郭宗凱　（山東省濰坊市高密乳肉兼用牛良種繁育改良中心　261500）

雞傳染性支氣管炎分離毒株病理組織學(xué)試驗

郭宗凱（山東省濰坊市高密乳肉兼用牛良種繁育改良中心261500）

雞傳染性支氣管炎（IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）引起的一種急性、高度接觸傳染性、病毒性呼吸道疾病。該病的主要特征是：病雞咳嗽、打噴嚏、氣管啰音；腎臟腫大、蒼白，輸尿管擴(kuò)張、有大量尿酸鹽沉積，外觀呈現(xiàn)典型的“花斑腎”。IBV自然感染通常在48h內(nèi)出現(xiàn)癥狀；人工接種后24h到7d始終可從雞氣管、腎、法氏囊中分離出病毒，不同日齡、品種和性別的雞均易感，雛雞常由于呼吸道或腎臟感染而引起死亡；幼雞流鼻涕；蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和蛋的品質(zhì)下降，給世界養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。本試驗是通過對實驗室攻毒雞各器官的病理切片進(jìn)行觀察，提供其動態(tài)病理學(xué)變化，為本病發(fā)病機制的研究提供初步的依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病料來源病料來源：經(jīng)培養(yǎng)增殖后獲得的6株毒株感染雞，取相應(yīng)病變嚴(yán)重組織病料，進(jìn)行福爾馬林溶液固定。

1.2試驗儀器生物病理切片機QPJ-1B，高級切片石蠟（熔點為54～60）℃，電熱恒溫水浴槽，六聯(lián)電子調(diào)溫萬用電爐，電熱恒溫箱，光學(xué)顯微鏡OLYMPUS CH-2，載玻片。

1.3固定液配制及HE染液配制（1）10%福爾馬林固定液：甲醛（40%）10ml、蒸餾水90ml配制而成。（2）10%中性福爾馬林固定液：甲醛100ml、稱量Na2HPO4·12H2O 39.5g、NaH2PO4·2H2O 10.95g，加蒸餾水至1000ml。（3）2.5%戊二醛：0.2M磷酸緩沖液50ml，25%戊二醛水溶液10ml，雙蒸水加至100ml。（4）蘇木素染液：蘇木素0.9g、無水乙醇10ml、明礬15g、黃色氧化汞0.5g、蒸餾水。（5）伊紅染液：伊紅2g、蒸餾水100g。（6）l%鹽酸酒精：75%酒精99ml、37%濃鹽酸1ml。（7）蘇木素染液配制：將蘇木素0.9g溶于裝有無水乙醇10ml的1000ml燒杯中，將明礬15g溶于200ml蒸餾水中，然后將二者混合，放在電爐上加熱，至沸騰，關(guān)掉電源，加入0.5g黃色氧化汞后，轉(zhuǎn)入冷水中迅速冷卻，取出靜止過夜，過濾。

2　試驗方法

2.1取材分別采取攻毒后4d、7d、15d病死雞的腎臟、肺臟、腺胃，選好切面，將其用手術(shù)刀進(jìn)一步修成便于包埋的小塊。以縱切為主，切面要修平整 。用生理鹽水洗掉組織上的血塊、污物、粘液等雜質(zhì)。

2.2水洗將固定好的組織塊由廣口瓶中取出，用一層紗布包好，將每一組做好標(biāo)記，放于大燒杯中，放在自來水水流下緩慢沖洗1d，以除去組織中的固定液。

2.3脫水將組織塊放入50%乙醇中浸泡1.5h，再放入70%乙醇進(jìn)行過夜，之后放入80%乙醇中浸泡1.5h，依次類推放入90%、95%、100%乙醇分別浸泡1.5h，最后進(jìn)行透明處理。

2.4透明與浸蠟將脫水后的組織塊依次浸入二甲苯中進(jìn)行透明。透明時間不宜太長，20min為宜，然后將透明好的組織塊，分好組放于58℃的電熱恒溫箱中依次浸入石蠟（如附表）。

附表　透明時間、浸蠟時間

2.5包埋浸蠟完成后，即做成包有組織的蠟塊。將熔化的石蠟III倒入折好的紙盒內(nèi)，再用熱的鑷子將組織塊轉(zhuǎn)入紙盒中。待石蠟結(jié)殼，將紙盒輕輕平穩(wěn)拿起，放在陰涼處過夜。

