杜培杰　程子龍　劉瑋孟　王軍一　張 靜　王方昆　劉思當*（山東省臨沂市畜牧站　2760372　山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院　山東 泰安　山東省臨沂市動物疫病預防控制中心　山東省臨沂市羅莊區(qū)沂黨鎮(zhèn)政府）

牛流行熱病例的綜合診斷及預警防控

杜培杰①①程子龍①劉瑋孟③王軍一①張 靜④王方昆①劉思當①*
（①山東省臨沂市畜牧站2760372①山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院山東 泰安③山東省臨沂市動物疫病預防控制中心④山東省臨沂市羅莊區(qū)沂黨鎮(zhèn)政府）

2015年9月山東某肉牛場從吉林一次性購牛300多頭，到場后先后出現(xiàn)30頭5月齡犢牛精神沉郁、食欲不振、高燒不退、咳嗽氣喘，起初治療效果不明顯，最終由于呼吸困難導致8頭犢牛死亡。通過病理剖檢、病理組織學觀察、分子生物學檢測，最終確診為牛流行熱繼發(fā)巴氏桿菌感染，該牛場做了充分的生物安全措施，控制了牛流行熱疫情。這是繼2013年以來山東地區(qū)又一次發(fā)現(xiàn)牛流行熱病例，引起了當?shù)匦竽凉芾聿块T和牛場的高度重視并采取相應的預警防控措施，未使疫情擴散蔓延。

牛流行熱，是由牛流行熱病毒引起的一種牛和水牛的急性熱性傳染病，又名暫時熱、三日熱、僵硬病。本病的臨床特征為突發(fā)高熱、呼吸促迫、流淚、流泡沫性涎、消化機能障礙、全身虛弱、僵硬、跛行，多為良性經(jīng)過，大部分患病牛經(jīng)2～3d即可恢復正常［1］。該病傳播迅速，流行面廣，有一定的周期性，曾在我國多個省份多次發(fā)生流行，導致產(chǎn)奶量下降，乳品質降低，役用牛跛行或癱瘓，部分懷孕牛流產(chǎn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟損失，嚴重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展［2］。該病臨床病例常表現(xiàn)為流行熱繼發(fā)細菌感染，尤其是巴氏桿菌，特征為發(fā)病急、發(fā)病快，往往來不及治療就出現(xiàn)死亡，大部分病牛經(jīng)及時治療可以耐過，但部分病牛則很難治愈，轉為慢性肺炎，生長緩慢。

1　臨床背景

山東菏澤某肉牛場從吉林地區(qū)一次性購牛300多頭，其中包括母牛、架子牛和犢牛，經(jīng)過25h的長途運輸?shù)竭_山東菏澤地區(qū)，到場后30頭5月齡的犢牛先后出現(xiàn)咳嗽、氣喘、持續(xù)高燒，體溫高達42℃，精神沉郁，食欲減退，起初治療效果不明顯，最終因呼吸困難而窒息死亡8頭犢牛。

2　診斷方法

2.1細菌分離培養(yǎng)把采取的肺臟、喉頭等病料，用平板劃線法［3］接種血瓊脂平板，放37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。挑取單個菌落，涂片，革蘭氏染色，油鏡下觀察。

2.2藥物敏感試驗用圓紙片擴散試驗法［4］進行藥敏試驗，分別挑取單個菌落用滅菌的PBS稀釋，稀釋好后用涂布棒在血瓊脂平板上均勻涂布，然后均勻貼上頭孢噻呋鈉、鹽酸環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、乳酸恩諾沙星、慶大霉素、林可霉素、羅紅霉素藥敏片，于37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h，觀察結果，根據(jù)藥物紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，來判定該菌對各種藥物的敏感程度。

2.3病理組織學檢查取肺組織于10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.4分子生物學檢測按照病毒 RNA提取試劑盒說明書，從肺組織和喉頭黏液中提取病毒總RNA，用全式金一步法RT-PCR試劑盒進行反轉錄和PCR反應，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外照膠儀下觀察結果，分別檢測牛流行熱病毒、牛副流感Ⅲ型病毒。

