黃娟 王立瓊 程首超 程學文 趙紅玲 羅運春★

哮喘小鼠肺組織中Galectin-3和核因子NF-κB的表達及意義

黃娟 王立瓊 程首超 程學文 趙紅玲 羅運春★

目的 探討半乳糖凝集素3（Galectin-3）和核轉錄因子NF-κB在哮喘小鼠模型肺組織中的作用及相關性。方法 用卵清白蛋白建立哮喘模型。BALB/c小鼠隨機分為三組：正常對照組、哮喘組、地塞米松治療組，每組10只。留取支氣管肺泡灌洗液（BALF）進行細胞總數(shù)計數(shù)和分類計數(shù)；應用ELISA法檢測BALF中IL-4、IFN-γ濃度，采用免疫組化分別檢測和Galectin-3和NF-κB的表達。結果 （1）免疫組化顯示，哮喘組肺組織中 Galectin-3蛋白表達和相應的氣道上皮NF-κB活化強度均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（2）哮喘組肺組織中Galectin-3 蛋白表達與相應的氣道上皮NF-κB活化及BALF中IL-4濃度均成正相關（P＜0.01）。結論 哮喘小鼠肺組織NF-κB和Galectin-3表達均增加，NF-κB可能上調Galectin-3的表達。

哮喘 NF-κB 半乳糖凝集素-3 IL-4 IFN-γ

半乳糖凝集素-3（gal-3），是半乳糖家族最重要的成員之一，是近年來被認識到新的炎癥因子和生物學標記物，其參與炎癥反應，調節(jié)細胞生長，抗凋亡和介導細胞粘附等多種生物學功能［1］。核轉錄因子κB（NF-κB）是一種多功能核轉錄因子，具有廣泛生物學活性，激活后可調控多種炎性蛋白的合成，參與哮喘的炎癥反應和氣道重塑。兩者在哮喘小鼠模型中的關系國內未見報道。2014年6月至2015 年6月作者采用免疫組化法研究哮喘小鼠氣道上皮NF-κB活化情況及肺組織中Galectin-3的表達，分析其在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用及相關性，為進一步探討哮喘的發(fā)病機制奠定基礎。

1　材料與方法

1.1哮喘小鼠模型的建立 SPF級BALB/c雄性小鼠30只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，21～35d，體重14～18g，隨機分為正常對照組（A組），哮喘組（B組），地塞米松治療組（C組），每組各10只。采用V級卵清白蛋白OVA制備模型，哮喘模型的制作參照文獻［2］的方法略作改進。分致敏、激發(fā)兩個階段，第8天和第21天腹腔注射0.1ml含1%OVA的Al （OH）3凝膠致敏，各1次，共2次，第32天開始使用空氣壓縮霧化器向置于密閉有機玻璃容器內的小鼠噴霧1%OVA，每天吸入30min，連續(xù)定時激發(fā)1周。對照組以生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。

1.2實驗方法 各組末次激發(fā)＜24h處死，眼球動脈取血，收集血清，每只小鼠左肺迅速留取肺組織，部分透明，石蠟包埋連續(xù)切片，用以光電鏡標本制作和免疫組化，右肺進行支氣管肺泡灌洗并留取支氣管肺泡灌洗液（BALF），2000r/min離心15min，取上清液-80℃保存Eppendorf管用以檢測IFN-γ和IL-4濃度。支氣管肺泡灌洗小鼠收取BALF，細胞分類計數(shù)使用瑞氏染色。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法測定BALF中IFN-γ、IL-4濃度，測定方法按試劑說明書進行操作。免疫組化SP法測肺組織中NF-κB活化值和Galectin-3的表達，測定方法按試劑說明書進行操作。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。正態(tài)分布及方差齊時，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較方差齊用LSD檢驗，方差不齊用Dunnett'T3檢驗，兩變量的相關性采用Pearson相關分析法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1HE染色觀察 哮喘組小鼠肺組織切片HE染色可見肺內支氣管黏膜下、肺內支氣管及血管周圍較多炎性細胞浸潤，以EOS、Lym、Neu為主，黏膜下水腫，黏液腺增生，氣道上皮多處斷裂和上皮細胞的脫落，肺間質和支氣管腔內可見炎性細胞滲出和分泌物，支氣管壁略顯增厚和基底膜輕度增厚且不規(guī)則，細支氣管平滑肌輕度肥大。地塞米松治療組小鼠肺組織炎性細胞浸潤等病理改變較哮喘組明顯減輕。