2.6修蠟塊將凝固好的蠟塊進(jìn)行修正。將包埋時蠟塊的底面修成長方形或正方形。將有組織的一面按組織塊所在的位置，保留組織周圍大約5mm的邊緣。修好的蠟塊做好標(biāo)記，并粘在小木塊上。

2.7切片、展片與烘片將粘好木塊的蠟塊放在切片機上，調(diào)整好蠟塊的位置，勻速轉(zhuǎn)動切片機，當(dāng)切出完整而連續(xù)的切片時，用干燥的毛筆將切片從切片刀上取下，光亮面向下平鋪于42℃的恒溫水浴箱中，等待蠟帶上的細(xì)小皺折通過酒精的張力伸開、展平，然后用載玻片撈取完整的無皺褶的切片，置于載玻片中間偏左的位置。將水分稍晾干后，即刻放入60℃的烘烤箱中烘烤30min，使切片粘到載玻片上。

2.8HE染色（1）二甲苯去蠟（經(jīng)2次）5～10min。（2）無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各1～2min，然后蒸餾水洗3min（換數(shù)次）。（3）蘇木紫液染色約3～5min（視染液種類和著色情況增減）。（4）水洗；1%酸性乙醇或1%鹽酸分化，顯微鏡下控制。（5）流水浸洗至少15min，至細(xì)胞核呈藍(lán)色。也可短時水洗后，浸于40℃溫水使核變藍(lán)。（6）伊紅液染0.5～1min后，95%乙醇2次，無水乙醇2次，約1～2min/次。（7）苯酚二甲苯（1∶3）5min。（8）二甲苯2次，3～5min/次。（9）用中性樹膠或DPX以蓋片封片，貼標(biāo)簽。

2.9封固觀察將染好色的切片由染色缸中取出后，在組織上滴少許的樹膠，然后用蓋玻片從一側(cè)開始蓋片，樹膠凝固后即可進(jìn)行觀察。

3　結(jié)果與分析

通過觀察，分離自山東的6株雞傳染性支氣管炎病毒，可引起雞發(fā)病。引起的雞傳染性支氣管炎，主要病理變化發(fā)生在氣管、肺臟、腎臟、腺胃，肝臟也有部分病變。肺臟主要表現(xiàn)為出血、淤血、水腫和炎性細(xì)胞浸潤；腎臟主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞局灶性增生、核碎裂、核溶解；腺胃平滑肌間隙變寬、有淋巴樣細(xì)胞浸潤和大量上皮細(xì)胞壞死、腺體上皮細(xì)胞增生，管中有脫落的上皮細(xì)胞，腺體下平滑肌層被水腫液分隔，固有層水腫、有多量炎性細(xì)胞浸潤。毛細(xì)血管充血、腺體上皮細(xì)胞大量空泡化，部分心肌細(xì)胞空泡化，腺腔中有黏液、脫落的腺細(xì)胞及單核細(xì)胞，并有大量的腺細(xì)胞壞死、脫落、崩解。在病變嚴(yán)重的病例，病變可以深入到平滑肌層，出現(xiàn)實質(zhì)性變性蠟樣壞死。肝臟主要表現(xiàn)為淤血，肝索紊亂，肝小葉界限不清。

4　結(jié)論

由于IBV的血清型很多，又具有高度傳染性，雞群同時感染不同毒株和使用弱毒疫苗發(fā)生基因重組而不斷變異，使IBV侵害雞體的靶器官也發(fā)生了變換。目前對IBV的研究很多，而關(guān)于腺胃變型IBV毒株的致病力和引起各器官的動態(tài)病理學(xué)變化，僅在山東地區(qū)有少許報道。一般認(rèn)為腎型IBV主要靶器官為腎臟，主要靶細(xì)胞為腎小管上皮細(xì)胞，引起間質(zhì)性腎炎的變化，至于其他組織器官中病毒的定位和分布則不太清楚。同時試驗中組織學(xué)觀察表明，用6株IBV分離株對雞攻毒后，首先出現(xiàn)呼吸道癥狀，腺胃癥狀出現(xiàn)在肺臟、腎臟之后，其他一些器官也出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。 病毒侵害呼吸器官后，引起氣管水腫，炎性細(xì)胞浸潤；肺臟出血，水腫，炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚；然后引起腎的損傷，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，炎性細(xì)胞灶狀增生，核溶解，核碎裂等，證實IBV首先會引起呼吸道的癥狀，之后會引起腎臟的病變。

S858.31文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

1007-1733（2016）08-0033-02

2016-04-25）