劉雪峰 李堰松★

宮頸癌患者手術(shù)前后血清及病變組織中AGR2水平變化及意義

劉雪峰 李堰松★

目的 探討人前梯度蛋白2（AGR2）在宮頸癌患者手術(shù)前后外周血清及病變組織中的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別測(cè)定35例宮頸癌、20例宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）患者血清和病變組織標(biāo)本、20例健康體檢者的血清標(biāo)本及20例因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)患者的正常宮頸組織標(biāo)本AGR2表達(dá)水平。結(jié)果 宮頸癌患者術(shù)前血清及癌組織中AGR2水平明顯高于CIN組及正常對(duì)照組（P＜0.01）；宮頸癌及CIN組術(shù)后血清AGR2水平較術(shù)前下降顯著（P＜0.01）；FIGO臨床分期高、腫瘤直徑＞4cm、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者組織及外周血中AGR2含量明顯增高（P＜0.05）；宮頸癌組患者術(shù)前與術(shù)后血清中AGR2含量呈正相關(guān)（r=0.643，P=0.000）；術(shù)前、術(shù)后血清中AGR2含量均與宮頸組織AGR2含量呈正相關(guān)（r=0.505，P=0.002和r=0.379，P=0.025）。結(jié)論 AGR2可能與宮頸癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)CIN向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化及病情監(jiān)測(cè)等方面具有重要的臨床意義。

宮頸癌 前梯度蛋白2 宮頸上皮內(nèi)瘤變

前梯度蛋白2（AGR2）是一種分泌蛋白，屬于原癌基因，在多種腫瘤中呈過(guò)表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、胃腸癌等，起促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、增殖及轉(zhuǎn)移等作用，是一個(gè)潛在的腫瘤診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物［1］。AGR2作為抑癌基因p53的抑制劑，直接參與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，并與化療藥耐藥性有關(guān)［2］。近來(lái)，研究提出宮頸癌細(xì)胞起源于鱗柱狀上皮交界處，AGR2是宮頸鱗柱狀交界處特異性抗體。在宮頸鱗柱狀交界處，癌前病變組織AGR2呈過(guò)度表達(dá)［3］。本文探討AGR2在宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇2013年1月至2015年1月本院病理診斷宮頸癌患者35例及宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）患者20例。宮頸癌患者：年齡40～78歲，平均年齡（54.8±10.2）歲。＜50歲8例、≥50歲27例。病理組織類型：鱗癌23例、腺癌12例。腫瘤直徑：＜4cm 26例、≥4cm 9例。根據(jù)2000年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行宮頸癌臨床分期：IA期11例、 IB期10例、IIA期10例、IIB期4例。按組織病理學(xué)分級(jí)：高分化13例、中分化10例、低分化12例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例、無(wú)轉(zhuǎn)移24例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次經(jīng)病理學(xué)確診的原發(fā)性宮頸癌。（2）均排除其他系統(tǒng)疾病以及妊娠，入院前3個(gè)月未曾接受過(guò)免疫抑制劑治療。另選取同期健康體檢者20例及因子宮肌瘤行子宮全切除術(shù)患者的正常宮頸組織20例作為正常對(duì)照組。且均簽署知情同意書。

1.2方法 （1）標(biāo)本采集 于術(shù)前3d及術(shù)后1周清晨空腹用肝素抗凝真空采血管采集靜脈血4ml，于4℃條件下3000r/min，離心15min，取上清液編號(hào)后分裝于EP管中，置-80℃冰箱保存，集中待測(cè)。（2）組織標(biāo)本 術(shù)中取新鮮手術(shù)切除宮頸病變標(biāo)本，立即放入液氮中保存?zhèn)溆?。取組織塊，在冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重，放入5ml或10ml的小燒杯內(nèi)，用移液管量取預(yù)冷的勻漿介質(zhì)（pH7.4，0.01mol/ L Tris-HCL，0.0001mol/L EDTA-2Nα，0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化鈉溶液），用組織研磨機(jī)（OMNIBead Ruptor 24 多樣品研磨珠均質(zhì)儀） 6m/s研磨制成10%組織勻漿，勻漿液離心3500r/min，離心15min，取上清液編號(hào)后分裝于EP管中，置-80℃冰箱保存，集中待測(cè)。（3） AGR2檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）法檢測(cè)，人前梯度蛋白2（AGR2）ELISA試劑盒購(gòu)自USCLIFE公司，嚴(yán)格按檢測(cè)說(shuō)明書操作。試驗(yàn)開(kāi)始前進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0ng/ml。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔。使用酶標(biāo)儀（450nm）測(cè)量各孔的吸光度（OD值）。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，相關(guān)性分析采用Person相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1AGR2在宮頸癌及CIN組織及手術(shù)前后外周血清中的表達(dá) 宮頸癌患者術(shù)前血清中AGR2水平明顯高于CIN組及正常對(duì)照組（t=4.552，P=0.000；t=10.147，P=0.000）；CIN組患者術(shù)前血清明顯高于正常對(duì)照組（t=6.171，P=0.000）；而宮頸癌患者組織中AGR2水平明顯高于CIN組及正常對(duì)照組（分別t=4.298，P=0.000；t=8.769，P=0.000）；CIN患者組織中AGR2含量明顯高于正常對(duì)照組（t=6.723，P=0.000）；宮頸癌及CIN組術(shù)后血清AGR2水平較術(shù)前下降顯著（t=5.888，P=0.000；t=6.103，P=0.000） 見(jiàn)表1。