2.2PAS染色觀察 正常對照組小鼠肺組織切片PAS染色未見黏液分泌；哮喘組PAS染色可見氣道上皮杯狀細胞增生肥大，大量黏液形成黏液栓；地塞米松治療組肺組織PAS染色與哮喘組相比杯狀細胞增生不明顯，黏液分泌明顯減少。

2.3電鏡觀察 正常對照組小鼠顯示正常肺泡Ⅱ型上皮細胞，支氣管纖毛上皮細胞纖毛排列齊整，肺泡隔結構正常，表面微絨毛豐富；未見淋巴細胞及嗜酸性粒細胞附壁及浸潤；肺細小動脈內膜、中膜、外膜清晰，內皮細胞扁平，平滑肌細胞之間有散在的膠原纖維，哮喘組小鼠電鏡觀察顯示肺間質有EOS浸潤，肺泡Ⅱ型上皮細胞水腫，核輕度固縮，胞漿部分內質網(wǎng)擴張，表面微絨毛部分脫落，線粒體輕度腫脹。支氣管纖毛上皮細胞纖毛排列稀疏，有斷裂、融合現(xiàn)象；肺泡腔及血管壁有多個巨噬細胞浸潤。

2.4各組小鼠BALF中細胞計數(shù)與分類計數(shù)的比較 見表1。

表1　各組小鼠BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)（±s）

表1　各組小鼠BALF中細胞總數(shù)和分類計數(shù)（±s）

注：與A組比較★P＜0.01；與B組比較△P＜0.05，#P＜0.01

細胞分類計數(shù)（%）Lym　NEU　Mф　EOS A組　10　22.40 ±1.0　6.35±0.95　5.13±0.48　98.75±.6.23　0.61±.0.03 B組　10　100.28±2.24★　11.61±0.35★　11.87±0.48★　66.90±9.75★　11.33±.0.72★C組　10　58.40 ±4.43★#　9.80±1.14★#　8.91±1.26★△　70.54±10.81★△　6.31±.0.32★#組別　n　細胞總數(shù)（×107）

2.5各組BALF中IL-4、IFN-γ濃度的變化 見表2。

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

表2　各組小鼠BALF中IFN-γ、IL-4濃度的變化［pg/ml，（±s）］

注：與A組比較★P＜0.01；與B組比較△P＜0.05實驗過程中因技術原因標本不合格，故鼠數(shù)與原來每組只數(shù)不一致。

組別　鼠數(shù)（只）　IFN-γ　IL-4 A組　8　18.85±7.32　37.14±3.70 B組　8　6.20±4.38★　148.87±30.90★C組　8　8.65±3.39★　72.42±7.96★△

2.6肺組織中Gal-3蛋白的變化及NF-κB活化的比較 見表3。相關性分析顯示，小鼠肺組織中Gal-3表達與BALF中IL-4濃度（ r=0.791，P＜0.01）及氣道上皮NF-κB活化均成正相關（r=0.836，P＜0.01）。

表3　各組小鼠肺組織Gal-3蛋白表達情況（±s）

表3　各組小鼠肺組織Gal-3蛋白表達情況（±s）

注：與A組比較★P＜0.05，#P＜0.01；與B組比較△P＜0.01

組別　鼠數(shù)（只）　Galectin-3蛋白　NF-κB活化值A組　10　0.18±0.03　0.17±0.03 B組　10　0.32±0.01#　0.34±0.03# C組　10　0.22±0.02△#　0.21±0.01★△

