王廣宇 王雨 王雷永 徐旭英

摘要? 目的：紫色疽瘡膏、回陽生肌膏、朱紅膏是我科生肌三法的代表方藥，通過臨床研究觀察瘡面修復中起重要作用的細胞因子TNF-α、VEGF、bFGF變化情況，初步探討其作用機制。方法：選取2015年1月至2016年5月北京中醫(yī)醫(yī)院收治的糖尿病伴慢性瘡面患者90例作研究對象，按照局部辨證分為活血生肌組、回陽生肌組和去腐生肌組，每組30例。潰瘍中醫(yī)證侯積分觀察治療0、6、12 d。留取治療0、3、6 d局部組織及瘡面滲出物，檢測其中TNF-α、VEGF、bFGF 3種生長因子在滲出物中含量變化，組織中蛋白及mRNA相對量的變化。結果：中醫(yī)證候積分部有效率為53.3%，組間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.428）;中醫(yī)外用藥應用于瘡面后，滲出物、組織中蛋白和組織中mRNA表達，TNF-α、VEGF、bFGF 3種生長因子，有著較為一致的檢測結果。紫色疽瘡膏治療3 d VEGF、bFGF升高明顯，后有所下降，而對TNF-α無明顯影響;回陽生肌膏治療3 d后bFGF、TNF-α后升高明顯，6 d時稍有下降，而對VEGF無明顯影響;朱紅膏對TNF-α、VEGF、bFGF 3種生長因子有緩慢持續(xù)的升高作用。結論：觀察到紫色疽瘡膏影響了VEGF、bFGF;回陽生肌膏方對TNF-α、bFGF有較強的升高作用;朱紅膏方對TNF-α、VEGF、bFGF均有緩慢持續(xù)的升高，通過調(diào)整這些重要的細胞因子，從而改變瘡面的狀態(tài)。

關鍵詞? 糖尿病伴慢性瘡面;生肌三法;機制;滲出物;生長因子;紫色疽瘡膏;回陽生肌膏

Exploration on the Mechanism of Prescriptions of “Three Methods of Promoting Granulation” on Diabetic Foot with Chronic Sores

WANG Guangyu，WANG Yu，WANG Leiyong，XU Xuying

（Vascular Surgery Department of Sore and Ulcer，Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Capital Medical University，Beijing 100010，China）

Abstract Objective： Zise Juchuang Ointment，Huiyang Shengji Ointment and Zhuhong Ointment are representative prescriptions of “three methods of promoting granulation” in my department.To preliminarily explore the mechanism through clinical study and observation on changes of TNF-α，VEGF and bFGF that play important roles in sore repair. Methods： A total of 90 patients of diabetes with chronic sores admitted in Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine from January 2015 to May 2016 were selected as study objects.According to local syndrome differentiation，they were divided into invigorating blood and promoting granulation（IBPG）group，restoring yang and promoting granulation（RYPG）group and eliminating necrosis and promoting granulation（ENPG）group，with 30 cases in each group.Ulcer syndrome scores in traditional Chinese medicine（TCM）were observed before the treatment，and on the 6th and 12th days.Local tissue and sore surface exudate were collected before the treatment，and on the 3th and 6th days.Content changes of the 3 growth factors-TNF-α，VEGF and bFGF in the exudate，and relative amount changes of protein and mRNA in the tissue were detected. Results： Effective rate of TCM syndrome score was 53.3%，and there was no statistical significance in the difference between the groups（ P =0.428）.After TCM external application to sores，in the expressions of mRNA in the tissue and protein in the tissue and exudate，as well as in the 3 kinds of growth factors（TNF-α，VEGF and bFGF），the detection results were relatively consistent.After the treatment with Zise Juchuang Ointment for 3 d，VEGF and bFGF were increased significantly，but they were decreased later，and there was no significant effect on TNF-α.After 3 d of the treatment with Huiyang Shengji Ointment，bFGF and TNF-α were increased significantly，and they were decreased on the 6th d，but there was no significant effect on VEGF.Zhuhong Ointment had a slow and sustained increasing effect on the 3 kinds of growth factors（TNF-α，VEGF and bFGF）. Conclusion： It can be observed that Zise Juchuang Ointment may affect VEGF and bFGF; Huiyang Shengji Ointment may strongly increase TNF-α and bFGF; Zhuhong Ointment has a slow and continuous increasing effect on TNF-α，VEGF and bFGF.By adjusting these important cytokines，the state of sores is changed.

