邊振宇 王雪鵬 沈蘭娟 李茂強(qiáng) 姚旺祥 朱六龍★

間充質(zhì)干細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效及相關(guān)機(jī)制分析

邊振宇 王雪鵬 沈蘭娟 李茂強(qiáng) 姚旺祥 朱六龍★

目的 分析關(guān)節(jié)內(nèi)注射和聯(lián)合靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）對(duì)實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的療效，并分析相關(guān)機(jī)制。方法 膠原誘導(dǎo)的RA模型大鼠，采用關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSC、經(jīng)靜脈注射MSC及關(guān)節(jié)內(nèi)注射聯(lián)合靜脈注射MSC治療，通過后肢體積、關(guān)節(jié)炎指數(shù)，炎癥關(guān)節(jié)的病理檢查評(píng)價(jià)治療效果，通過動(dòng)物血漿內(nèi)TNF-α及IL-10檢測(cè)及MSC與大鼠脾臟淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)分析MSC治療的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果 關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSC或靜脈注射MSC均可降低實(shí)驗(yàn)性RA模型大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，且二種方法具有協(xié)同作用，病理檢查證明MSC治療后RA模型的軟骨破壞減輕。ELISA檢測(cè)顯示MSC治療后RA動(dòng)物模型血漿促炎細(xì)胞因子TNF-α的水平顯著降低，而抑炎細(xì)胞因子IL-10的水平顯著升高，同時(shí)共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明MSC可顯著抑制II型膠原誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖。結(jié)論 MSC可有效治療實(shí)驗(yàn)性RA，治療作用與MSC的免疫抑制作用相關(guān)。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 間充質(zhì)干細(xì)胞 腫瘤壞死因子-α 白細(xì)胞介素-10

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性炎癥性免疫性疾病，發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前還無滿意的治療方法。研究［1，2］表明靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC） 可顯著降低膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎（CIA）的發(fā)生率，并減輕實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度，且MSC治療可顯著抑制多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并可誘導(dǎo)抗炎性細(xì)胞因子白介素10 （IL-10）的產(chǎn)生，而MSC能夠誘導(dǎo)具有抑制膠原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的抗原特異性Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。2014年12月至2015年10月作者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討MSC靜脈注射聯(lián)合關(guān)節(jié)內(nèi)注射治療RA的療效及相關(guān)機(jī)制，報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 清潔級(jí)雌性SD大鼠22只，體重180～200g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于杭州師范大學(xué)清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。DMEM及RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司），胎牛血清（GIBCO公司），牛Ⅱ型膠原（Chondrex，Inc.），弗氏不完全佐劑（Sigma F5506-10ml），甲基噻唑基四唑（MTT）（SIGMA公司），淋巴細(xì)胞分離液（灝洋生物，LTS1083PK），大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）及IL-10的ELISA試劑盒（Quantikine，R&D Systems Inc. USA），24孔transwell（直徑6.5mm，孔徑0.4μm，BD公司），酶標(biāo)儀（ELx800，美國Bio-Tek）。