3　討論

Gal-3由一個長的N末端結構域（調節(jié)區(qū)）和C末端的單一糖識別域（CRD結構域），其羧基端是糖識別域組成。其是一種多效蛋白，表達與肺、腸、皮膚的上皮細胞、成纖維細胞及各種炎癥細胞表面。通過與其糖結合物配體結合，使其N末端調節(jié)區(qū)形成寡聚化參與調節(jié)細胞黏附，單核巨噬細胞趨化（包括肺泡巨噬細胞）、調節(jié)細胞的生成和凋亡，參與內皮細胞和血管生成及信號傳導等。Gal-3是蛋白質復合體，包括IgE的一部分，Gal-3參與lgE及其受體結合能觸發(fā)肥大細胞和嗜堿性細胞活化，刺激中性細胞過氧化物酶產(chǎn)生，激活NADPH氧化酶，促進單核細胞脂多糖途徑誘導IL-1產(chǎn)生，并誘導單核細胞向炎癥部位趨化，這些發(fā)現(xiàn)顯示Gal-3在炎癥反應中發(fā)揮重要作用。Saegusa［3］等在哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與Galectin-3（+/+）小鼠相比，Galectin-3（-/-）哮喘小鼠嗜酸性粒細胞浸潤減少，血清lgE減少，黏液分泌也顯著減少，同時減輕上皮下的纖維化、平滑肌厚度和支氣管炎周圍血管生成，減輕氣道的重塑，提示Gal-3加重的哮喘的氣道炎癥和氣道重塑。Pierluig［4］等最新的研究顯示：通過對嚴重哮喘的患者進行奧馬珠單抗（重組化、人源化抗lgE單克隆抗體）治療后發(fā)現(xiàn)，Gal-3參與急慢性炎癥和組織纖維化的發(fā)生，在初始階段的過敏反應，Gal-3刺激炎癥通過巨噬細胞釋放和IgE產(chǎn)生增加，最終結果是由膠原蛋白和纖連蛋白沉積形成的氣道重塑。Gal-3可以被認為是一個可靠的生物標志物來預測嚴重哮喘患者氣道重塑。

本資料顯示哮喘小鼠肺組織中Gal-3蛋白的表達較對照組顯著增高，其主要表達于支氣管上皮細胞及散在的炎性細胞，相關性分析顯示Gal-3mRNA含量與BALF中IL-4濃 度（r=0.761，P＜0.01）、BALF中細胞總數(shù)（r=0.821，P＜0.01）成正相關，與BALF中IFN-γ濃度（r=-0.634，P＜0.01）成負相關。提示急性哮喘發(fā)作期，支氣管上皮細胞及散在的炎性細胞釋放炎癥因子Gal-3明顯增多。與文獻報道一致［3］，蔣鯤［5］等進一步研究哮喘患兒的支氣管肺泡灌洗液發(fā)現(xiàn)Gal-3的表達明顯增高。

NF-κB是一種調控多種細胞基因的快反應轉錄因子，主要存在于胞漿，細胞靜息時極少有核表達，多數(shù)細胞中以p50 和p65 亞基的二聚體存在，由于其緊密結合的抑制蛋白IB抑制其活性。當活化因子磷酸化I-κB后釋放出NF--κB活化轉位到核中增強靶基因的表達。在參與哮喘氣道炎癥的眾多因素中，核轉錄因子NF-κB被公認哮喘關系密切。研究表明哮喘患者氣道的重要位點存在活化的NF-κB，從而編碼并調控多種炎性蛋白的持續(xù)表達［6］。Lorraine等在哮喘患者氣管活檢細胞中發(fā)現(xiàn)NF-κB的升高［7］。Dumic［8］等研究證實NF-κB和c-Jun氨基末端激酶共同參與調節(jié)gal-3的表達。且Gal-3基因敲除的小鼠有顯著降低的NF-κB的活性Gal-3和減少的炎癥細胞。同時，Gal-3的拮抗劑可以下調NF-κB的活性，哮喘發(fā)生時，Gal-3可能通過其配體血小板蛋白選擇配體1（PSGL-1）的協(xié)助發(fā)出誘導信號使NF-κB從細胞漿中脫離進入細胞核，再通過Gal-3的表達，內皮細胞和血小板均呈現(xiàn)活化狀態(tài)并迅速募集，參與炎癥反應的應答，進一步加重哮喘的發(fā)生。