Keywords? Diabetes with chronic wounds; Three methods of promoting granulation; Mechanism; Exudate; Growth factor; Zise Juchuang Ointment; Huiyang Shengji Ointment

中圖分類號：R255.4;R275.9 文獻標識碼：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.019

近幾十年，糖尿病伴慢性創(chuàng)面日益增多，在長期臨床探索中北京中醫(yī)醫(yī)院瘡瘍血管外科（后簡稱我科）認為，其發(fā)生、發(fā)展、預后與局部虛（陽氣不足）、瘀（血瘀）、毒（熱毒）3個病理過程相互轉化、互為因果所致。局部破潰后瘡面修復過程中以陽虛、血瘀、熱毒為主要矛盾的過程，導致久不愈合。我科在繼承前人基礎上，逐步整理出以回陽、活血、去腐生肌三法為核心的系列理法方藥，是糖尿病伴慢性瘡面修復的有效手之一。

巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞是創(chuàng)面愈合的炎性反應、增殖、修復3個過程中起重要作用的細胞，其主要由腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor α，TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、堿性成纖維因子（Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF）3個細胞因子調(diào)控。圍繞著3種細胞因子的變化，初步探討以回陽生肌膏方、紫色疽瘡膏方、朱紅膏方為代表生肌三法方藥，對慢性瘡面的臨床療效和作用機制，以現(xiàn)代技術為方法作了以下研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年1月至2016年5月首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院收治的糖尿病足伴慢性瘡面90例作為研究對象，按照局部辨證方法分為活血生肌組、回陽生肌組和去腐生肌組，每組30例。本臨床研究所需標本均為清創(chuàng)后廢棄的組織，不影響患者任何正常治療，并經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審查和批準，簽屬知情同意書后措施。

1.2 診斷標準 1）西醫(yī)診斷標準參照國際糖尿病足工作組（IWGDF，International Working Group on the Diabetic Foot）發(fā)布的2015版《國際糖尿病足慢性創(chuàng)面管理指南》，糖尿病伴足部潰瘍4周以上未能愈合，也無明顯愈合趨勢的創(chuàng)面稱之為糖尿病足伴慢性創(chuàng)面（DFCUs）[1]。2）局部辨證方法參照《中藥新藥臨床研究指導原則》所示：1）血瘀證：瘡面潰爛經(jīng)久，滲出物較少或干枯無膿，腐肉少許或腐肉雖脫，但新肉難生，瘡周膚色暗無紅腫;2）陽虛證：瘡面灰白色或紫暗，腐肉較多伴有滲出物清稀，或如粉漿，創(chuàng)周無紅腫。3）濕熱證：瘡面滲出較多，腐肉不脫，瘡周紅腫，界限不清[2]。

1.3 納入標準? 瘡面符合上述診斷標準，年齡65～85歲的患者，且非放射性、非結核、非癌性等瘡面，瘡面面積4～30 cm2，深至皮下組織，但未及骨質(zhì)。

1.4 排除標準 排除惡性腫瘤、急性心腦血管意外、腎功能不全、嚴重肝臟損傷等急慢性疾病，

1.5 脫落與剔除標準 在治療過程中出現(xiàn)創(chuàng)面感染加重，創(chuàng)面擴大，或者出現(xiàn)心腦血意外，或其他影響創(chuàng)面愈合和治療的因素，或因各種因素退出治療的，作為脫落對象。