3　結果

3.1剖檢病變剖檢其中的三頭病死牛后發(fā)現(xiàn)胸腔內有大量淡黃色澄清積液，其中兩頭病牛胸腔內有大量纖維素性滲出物，肺和胸腔粘連，肺暗紅色實變，并見嚴重的間質性肺氣腫、水腫，肺間質增寬，有大量膠凍樣滲出物（圖1A）；因喉頭黏膜顯著腫脹擠壓氣管導致氣管腔極度狹窄（圖1B左側為正常喉頭，右側喉頭黏膜顯著腫脹），形成典型的巴氏桿菌引起的“鎖喉風”癥狀。

3.2細菌學及藥物敏感試驗結果從喉頭黏膜處分離到紅色的兩端鈍圓著色較深的的革蘭氏陰性菌（疑似巴氏桿菌）和藍紫色球形堆積成葡萄串狀的革蘭氏染色陽性菌（疑似葡萄球菌）如圖2。藥敏試驗結果表明，分離到的這些細菌對左氧氟沙星、乳酸恩諾沙星高敏，鹽酸環(huán)丙沙星、羅紅霉素中敏，頭孢噻呋鈉、慶大霉素、林可霉素不敏感。

圖2 油鏡下細菌形態(tài)

圖1　剖檢病變（A∶肺臟水腫，充滿膠凍樣滲出物；B∶喉頭黏膜腫脹）

3.3病理組織學病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)肺組織結構破壞，肺組織中散在許多化膿灶，肺泡腔內有大量纖維素性滲出物和中性粒細胞（圖3A）；細支氣管腔中充滿中性粒細胞、脫落的黏膜上皮細胞（圖3B）；肺化膿灶部位可見組織壞死崩解和大量浸潤的嗜中性粒細胞，周圍被結締組織包繞形成包囊（圖3C）；有的化膿灶以細支氣管腔為中心，細支氣管腔內有大量均質紅染膿汁（圖3D）；大部分肺組織呈漿液性肺炎病變，肺泡腔內充滿漿液性滲出物和淋巴細胞，并見肺泡性氣腫（圖3E）；小葉間淋巴管和支氣管高度擴張（圖3F）；有的肺泡腔內有漿液纖維素性滲出物，淋巴細胞、巨噬細胞浸潤（圖3G）；肺間質增寬、水腫、炎性細胞浸潤（圖3H）；支氣管周圍有大量漿液性滲出物和淋巴細胞浸潤，支氣管腔受擠壓皺縮（圖3I）。

圖3　病理組織學切片（A.肺泡腔內纖維素滲出物和中性粒細胞200×；B.細支氣管腔內充滿中性粒細胞、脫落的黏膜上皮細胞200×；C.化膿灶100×；D.以細支氣管腔為中心的化膿灶40×；E、F.漿液性肺炎及肺泡氣腫200×；G.肺泡腔內漿液纖維素性滲出物，淋巴細胞、巨噬細胞浸潤200×；H.肺間質水腫增寬100×；I.支氣管周圍大量漿液和淋巴細胞浸潤，支氣管腔受擠壓皺縮40×）

3.4分子生物學結果M為2000bp Marker，+、—分別為牛流行熱病毒陽、陰性對照，1、2是牛副流感Ⅲ型病毒，3、4是牛流行熱病毒，牛流行熱病毒的片段大小是524bp（圖4），從瓊脂糖凝膠電泳圖中可以看出牛副流感Ⅲ型病毒陰性，牛流性熱病毒陽性。