本資料哮喘模型中NF-κB和Gal-3均表達增加，與文獻報道一致。而在地塞米松組中兩者的表達均降低。相關分析顯示Gal-3的變化趨勢和NF-κB的變化趨勢一致。兩者表達呈正相關性。表明哮喘肺組織中Gal-3 的表達可能由NF-κB所調控，NF-κB可能上調Gal-3 的表達，使炎癥進一步擴大。這為哮喘的發(fā)病機制及治療手段提供理論基礎，下一步對Gal-3 和NF-κB進行更深入研究，從分子水平上進一步探討哮喘的發(fā)病機制，為評價哮喘炎癥反應和尋找新的治療手段提供依據(jù)。

1 Neil C. Henderson，Tariq Sethi .The regulation of inflammation by galectin-3.Immunological Reviews，2009，230： 160～171.

2 李昌崇，張維溪，陳小芳，等.巨嗜細胞炎性蛋白1及其mRNA在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用.中華兒科雜志，2004， 42（2）：90～93.

3 Saegusa J， Hsu DK， Chen HY， et al. galectin-3 is Critical for the development of the allergic inflammation response in a mouse model of atopic dermatitis. Am J Pathol， 2009， 174（3）：922～931.

4 Pierluigi M ， Anna Maria Riccio ，Rossana R，et al. Proteomics of bronchial biopsies： Galectin-3 as a predictive biomarker of airway remodelling modulation in omalizumab-treated severe asthma patients. Immunology Letters，2014，162：2～10.

5 蔣鯤，陳和斌，王瑩等.支氣管哮喘患兒血清及支氣管肺泡灌洗液中半乳糖凝集素-3和轉化生長因子-β1的變化.臨床兒科雜志，2013：2～15.

6 張娟，徐青.核轉錄因子-κB與支氣管哮喘的研究進展.國際免疫學雜志，2010，33（3）200～204.

7 Hart LA，Krishnan VL，Adcock IM，et al. Activation and localization of transcription factor，nuclear factor -kappaB，in astlrma .Am J Respir Crit Care Med，1998，158（5 Pt 1）：1585～1592.

8 Dumic J，Lauc G，flogel M.Expression of galectin-3 in cells exposed to stress-roles of jun and NF-κB.Cell physiol Biochem， 2000，10（3）：149～158.

Objective To observe the expression of Galectin-3 and NF-κB in the bronchus of a mouse model of asthma. Methods BALB/ c mice were randomly divided into three groups：the control group，asthma group and DXM treated group.In the experiment，the mouse model of asthma was established by the ovalbumin（OVA） challenge Methods. The cell numbers and differentiated cell numbers in BALF were counted by different counting fluids；Application of ELISA Methods to detect concentration IL - 4，IFN -γ in BALF；The protein expression of Galectin-3 and NF-κB were detected by Immuno-histochemistry（IHC）. Results （1）Immunohistochemical staining showed that the protein content of Galectin-3 and airway epithelial NF-κB activation expression in asthma group were significantaly higher than that of the control group；（2）There was a positive correlation between Galectin-3 and NF-κB in lung and IL-4 in BALF（P＜0.01）.

Conclusion Asthma mice lung tissue NF-κB and Galectin 3 expression are increased，the NF-κB may increase the expression of Galectin - 3.

Asthma NF-κB Galectin-3 IL-4 IFN-γ

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