離心得菌體后制成菌懸液,重新加入相對應的保護劑進行布盤凍干,如此反復2次,將得到的菌粉再進行復水洗滌去掉保護劑,離心得到菌體后,進行掃描電鏡觀察,結果如圖5。

圖5　反復凍干復水的長雙歧桿菌掃描電鏡照片F(xiàn)ig.5　Picture of different cryoprotectants on the structure of Bifidobacterium longum after repeat lyophilization and hydration注:A：未添加保護劑的空白樣;B：2.5% γ-PGA凍干樣; C:10%脫脂乳粉凍干樣; D:10%脫脂乳粉+1.5% γ-PGA凍干樣。

為了能夠直觀的觀察保護劑對菌體的保護作用,驗證不同配方保護劑緩解凍干過程對菌體的損傷,將制得的凍干菌粉反復凍融。菌體反復凍干復水后對菌體的損傷主要有冰晶機械應力[12]和冷凍脫水導致細胞的膜結構向非層狀結構相變,導致復水時膜蛋白分離引起細胞內溶物泄露甚至細胞破碎[13]。從圖5可以看出,不加任何保護劑的對照樣品A受到了極大的損傷,出現(xiàn)了大量的細胞碎片;添加2.5%γ-PGA作為保護劑的B樣品雖然也受到了損傷,但是未出現(xiàn)細胞碎片,菌體細胞表面有泡狀的突出部分,應該是內溶物輕微的泄露所導致;以10%脫脂乳粉為保護劑的C樣品雖然未出現(xiàn)細胞碎片,但是菌體變形得較為嚴重。10%脫脂乳粉與1.5%γ-PGA復配保護的樣品D細胞飽滿、形態(tài)完整、分散性好,未見細胞變形或粘連。電鏡結果進一步驗證了在凍干過程中γ-PGA能有效的保持細胞的結構完整和細胞膜的滲透屏障,有效的防止凍干損傷。

2.6菌體的產酸能力

將前述菌懸液無菌稀釋至100 mL,作為未凍干處理的菌懸液。取未凍干處理的菌懸液和復水后的各種菌粉溶液2 mL分別接種于100 mL TPY培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)18 h。酸度測定的結果見圖6。

圖6　不同配方保護劑對長雙歧桿菌發(fā)酵產酸活力的影響Fig.6　Effect of different cryoprotectants on acidogenic of Bifidobacterium longum after lyophilization

長雙歧桿菌凍干時易導致部分菌體的損傷、某些酶的鈍化影響菌體的正常代謝[14],進而使菌體的遲滯期明顯延長、對數生長期的產酸能力下降[15],所以通過酸度的測定可以表征菌體的活性。酸度的大小是菌體代謝的結果,亦是菌體活性的直觀反映。從圖6可以看出,10%脫脂乳粉與1.5%γ-PGA復配的保護劑保護的菌體與未進行凍干的菌體產酸能力相差最小,說明復配的保護劑優(yōu)于10%脫脂乳粉的保護劑。雖然2.5%γ-PGA作為保護劑的樣品產酸能力不如10%脫脂乳粉作為保護劑的樣品,但也相差不是很大,綜合前述實驗結果可以看出γ-PGA可以很好的維持菌體的活性、快速的恢復活力,降低凍干過程帶來的代謝損傷,這應該與γ-PGA分子結構有關。另外,γ-PGA具有很好的成膜性以及阻氧性,能有效的創(chuàng)造一個低氧的環(huán)境,保持長雙歧桿菌的代謝活性。

2.7凍干菌粉的貯存實驗

將經10%脫脂乳粉與1.5%γ-PGA復合保護的長雙歧桿菌凍干菌粉,抽真空塑封置于室溫貯藏,每隔15 d進行一次計數,具體結果見圖7。

圖7　貯存過程中凍干菌粉活菌數Fig.7　The survival number of Bifidobacterium longum after lyophilization

將長雙歧桿菌制成菌粉的主要目的就是提高雙歧桿菌類產品的貨架期,將制得的凍干菌粉進行貯存實驗進一步驗證保護劑的實用效果,具體實驗結果見圖7。從圖7可以看出復配保護劑在儲存90 d時活菌數為9.6 log(CFU/g)即4.02×109CFU/g,仍然保持在109CFU/g的水平,此時凍干菌粉的菌體存活率為48.3%,遠遠高于國際標準化委員會的規(guī)定[16]。

3　結論與討論

實驗得出,用10.0%脫脂乳粉作凍干保護劑菌體存活率為47.3%,而2.0%γ-PGA的菌體存活率可達到51.0%,與海藻糖效果相當。在不同濃度γ-PGA與脫脂乳粉復配的實驗中,添加γ-PGA的樣品活菌率要明顯高于單一脫脂乳粉的樣品,其中10.0%與1.5%γ-PGA復合保護長雙歧桿菌效果最為顯著,菌體的存活率達到79.8%。電鏡觀察經保護劑包埋后的菌體形態(tài)呈墻體結構將菌體致密的包裹,凍融3次后菌體形態(tài)依然飽滿、完整、未見細胞變形或粘連,復水后作為發(fā)酵菌種18 h時的酸度為65.5 °T,貯藏90 d存活率為48.3%。