表1　AGR2在不同宮頸組織和血清中的表達(dá)水平（±s）

表1　AGR2在不同宮頸組織和血清中的表達(dá)水平（±s）

注： 與CIN組比較，*P＜0.01；與正常對(duì)照組比較，#P＜0.01；與術(shù)前比較，▲P＜0.01

組別　n　外周血（ng/ml）　宮頸組織（ng/ml）術(shù)前　術(shù)后宮頸癌組　35　13.55±6.57*#　6.90±1.20*▲　9.20±4.77*# CIN組　20　7.28±4.83#　2.22±0.87▲　5.22±2.69#正常對(duì)照組　20　2.05±1.36　2.02±0.85

2.2宮頸癌組織及外周血中AGR2水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 宮頸癌患者外周血及組織中，腫瘤直徑越大，AGR2表達(dá)水平越高（P＜0.05）。在FIGO分期中，II期患者外周血及組織的AGR2水平比I期明顯增高（P＜0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，其血清及組織中AGR2水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2　宮頸癌組織及外周血中AGR2水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

表2　宮頸癌組織及外周血中AGR2水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

注：*P＜0.05

類別　n　外周血AGR2（ng/ml）　宮頸組織AGR2（ng/ml）術(shù)前　術(shù)后年齡＜50歲　8　12.86±2.80　7.00±0.56　10.56±5.02 ≥50歲　27　13.76±7.35　6.88±1.34　8.79±4.71病理類型鱗癌　23　16.39±5.84　6.78±1.42　8.89±5.32腺癌　12　12.07±6.54　7.15±0.59　9.79±3.61分化程度高13　15.43±4.22　7.13±0.54　8.24±4.38 中10　13.74±7.83　6.97±1.50　10.59±6.08 低12　11.36±7.37　6.61±1.47　9.08±4.04腫瘤直徑≥4cm　26　14.98±6.81*　7.17±1.18*　10.32±4.67* ＜4cm　9　9.43±3.56　6.14±0.96　5.94±3.50 FIGO分期I期　21　10.94±6.68　6.44±1.21　7.49±4.67 II期　14　17.47±4.06*　7.61±0.82*　11.76±3.76*淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有11　18.60±6.58*　7.80±0.93*　11.81±5.42* 無(wú)24　11.24±5.20　6.50±1.10　8.00±4.01

2.3宮頸癌及CIN患者病變組織與外周血中AGR2的相關(guān)性 宮頸癌組患者術(shù)前與術(shù)后血清中AGR2含量呈正相關(guān)（r=0.643，P=0.000）；術(shù)前、術(shù)后血清中AGR2含量均與宮頸組織AGR2含量呈正相關(guān)（r=0.505，P=0.002和r=0.379，P=0.025）。

3　討論

AGR2是非洲爪蟾黏液腺基因XAG-2的人類同源物，定位于人7p21.3，片段長(zhǎng)度763bp，是編碼一種分泌性蛋白質(zhì)［4］。研究發(fā)現(xiàn)，AGR2在原發(fā)性乳腺癌、前列腺癌等腫瘤組織中呈過(guò)度表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［5，6］。AGR2可能是一個(gè)新的腫瘤標(biāo)記物，其對(duì)腫瘤的調(diào)控機(jī)制逐漸受到重視。

目前關(guān)于AGR2與宮頸癌方面的研究較少，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本資料采用ELISA法檢測(cè)宮頸癌及CIN患者血清及癌組織中AGR2的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，宮頸癌患者術(shù)前血清及組織中AGR2水平明顯高于CIN組及正常對(duì)照組，CIN患者組織中AGR2含量明顯高于正常對(duì)照組，提示血清AGR2水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)。此外，宮頸癌及CIN組術(shù)后血清AGR2水平較術(shù)前下降顯著，相關(guān)分析顯示，宮頸癌組患者術(shù)前與術(shù)后血清中AGR2含量呈正相關(guān)。術(shù)前、術(shù)后血清中AGR2含量均與宮頸組織AGR2含量呈正相關(guān)。表明血清AGR2表達(dá)水平增高可能是由于宮頸癌組織過(guò)度增高的AGR2釋放入血所致，故AGR2血清水平能反映其組織學(xué)表達(dá)水平。