1.6 治療方法 基礎治療：依據(jù)2015版《國際糖尿病足慢性創(chuàng)面管理指南》進行內(nèi)科處理[1]。外科處理，依據(jù)局部辨證活血生肌組、回陽生肌組、去腐生肌組分別應用紫色疽瘡膏紗條、回陽生肌膏紗條、朱紅膏紗條（3種藥物均我院內(nèi)制劑），紗條剪成合適大小敷于瘡面，1次/d，并蠶食清創(chuàng)。

1.7 觀察指標

1.7.1 糖尿病足潰瘍中醫(yī)癥候積分 依據(jù)文獻報道進行，評分時間為治療前及治療后6 d、12 d，共計觀察12 d[3]。治療前后檢測肝腎功能、血尿便常規(guī)，記錄發(fā)生不良事件及計算發(fā)生率。

1.7.2 瘡面滲出物細胞因子變化 在留取標本前1 d局部凡士林紗布換藥。取定制1.5 cm2單層無菌紗布，局部換藥時敷于瘡面基底，第2天更換敷料時取出，立即放入2 mL無菌生理鹽水中，-80 ℃保存、留檢。滲出物中細胞因子應用懸浮芯片檢測法。每組觀察30例，選取適于清創(chuàng)選取組織的患者每組8例進行組織檢測。TNF-α、bFGF、VEGF細胞因子檢測試驗盒（MILLPLEX MAP Human cytokine/chemokine magnetic bead panel試劑盒，批號：2509782）;磁力板架（Millipore，編號：MX-STAND）;懸浮芯片檢測儀（Luminex 200TMIS，BIO-RAD）。檢測前制備抗體標記微球、質(zhì)量控制組、清洗緩沖液（Wash Buffer）、人細胞因子標準品。免疫操作過程：按操作規(guī)則加入標本，置入Luminex 200TMIS（BIO-RAD）內(nèi)檢測。保存并分析MFI結果，計算鹽水中細胞因子濃度代替瘡面滲出物細胞因子濃度。

1.7.3 瘡面組織中細胞因子蛋白含量變化 留取清創(chuàng)后棄去的組織，為皮膚真皮淺層，立即放入-80 ℃冰箱保存。經(jīng)50.0 μg/mL GA干預24 h后，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。Western blot檢測VEGF、TNF-α和bFGF蛋白表達水平。使用MultiSkan MK3酶標儀（Thermo）進行檢測和照相。計算目標蛋白的光密度值，并與GAPDH（YM3030，Immunoway）蛋白質(zhì)標準化的內(nèi)參抗體光密度值的比值，進行統(tǒng)計學比較，計算靶蛋白的相對量。

1.7.4 瘡面組織中細胞因子基因表達相對量變化? 組織留取方法同1.7.3。應用即時PCR法。使用Trizol試劑（Takara，日本）進行總RNA提取。反應體系的總體積是20 μL，補充有5 μL 5×RT緩沖液，5 μL dNTP，0.5 μL RNA模板，5 μL隨機引物（oligdt），1 μL逆轉錄酶M-MLV，0.5 μL RNA酶抑制劑RNAsin，10.5微升水無RNase，變性在42 ℃下進行60 min，退火在95 ℃下進行5 min。TNF-α正向引物GTCAACCTCCTCTCTGCCATCAA，反向引物ATAGATGGGCTCATACCAGGGCTT;VEGF正向引物GAGATGAGCTTCCTACAGCACAACA，反向引物GGAACATTTACACGTCTGCGGATCT;bFGF的正向引物TTCTTCCACAGTCAGGTCAA，反向引物GAGTGGATGGATCTCAATGA。