1.2方法 （1） MSC的分離與培養(yǎng)：無菌條件下取出大鼠的股骨及脛骨，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，顯露骨髓腔，用無血清培養(yǎng)基沖出骨髓，制成單細(xì)胞懸液，1200r/min離心5min后棄上清液，重懸后以106/ml的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。原代培養(yǎng)過程中，48h后更換培養(yǎng)基，以后每3d全量更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，以1：2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。（2）培養(yǎng)的MSC的鑒定：① MSC分化檢測(cè)：利用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（添加50μg/ml抗壞血酸、10mM β磷酸甘油、0.1μM地塞米松）、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（添加1μM地塞米松、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1μg/ml胰島素）誘導(dǎo)分化12d，再檢測(cè)其成骨［堿性磷酸酶（ALP）染色］與成脂肪（油紅染色）。②流式細(xì)胞表型分析鑒定：收集P2代細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，PBS洗滌2次，將106細(xì)胞移至Eppendorf管中，分別和流式檢測(cè)用CD90、CD73、CD45、CD34單克隆抗體各20ml避光孵育30min，再用PBS洗滌并離心，洗去未結(jié)合熒光抗體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原情況。（3）實(shí)驗(yàn)性RA（ CIA）大鼠模型的建立：將濃度為2mg/ml的牛Ⅱ型膠原（CⅡ）冰醋酸溶液和弗氏不完全佐劑等體積混合乳化，制成 CⅡ乳劑。將該乳劑以0.2ml/只皮內(nèi)注射于大鼠尾部的背側(cè)。第1次注射7d后，在大鼠尾部的腹側(cè)皮內(nèi)注射0.1ml乳劑。用關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）作為判斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。AI 值=四肢肢體關(guān)節(jié)腫脹級(jí)評(píng)分之和（Ⅰ級(jí)為1分，總分為 16 分）。（4） 分組與處理：將成模 SD大鼠隨機(jī)分為4組（每組4只）。1組：尾靜脈注入100μl PBS作為對(duì)照組。2組：通過尾靜脈注入100μl MSC細(xì)胞懸液（107細(xì)胞）。3組：在RA關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入100μl MSC 細(xì)胞懸液（107細(xì)胞）。4組：通過尾靜脈注入100μl MSC 細(xì)胞懸液（107細(xì)胞）并在RA 關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入100μl MSC 細(xì)胞懸液（107細(xì)胞）。所有組別均為模型復(fù)制后12h干預(yù)。（5）檢測(cè)指標(biāo)：①動(dòng)物模型足爪體積：于治療干預(yù)后的24h、72h、7d 及14d用排水法測(cè)量大鼠雙后肢足爪體積。②關(guān)節(jié)炎指數(shù)計(jì)算：于治療干預(yù)后的24h、72h、7d及14d采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)定關(guān)節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴(yán)重程度，算出AI。 ③處死動(dòng)物后采用組織學(xué)方法對(duì)后足各關(guān)節(jié)進(jìn)行HE染色。④ 分離動(dòng)物脾臟淋巴細(xì)胞，檢測(cè)MSC對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響：無菌條件取大鼠脾臟，采用梯度離心法獲取淋巴細(xì)胞［4］。Transwell細(xì)胞培養(yǎng)：將含有2×104MSC的200μl細(xì)胞懸液加入transwell上室，下室加入600μl 含有105淋巴細(xì)胞的細(xì)胞懸液，在Transwell下室內(nèi)加入10μg/ml Ⅱ型膠原刺激淋巴細(xì)胞，上室內(nèi)不加入MSC作為對(duì)照。72h后取出Transwell上室后，下室每孔加入100μl 5mg/ml的MTT溶液，孵育4h后加入500μl DMSO，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值。⑤動(dòng)物模型血漿內(nèi)TNF-α及IL-10的檢測(cè)：采用肝素化的注射器通過心臟穿刺采集大鼠的血液，以6000r/min離心10min分離血漿與血液內(nèi)的有形成分，收集上層血漿用于行ELISA檢測(cè)。ELISA的檢測(cè)步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示。兩樣本比較用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠骨髓MSC的分離、培養(yǎng)及鑒定 培養(yǎng)1周后可見典型的細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，P2代骨髓MSC大部分成梭形，少部分成多角形（見圖1A）。成骨分化：行ALP染色可見大部分細(xì)胞呈ALP陽性反應(yīng)（見圖1B）。成脂分化：采用油紅O染色，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的油滴為油紅O染色（見圖1C）。將P3代MSC消化成單細(xì)胞懸液進(jìn)行免疫熒光染色，行雙陽性抗體、雙陰性抗體共同標(biāo)記，流式細(xì)胞檢測(cè)顯示CD73與CD90呈陽性表達(dá)，而CD34與CD45呈陰性表達(dá)，符合MSC的典型特征（見圖1D）。

圖1　大鼠MSC的培養(yǎng)、分化及流式鑒定

2.2MSC治療對(duì)后肢體積的影響 治療后第1、3、7 及14天時(shí)，2、3、4組的后肢體積逐漸減小，14d時(shí)，2、3、4組的后肢體積顯著小于1組（P＜0.001），且4組的后肢體積顯著小于2、3組（P=0.047）。（見表1）。