多項(xiàng)研究表明，AGR2與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。Alavi等［7］研究認(rèn)為，AGR2表達(dá)水平在預(yù)測(cè)年輕肺癌患者生存期中具有重要的意義。Li等［8］研究認(rèn)為，AGR2在胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF-1）誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移中起到重要的作用。白小英等［9］研究認(rèn)為，卵巢上皮癌血清AGR2水平及癌組織中AGR2的陽(yáng)性表達(dá)率均與臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。聯(lián)合檢測(cè)血清AGR2和CA125對(duì)卵巢上皮癌的早期診斷有參考價(jià)值。因此，推測(cè)AGR2有可能在一定程度上也反映宮頸癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力，與宮頸癌的進(jìn)展相關(guān)。本資料結(jié)果顯示，宮頸癌患者外周血及組織中，腫瘤直徑越大，AGR2表達(dá)水平越高（P＜0.05）。在FIGO分期中，II期患者外周血及組織的AGR2水平比I期明顯增高（P＜0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌患者，其血清及組織中AGR2水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）。提示AGR2表達(dá)水平在一定程度上反映腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移潛能。

綜上所述，AGR2可能參與CIN及宮頸癌的發(fā)展過(guò)程，血清AGR2可作為一種腫瘤標(biāo)志物并可動(dòng)態(tài)反映疾病的進(jìn)展情況，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)CIN向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化及病情監(jiān)測(cè)等方面具有重要的臨床意義。

1 任寶花，劉巍，譚文華，等.AGR2與腫瘤關(guān)系研究進(jìn)展.中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22（3）：134～136.

2 Brychtova V，Vojtesek B，Hrstka R.Anterior gradient 2：a novel player in tumor cell biology. Cancer Lett，2011，304（1）：1～7.

3 Herfs M， Parra-Herran C， Howitt BE，et al.Cervical squamocolumnar junction-specific markers define distinct， clinically relevant subsets of low-grade squamous intraepithelial lesions.Am J Surg Pathol，2013，37（9）：1311～1318.

4 魏龍剛，鄧?guó)Q濤，趙一楠，等.AGR2：一個(gè)新的癌癥診斷標(biāo)記.中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（12）：1～9.

5 Lacambra MD， Tsang JY， Ni YB， et al.Anterior Gradient 2 is a Poor Outcome Indicator in Luminal Breast Cancer. Ann Surg Oncol，2015，22（11）：3489～3496.

6 Chanda D， Lee JH， Sawant A， et al.Anterior gradient protein-2 is a regulator of cellular adhesion in prostate cancer. PLoS One，2014，9（2）：e89940.

7 Alavi M， Mah V， Maresh EL， et al.High expression of AGR2 in lung cancer is predictive of poor survival. BMC Cancer，2015，15（1）：655.

8 Li Z， Wu Z， Chen H，et al.Induction of anterior gradient 2 （AGR2）plays a key role in insulin-like growth factor-1 （IGF-1）-induced breast cancer cell proliferation and migration.Med Oncol，2015，32（6）：577.

9 白小英，金平，張蕾.AGR2在卵巢上皮性癌患者血清及癌組織中的表達(dá)及意義.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2013，29（1）：31～35.

Objective To investigate the dynamic change of levels of anterior gradient-2（AGR2） in tissue and serum of cervical cancer preand postoperation patients and the clincal siginificance. Methods The expression of AGR2 was determined by ELISA in pre- and post-operative serum and tissue samples from 35 cervical cancer patients，20 cervical intraepithelial neoplasia（CIN） patients and serum samples from 20 normal women and cervix tissue samples of 20 patients undertaken hysterctomy due to myoma were collected for the control. Results The level of AGR2 in preoperative serum and tissues of cervical cancer were higer than that of CIN and health control group（P＜0.01）. The level of AGR2 in pre-operative serum and tissues of CIN were higher than that of health control group（P＜0.01）. The level of AGR2 in post-operative serum and tissues of cervical cancer and CIN were significantly lower than that of pre-operative（P＜0.05）. The level of AGR2 in serum and tissues of cervical cancer were significantly higher in patients with high FIGO clincal stage，tumor diameter being greater than 4cm，lymph node metastasis and deep myometrial invasion.The level of AGR2 in pre-opertative serum positively correlated to that in post-operative serum of patients with cervical cancer and CIN（r=0.643，P=0.000）.The level of AGR2 in pre- and post-operative serum correlated to that in tissue of case group（r=0.505，P=0.002；r=0.379，P=0.025）. Conclusion The expression of AGR2 in patients with cervical carcer may be associated with cancer development，metastasis and prognosis. it play an important clincal significance in detecting transform from CIN to cancer and monitoring for cervical cancer.

Cervical cancer AGR2 Cervical intraepithelial neoplasia

442000 湖北省十堰市婦幼保健院