1.8 療效判定標準 癥候積分減少≥95%為臨床痊愈，癥候積分減少≥70%為顯效，癥候積分減少≥30%為有效，癥候積分減少<30%為無效。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用（? ±s ）表示，組間比較采用均數(shù)間 t 檢驗;3組間比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計學意義的對3個均數(shù)進行組間多重比較 q 檢驗;計數(shù)資料采用行列表資料的χ2檢驗。以 P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組患者一般情況比較 回陽生肌組瘡面病程、CRP、WBC明顯高于活血生肌組，去腐生肌組WBC、CRP上明顯高于活血生肌組，差異有統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2 3組瘡面滲出物3種細胞因子變化情況 活血生肌組瘡面滲出物VEGF、bFGF在治療3 d明顯升高，VEGF在治療第6天較第3天明顯下降，而bFGF在治療第6天較第3天明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義，治療前后TNF-α無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義;回陽生肌組瘡面滲出物TNF-α、bFGF在治療第3天升高明顯，TNF-α治療后第6天較第3天稍有下降，但明顯高于治療前，差異不顯著性意義，bFGF治療第6天較第3天明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義，但較治療前差異無統(tǒng)計學意義，VEGF治療前后均無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義;去腐生肌組3種細胞因子在治療前后均有不同程度緩慢升高，差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 3組局部組織中3種細胞因子相對量變化情況? 活血生肌組局部組織中VEGF應用后第3天升高明顯，與0天比較差異有統(tǒng)計學意義，第6天下降，與0天比較差異無統(tǒng)計學意義，bFGF治療3、6 d升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義，TNF-α治療前后無變化，差異有統(tǒng)計學意義;回陽生肌膏組局部組織中TNF-α、bFGF第3天升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義，第6天有所下降，與第0天比較差異無統(tǒng)計學意義;去腐生肌組中3種細胞因子均持續(xù)升高，3 d與0 d、6 d與3 d比較均有升高，差異有統(tǒng)計學意義。見表3、圖1。

2.4 3組瘡面組織中3種細胞因子基因表達相對量變化情況 活血生肌組瘡面VEGF應用第3天升高明顯，bFGF應用3 d、6 d后均升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義;回陽生肌組中TNF-α、bFGF第3天升高明顯，差異有統(tǒng)計學意義，bFGF第6天有所下降，與第3天比較差異有統(tǒng)計學意義，TNF-α第6天下降，但仍較第3天升高，差異有統(tǒng)計學意義;去腐生肌組瘡面3種細胞因子均有所升高，并且第6天明顯高于第3天，差異有統(tǒng)計學意義。見表4。

2.5 3組局部辨證中醫(yī)證候積分變化情況 所選患者證候積總有效率為53.3%，行列表資料的χ2驗各組間P=0.428，各組間差異無統(tǒng)計學意義。見表5。

2.6 安全性分析 3組患者治療前后行血尿常規(guī)和肝腎功能等常規(guī)檢查，未見應用藥物后對上述指標有不良影響。與藥物有關的不良反應均為瘡周皮疹，朱紅膏1例，回陽生肌膏1例，總的不良反應發(fā)生率為2.2%，均能夠堅持而未中斷局部用藥治療。

3 討論

糖尿病伴慢性瘡面總屬陰疽范疇[4]，陰疽病名最早載于南北朝傷科醫(yī)書《劉涓子鬼遺方》：“陰疽發(fā)髀，若陰股始發(fā)，腰強，內(nèi)不能自止，數(shù)飲不能多，五日堅痛不治，三歲死”，說明其慢性難愈的特點?！澳摓闅庋?，膿液清稀量少，總以陽衰陰寒，氣血虛衰為主，回陽可治;干涸量極少，因氣血瘀滯而以活血生肌為法;膿液量不足，瘡周紅腫總以氣血不足以托毒外出，局部去除熱毒為要[5]。初步概括出慢性瘡面的局部辨證要點，具備了生肌三法的雛形。