圖4　瓊脂糖凝膠電泳圖

3.5結論結合細菌學、病理組織學、分子生物學方法檢測結果綜合判定，該病例的原發(fā)病為牛流行熱并繼發(fā)巴氏桿菌等細菌感染。

4　防控措施

（1）及時對病死牛進行無害化銷毀處理，每天兩次對牛舍、水槽、料槽進行全面徹底消毒，不留死角；密切關注牛群狀況，每天對全群牛進行體溫測量，發(fā)現(xiàn)有咳嗽氣喘以及體溫升高的牛及時隔離觀察。（2）對疑似發(fā)病牛采取積極的治療措施，對咳嗽氣喘的牛用左旋氧氟沙星靜脈注射，肌肉注射慶大霉素或大觀霉素-林可霉素合劑，并配合應用氨基比林，飲水中添加維生素C。另外，對未發(fā)病的牛尤其是周圍受到威脅的牛群緊急免疫流行熱滅活疫苗［5］。（3）該病確診后，及時向當?shù)匦竽莲F醫(yī)局上報了疫情，業(yè)務部門對牛群疫情進行了密切監(jiān)控，封鎖牛場，嚴禁流通，并對牛場內外進行全面嚴格的消毒，從而使該病得到了很好的控制，在周邊地區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)流行熱病例。此次在山東省菏澤地區(qū)發(fā)生的流行熱是繼2013年流行以來的再次發(fā)生［6］，引起了菏澤畜牧部門的足夠重視，對菏澤及周邊地區(qū)養(yǎng)牛場及時通報了疫情，建議牛場密切關注牛群有無高熱等異常表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)異常情況，及時采取防控措施，從而防止了本病的傳播，減少了不必要的損失。（4）本次發(fā)生的流行熱疫情很顯然是因異地調牛而發(fā)生的輸入性病例，發(fā)病原因可能是該牛群本身攜帶流行熱病毒處在穩(wěn)定期或者潛伏期，經(jīng)長途運輸、環(huán)境改變等應激因素誘發(fā)了本病的發(fā)生［7］。從未發(fā)病牛群中檢出該病是很困難的，何況異地調牛時一般都不進行相關疫病的嚴格檢疫，這就為山東地區(qū)主要依賴從外地調牛育肥模式敲響了警鐘，應盡量從本地繁育牛場調牛或者發(fā)展自繁自養(yǎng)模式，避免“引狼入室”或因長途運輸應激而誘發(fā)牛的呼吸系統(tǒng)疫病［8］。

［1］Walker P J. Bovine ephemeral fever in Australia and the world［M］//The World of Rhabdoviruses. Springer Berlin Heidelberg， 2005∶57-80.

［2］Yeruham I， Van Ham M， Bar D， et al. Economic aspects of the 1999 outbreak of bovine ephemeral fever in dairy S cattle herds in the Jordan Valley in Israel［J］. Veterinary record， 2003， 153（6）∶ 180-182.

［3］周德慶， 張文治， 強義國. 平板劃線法分離微生物純種的一個經(jīng)驗［J］. 生物學教學， 1981， 01∶ 28-29.

［4］劉從森， 胡小冬， 管俊昌. 藥物敏感試驗方法學概述［J］. 中國病原生物學雜志， 2010， 12∶ 951-952.

［5］谷根林， 楊宗照， 蔣建一等. 牛流行熱疫苗對奶牛的免疫保護試驗［J］. 杭州農(nóng)業(yè)科技， 2002， Z1∶ 88-89.

［6］岳瑞超， 劉立濤， 屈亞錦等. 牛流行熱病例的綜合診斷［J］. 中國獸醫(yī)雜志， 2015， 02∶ 37-39+52.

［7］岳瑞超， 程子龍， 劉思當. 架子牛選購與運輸技術［J］. 山東畜牧獸醫(yī)， 2014， 11∶ 14-15.

［8］劉思當， 程子龍， 畢云霞等. 山東省肉牛養(yǎng)殖現(xiàn)狀調查分析［J］. 山東畜牧獸醫(yī)， 2014， 12∶ 53-56.

S858.23文獻標識碼：B

1007-1733（2016）08-0026-03

山東省牛產(chǎn)業(yè)技術體系資助（SDAIT-12-011-04）

2016-07-18）