表1　MSC治療對(duì)后肢體積的影響［cm3，（±s）］

表1　MSC治療對(duì)后肢體積的影響［cm3，（±s）］

注：與1組比較，*P＜0.001，與2、3組比較 #P＜0.05

組別（n=4）　0d　1d　3d　7d　14d 1組（對(duì)照組）　2.00±0.37　2.03±0.37　1.95±0.31　1.85±0.24　2.16±0.26 2組　2.08± 0.34　2.18±0.59　1.93±0.33　1.83±0.19　1.78±0.23* 3組　2.10±0.61　2.05±0.37　1.95±0.31　1.78±0.28　1.75±0.10* 4組　2.00±0.67　2.00±0.67　1.80±0.41　1.67±0.29　0.96±0.10*#

2.3MSC治療對(duì)AI的影響 治療后第1、3、7及14天時(shí)，2、3及4組的AI逐漸減?。坏?天時(shí)，2、3 及4組的AI顯著小于1組（P＜0.05）；第14天時(shí)，2、3、4組的AI顯著小于1組（P＜0.001），且4組的AI顯著小于2組與3組（P=0.035）。（見表2）。

表2　MSC治療對(duì)AI的影響（±s）

表2　MSC治療對(duì)AI的影響（±s）

注：與1組比較 *P＜0.05或*P＜0.01，與2、3組比較#P＜0.05

組別（n=4）　0d　1d　3d　7d　14d 1組（對(duì)照組）　6.75±1.50　7.00±1.15　6.50±1.73　6.00±1.83　7.00±0.82 2組　6.50±1.91　6.25±2.06　4.75±2.06　4.00±1.83*　3.50±0.58* 3組　6.00±1.83　6.00±1.83　5.25±1.50　4.50±1.29*　3.25±0.50* 4組　5.25±1.89　5.25±1.89　3.75±1.71　2.25±0.50*　1.00±0.00*#

2.4HE染色結(jié)果 第1組動(dòng)物后肢關(guān)節(jié)軟骨壞死脫落、纖維化，關(guān)節(jié)腔狹窄，跗骨、跟骨骨質(zhì)吸收，炎細(xì)胞大量浸潤。2、3及4組的關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)破壞程度輕于1組，且4組的關(guān)節(jié)炎癥及關(guān)節(jié)破壞程度輕于2組與3組。（見圖2）。

圖2　各組大鼠后肢HE切片檢查

2.5對(duì)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響 MSC組的吸光值顯著低于對(duì)照組（P=0.001），提示MSC可抑制由II型膠原誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖（見表3）。

表3　MSC共培養(yǎng)對(duì)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（±s）

表3　MSC共培養(yǎng)對(duì)大鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖能力的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較 *P=0.001

組別（n=4）　吸光值MSC組　0.42±0.02*對(duì)照組　0.76±0.10

2.6動(dòng)物模型血漿內(nèi)TNF-α及IL-10的檢測(cè) 治療后第14天，2、3、4組大鼠的血漿TNF-α濃度顯著低于1組（P＜0.05），且4組血漿TNF-α濃度顯著低于2、3組（P=0.002）。2、3、4組大鼠的血漿IL-10濃度顯著高于1組（P＜0.05），且4組血漿IL-10濃度顯著高于2、3組（P＜0.001），見表4。

表4　各組動(dòng)物模型血漿內(nèi)TNF-α與IL-10濃度比較（±s）

表4　各組動(dòng)物模型血漿內(nèi)TNF-α與IL-10濃度比較（±s）

注：與1組比較，*P＜0.001，與2、3組比較，#P＜0.05

組別　TNF-α （pg/ml）　IL-10 （pg/ml）1組　62.39±5.09　17.40±1.94 2組　54.10±1.55*　23.21±1.24* 3組　54.04±2.53*　22.84±1.67* 4組　43.41±5.14*#　32.41±1.68*#