回陽生肌膏方組成：肉桂、炮姜、人參蘆、白芍、當歸，白芥子、蘄艾、黃芪，白蘞，其3組藥物質(zhì)量比為1∶ 3∶ 1.5。方中君以黃芪、當歸益氣補血而不滯，臣以人參蘆增加益氣之效，臣以肉桂、炮姜、蘄艾溫陽散寒通絡，陽氣虛損不能溫化寒濕痰瘀，佐以白芥子溫陽豁痰祛濕，另佐白芍收斂氣血以阻其耗散，白蘞寒以制溫補、涼以解其毒為使。功在益氣養(yǎng)血、回陽生肌[6]。紫色疽瘡膏方組成：龍血竭、輕粉、紅粉、琥珀粉、乳香粉，冰片、煅珍珠粉，2組各藥物比為10∶ 1。方中以龍血竭活血化瘀為君藥，臣以琥珀粉、乳香粉增強化瘀之力，臣以紅粉、輕粉味辛，去腐拔毒促進生肌，佐珍珠粉具有收斂生肌之效，以防過度辛散耗氣。使以冰片增加通散之功。全方主以活血化瘀生肌，并兼去腐解毒、煨膿長肉之功[7]。朱紅膏方組成：京紅粉，朱砂，基質(zhì)為凡士林，每100 g藥物中含有生藥19 g。二者主要含有的硫化汞和氧化汞是化腐生肌的主藥。朱砂性寒味甘功專解毒，紅粉辛熱功擅化腐，二藥一文一武，一陰一陽，功效相伍為用，藥性相互制約，總為去腐生肌，兼有活血化瘀之效[8]。

文獻表明高血糖所致下：1）血管內(nèi)皮細胞的血管新生、趨化作用、舒縮功能明顯異常[9];2）增加了單核細胞的黏附作用而導致遷移、趨化作用減弱[10];3）成纖維細胞增殖、分裂能力下降[11];4）較早的文獻觀察到，瘡面局部巨噬細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞出現(xiàn)數(shù)量、形態(tài)的改變[12-13]。

結合我科既往研究，依據(jù)生肌三法理論，局部辨證所示典型陽虛證、血瘀證、濕熱證的瘡面，代表了糖尿病伴慢性瘡面中的虛瘀毒3個基本病理過程，它們互相影響、互為因果、相互轉換，瘡面發(fā)展某一階段為主要矛盾[14]。

見表1一般資料看，陽虛證瘡面伴有輕度炎性反應，氣血不足以全部托毒外出，停滯于局部功能和數(shù)量下降的狀態(tài)，所以纏綿難愈病程較長，濕熱證瘡面仍屬陰中之陽證，炎性反應較陽虛證為重，瘡面停滯于慢性炎性反應狀態(tài)，而血瘀證瘡面炎性反應及病程方面并不突出，局部停滯于循環(huán)障礙狀態(tài)。

依據(jù)圖1和表3所示皮下組織中細胞因子應用藥物后變化規(guī)律?；钛〗M應用紫色疽瘡膏方后，可檢測在治療6 d中對TNF-α影響不大，但VEGF在第3天有較為明顯的升高，第6天有明顯下降的過程，bFGF有著相類似變化過程;陽虛證回陽生肌組應用回陽生肌膏方第3天瘡面TNF-α、bFGF有著明顯的升高，到第6天再下降的過程，但對VEGF影響不大;濕熱證瘡面應用朱紅膏方TNF-α、VEGF、bFGF3種生長因子3、6有緩慢持續(xù)的增多的過程;伴隨著滲出物生長因子的變化，其組織中相同生長因子蛋白及其PCR基因相對表達量有著相一致的變化規(guī)律，可見3種藥物作用于瘡面局部，通過某種方式啟動了這些相關蛋白的表達，這些細胞因子的增加促進了細胞功能變化，起到愈合瘡面的過程。

結果也顯示，其總的有效率偏低，3組間差異無統(tǒng)計學意義，但是本研究觀察瘡面12 d，應用后瘡面均能在短時間內(nèi)滲出物增加，且較為稠厚，腐肉去而肉芽增生，使瘡面虛瘀毒不同狀態(tài)得到明顯改善，改善瘡面主要矛盾，就是證型的改變，啟動愈合生肌的趨勢，這才是慢性難愈合瘡面治療的重點。

綜上所述，3種外用藥物可能機制，紫色疽瘡膏增加了VEGF、bFGF;回陽生肌膏方對TNF-α、bFGF有較強的刺激作用;朱紅膏方對TNF-α、VEGF、bFGF均有緩慢持續(xù)的升高[15]。通過調(diào)整這些重要的細胞因子，從而改變瘡面的狀態(tài)，顯現(xiàn)出中醫(yī)外用藥的相對專一和相對綜合的作用。

參考文獻

[1] 楊川.《國際糖尿病足工作組糖尿病足慢性創(chuàng)面處理指南》中文譯文[J].糖尿病天地：臨床，2015，9（10）：502-506.