當前,γ-PGA用作凍干保護劑還少有研究,它保護菌體的機理可能源于以下幾點:γ-PGA是谷氨酸聚合而成的同聚肽,分子鏈上有大量的羧基,能夠與菌體表面上的活性基團結合,使菌體包裹的更嚴實,還可以與菌體表面的蛋白以氫鍵結合,保證了蛋白質的穩(wěn)定性;而且γ-PGA的持水性好,易與水分子結合,能夠極大的減少游離水的含量進而減緩冰晶的生長,使形成的冰晶細小,達到理想的保護效果;另外隨著凍干過程中水分的升華,γ-PGA的濃度不斷增大,粘度也極度上升,因而分子擴散系數降低,有效的避免了細胞內溶物的泄露。γ-PGA屬于非滲透性的保護劑,雖然分子量比較大不能滲透進入細胞,但分布在一定的范圍內,能在細胞表面形成更密封的保護層來阻止冷凍損傷,且它的成膜性以及阻氧性能使雙歧桿菌免受氧氣的毒害,保護內部酶的活性,而且低氧環(huán)境還可降低細胞膜上脂類物質的過氧化作用。另外,γ-PGA在水中的溶解速度比較慢,可以減緩溶液進入凍干菌體中的速度,起到一個滲透緩沖作用,如果沒有這個緩沖作用,水很快就會進入細胞,造成活細胞的暫時滲透壓休克、受損細胞的破裂死亡。

γ-PGA在中性環(huán)境中是無規(guī)則卷曲狀態(tài),在酸性溶液中以平行的β-片層結構為主[17],如果將它應用于微膠囊,具有潛在的保護能力,使長雙歧桿菌有效的抵御體系中有害成分的破壞,尤其是在酸性和液體食品體系中。而且能使長雙歧桿菌在通過胃消化時對抗較強的酸環(huán)境,使益生菌高存活并有效的到達腸道的靶位點,這將對人體微生態(tài)十分有益。

[1]梁金鐘,王風青,張露露.產γ-PGA發(fā)酵動力學模型的建立[J].食品工業(yè)科技：生物工程,2013(16):174-177.

[2]范洪臣,李艷華,梁金鐘,等.響應面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌產γ-PGA的條件[J].生物加工過程,2008,6(3):17-23.

[3]梁金鐘,張露露,王風青.γ-PGA發(fā)酵液預處理的研究[J].食品科學：生物過程,2013,21(34):168-171.

[4]彭云英.γ-聚谷氨酸生產、合成機制和抗冷凍性的研究

[D].無錫:江南大學.

[5]呂志勇,呂志剛.雙歧桿菌的保健功能及其產品研發(fā)[J].食品工業(yè)科技,2006,34(19):5031-5032.

[6]陳葙南.雙歧桿菌的生理功效及應用研究進展[J].科技創(chuàng)新導報,2010,11:2-3.

[7]中國預防醫(yī)學科學院標準.GB 5409-89[S].食品衛(wèi)生國家標準匯編.北京:中國標準出版社,1988.

[8]莊華紅,王淑芳,高靖辰,等.γ-聚谷氨酸水凝膠的制備、性能及應用[J].應用化學,2014,31(3):245-255.

[9]施慶珊.γ-聚谷氨酸的微生物合成與應用[J].精細與專用化學品,2004,11(12):20-23.

[10]梁金鐘,王風青.微生物發(fā)酵法合成高分子聚合物γ-PGA的研究[J].北京工商大學學報：自然科學版,2011,29(1):24-29.

[11]曹永梅,張灝,許時嬰,等.保護劑在冷凍干燥雙歧桿菌中的作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),1999,26(2):40-45.

[12]楊戈爾.低溫冷凍過程中胞內冰晶生長機制與應用研究[D].上海:上海交通大學.

[13]蘇萍,董英,程新,等.植物乳桿菌凍干保護劑的優(yōu)化及其保護機制[J].中國食品學報,2014,14(11):56-63.

[14]Han B,Bischof JC.Direct cell injure associated with eutectic crystallization during freezing[J].Cryobiology,2004,48(1):8-21.

[15]劉麗鳳,孟祥晨.雙歧桿菌的凍干損傷及保護[J].中國乳品工業(yè),2006,1(34):39-43.

[16]楊剴舟,劉云,楊立芳,等.長雙歧桿菌BBMN68微膠囊的制備及其應用性評價[J].食品科學,2015,3(9):71-77.

[17]D.ZANUY,A.M.NAMBAL,S.LEO′N,et al.On the structure of the phase A of comb-like poly(a-alkyl-b,l-aspartate)s:a molecular modelling study[J].Polymer,2001,42:281-287.

Effect of polymerγ-PGA on freeze-dried protection ofBifidobacteriumlongum

SONG Yu-ping,LIANG Jin-zhong*,WANG Feng-qing,MEI Jian-qiu

(Key Laboratory of Food Science and Engineering,School of Food Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China)

WithBifidobacteriumlongumas experimental strain,in polymerγ-PGA as main protective agent,freeze-drying experiment was carried out.The optimal formulation of protective agent was studied by survival rate,the ability of producing acid,the morphology of the protective agent and the cell morphology that was repeated freezing and thawing after 3 times.The results showed that using 10% dried skim milk as a protectant cell survival rate was 47.3%,with 2.5%γ-PGA as a protectant cell survival rate was 54.8%.The survival rate of compound that 1.5%γ-PGA mixed with 10% Skim Milk Power was up to 79.8%,which was about 25.0% higher than using the single dried skim milk protectant at 10%.Electron microscope results showed that,with composite protective agent bacteria surface form a dense structure.After repeat freezing and thawing 3 times,there was no serious damage on bacteria.With strains that freeze-dried bacteria powder watered 2 h for fermentation,the fermentation acidity was 65.5 °T after 18 h.The survival rate stored 90 d at room temperature could reach 48.7%.

poly-γ-glutamic acid;lyophilization;Bifidobacteriumlongum;cryoprotectants

2015-11-19

宋玉萍(1990-)，女，碩士，研究方向：食品科學，E-mail：846718795@qq.com。

梁金鐘(1957-)，男，本科，教授，研究方向：微生物學與發(fā)酵工程，E-mail：Ljz2050@126.com。

“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD32B08)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0185-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.028