3　討論

RA是一種慢性炎癥性免疫性疾病，最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直畸形和功能喪失［5］。由于MSC具有免疫調(diào)節(jié)功能并可抑制多種免疫細(xì)胞的功能，因此有學(xué)者探索應(yīng)用MSC治療自體免疫性疾病的可行性，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡［6］。促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17在RA中起重要病理作用［3］。

本資料顯示2、3、4組在經(jīng)尾靜脈注射MSC或（和）關(guān)節(jié)內(nèi)局部注射MSC后，模型大鼠的后肢足墊厚度、后肢體積以及AI逐漸減小，至注射后2周時(shí)，3個(gè)組的后肢足墊厚度、后肢體積以及AI均顯著小于第1組。此外，后肢關(guān)節(jié)的HE染色檢查表明，2組與3組動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)炎較1組輕微且軟骨破壞減輕，4組模型的關(guān)節(jié)炎比1組輕微且無軟骨破壞。ELISA結(jié)果顯示2、3、4組動(dòng)物血漿內(nèi)的TNF-α的水平顯著低于1組，且4組的血漿TNF-α的水平顯著低于2、3組；而2、3、4組動(dòng)物血漿內(nèi)的IL-10的水平均顯著高于1組，且4組的血漿IL-10水平顯著高于2、3組。提示經(jīng)靜脈注射MSC對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA具有治療作用，且與既往的文獻(xiàn)報(bào)道一致［1，2，7］。

本資料結(jié)果表明MSC可抑制由II型膠原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖，提示MSC具有免疫抑制作用，可抑制淋巴細(xì)胞對(duì)II型膠原的免疫反應(yīng)，與其他研究一致［8］。本資料ELISA結(jié)果表明經(jīng)靜脈注射MSC或關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSC后可顯著降低促炎細(xì)胞因子TNF-α的水平，且升高抗炎細(xì)胞因子IL-10的水平，與既往的文獻(xiàn)報(bào)道一致［3］。而將靜脈注射MSC及關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSC 2種方法聯(lián)合后TNF-α的水平進(jìn)一步降低，而IL-10的水平進(jìn)一步升高，提示這2種治療方法具有協(xié)同作用。MSC通過抑制淋巴細(xì)胞增殖實(shí)現(xiàn)的免疫抑制及抑制促炎因子分泌的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)性RA的治療作用。然而其詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

本資料提示大鼠靜脈軀體注射MSC聯(lián)合關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSC可有效治療實(shí)驗(yàn)性RA，為臨床治療RA提供了一種全新選擇，應(yīng)用MSC治療RA具有廣闊的治療前景，將產(chǎn)生有價(jià)值的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。

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Objective To analyze the therapeutic effects of intra-articular injection of mesenchymal stem cells （MSCs） combined with systemic injection of MSCs in treating experimental rheumatoid arthritis，and the underlying mechanism. Methods Collagen-induced arthritis models were established using rats，then these models were treated by intra-articular injection of MSCs，systemic injection of MSCs，and intra-articular injection combined with systemic injection of MSCs. And the therapeutic effects were evaluated by measuring the hind limb volumes，arthritis indices，and pathological examination of inflamed joints. The underlying mechanisms were analyzed by detecting plasma levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and Interleukin-10 （IL-10） of rat models，and coculturing MSCs and spleen lymphocytes from rat models. Results Both intra-articular and systemic injection of MSCs can significantly lower arthritis indices of experimental rheumatoid arthritis models，and there were synergistic effects between the two ways of injection. Pathologic analysis demonstrated that cartilage destruction of animal models was less severe after MSCs treatment. ELISA assays indicated that the levels of pro-inflammatory cytokines，TNF-α，decreased significantly，and levels of anti-inflammatory cytokines，IL-10，increased significantly. Coculture of MSCs and spleen lymphocytes demonstrated that MSCs significantly inhibited type II collagen induced proliferation of T lymphocytes. Conclusions MSCs have significant therapeutic effects on experimental rheumatoid arthritis，which is related to their immunosuppressive effect.

Rheumatoid arthritis Mesenchymal stem cells Tumor necrosis factor-α Interleukin-10

杭州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010A007）

310006 浙江省杭州市第一人民醫(yī)院 骨科