[2]國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥新藥臨床研究指導原則[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：239-243.

[3]李云平，矯浩然，王剛，等.關于糖尿病足潰瘍中醫(yī)證候療效評價體系探討[J].天津中醫(yī)藥，2012，29（3）：251-253.

[4]徐旭英，呂培文.糖尿病足辨證分析[J].北京中醫(yī)藥，2009，28（9）：696-698.

[5]高兆旺，張麗，劉慶申.《外科正宗》的瘡瘍氣血論[J].山東中醫(yī)藥大學學報，2007，31（1）：14-15.

[6]孟建霞，徐旭英，王廣宇，等.回陽生肌膏對慢性皮膚潰瘍脾腎陽虛證患者創(chuàng)面巨噬細胞的影響[J].中醫(yī)雜志，2019，60（5）：391-395.

[7]王廣宇，徐旭英，王伏聲，等.活血回陽祛腐法治療糖尿病足伴慢性骨髓炎93例[J].西部中醫(yī)藥，2015，28（2）：88-91.

[8]吳珣，丁毅，康煜冬，等.朱紅膏紗條外敷聯(lián)合西醫(yī)治療陰虛濕熱型動脈硬化閉塞癥臨床研究[J].世界中西醫(yī)結合雜志，2018，13（2）：229-232.

[9]楊柳清，李亮，衡先培，等.丹瓜方對糖尿病動脈粥樣硬化大鼠炎性標志物及內(nèi)皮細胞功能的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2017，37（6）：692-698.

[10] Nandy D，Janardhanan R，Mukhopadhyay D，et al.Effect of hyperglycemia on human monocyte activation[J].J Investig Med，2011，59（4）：661-7.

[11]Francesco Facchiano，Alessandro Lentini，Vincenzo Fogliano，et al.Sugar-Induced Modification of Fibroblast Growth Factor 2 Reduces Its Angiogenic Activity in Vivo[J].Am J Pathol，2002，161（2）：531-541.

[12]Brunner G，Blakytny R.Extracellular regulation of TGF-beta activity in wound repair：growth factor latency as a sensor mechanism for injur[J].Thromb Haemost，2004，9（22）：253-261.

[13]邱林，金先慶.轉化生長因子β在創(chuàng)傷愈合，瘢痕增生以及骨形成方面的研究與進展[J].中國臨床康復，2005，9（10）：178-179.

[14]王廣宇，王雨，王雷永，等.生肌三法分類創(chuàng)面免疫熒光四重染色病理學特點淺析[J].福建中醫(yī)藥，2018，49（5）：5-8.

[15]賈湘隆，徐旭英，周敏.回陽生肌膏對糖尿病大鼠陰證瘡面氧化應激的影響[J].中醫(yī)雜志，2019，60（11）：969-973.

（2018-10-17收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（81673975）——回陽生肌膏促進2型糖尿病潰瘍微血管形成的作用機制研究;首都中醫(yī)藥研究專項一般項目（15ZY16）——紫色疽瘡膏促進潰瘍局部微循環(huán)變化的機制研究;北京中醫(yī)藥科技項目（WAF2012-13）——生肌三法促進瘡面愈合的機制研究

作者簡介：王廣宇（1971.12—），男，碩士研究生，副主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)外用藥對慢性創(chuàng)面修復的研究，E-mail：wgy0503@sina.com

通信作者：徐旭英（1973.04—），男，博士研究生，主任醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥對慢性創(chuàng)面修復的機制研究，E-mail：xxying7341@126.com