馮 躍　高 騰　顧歡歡　褚秀玲　蘇 建（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院　山東 聊城　252000）

單因素試驗(yàn)優(yōu)選刺五加多糖的提取條件研究

馮 躍高 騰顧歡歡褚秀玲蘇 建*
（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院山東 聊城252000）

刺五加是畜禽生產(chǎn)和保健中常用的一味鎮(zhèn)靜安神，補(bǔ)氣活血的中藥。刺五加多糖是刺五加有效成分的重要組成部分。試驗(yàn)通過熱水浸提法提取刺五加多糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)定刺五加多糖的含量，考察單因素刺五加粉碎度、提取溶質(zhì)、提取pH、浸泡時(shí)間和脫脂對(duì)刺五加多糖提取率的影響。結(jié)果顯示，刺五加粉碎度以80目以上，提取溶質(zhì)選擇50%乙醇，提取pH值選擇6，浸泡時(shí)間選擇2h，石油醚脫脂處理，刺五加多糖的提取率最高，達(dá)到3.27±0.07%。本試驗(yàn)為刺五加多糖的臨床生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

刺五加多糖提取單因素

隨著畜禽養(yǎng)殖的規(guī)模化、集約化發(fā)展，中獸藥的劑型要求從散劑向更高的劑型，如口服液或顆粒劑轉(zhuǎn)化。中藥有效成分的提取方法是影響藥效發(fā)揮的關(guān)鍵因素。有效成分最佳提取工藝可以最大效率的應(yīng)用中藥，解決目前中藥的利用效率低，部分中藥供應(yīng)不足的問題，符合國家生態(tài)、節(jié)能的發(fā)展目標(biāo)［1］。同時(shí)，中藥的提取標(biāo)準(zhǔn)化也有利于中藥制劑的標(biāo)準(zhǔn)化。

抗生素的禁用和食品安全監(jiān)管的加強(qiáng)，使中藥成為代替抗生素的重要選擇之一，同時(shí)中藥具有綠色、環(huán)保、藥食同源的功效，更符合養(yǎng)殖業(yè)健康養(yǎng)殖和預(yù)防為主的觀念。刺五加系五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus）的干燥根及根莖，具有扶正固本、益智安神及補(bǔ)腎健脾等功效，該藥性溫，味辛、微苦［2］。刺五加多糖（ASPS）是刺五加中一類具有生物活性的多糖，其不但具有提高畜禽生產(chǎn)性能的功效，同時(shí)還能激活畜禽機(jī)體免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生態(tài)平衡［3］。但是ASPS在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用研究極為薄弱。ASPS的提取工藝有待進(jìn)一步優(yōu)化，本試驗(yàn)在前期的基礎(chǔ)上，通過考察單因素對(duì)刺五加多糖提取率的影響，從而選擇最佳的提取條件以提高ASPS的提取率，減少資源浪費(fèi)，提高經(jīng)濟(jì)效益。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料刺五加飲片（批號(hào)：20150507，產(chǎn)地甘肅）購于聊城利民大藥房；苯酚、濃硫酸均為分析純。

1.1.2試驗(yàn)儀器水浴鍋、萬能粉碎機(jī)、離心機(jī)、722分光光度計(jì)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1刺五加多糖含量測(cè)定方法刺五加多糖含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品（105℃干燥恒重），準(zhǔn)確配制濃度為2g/ml的母液，分別稀釋濃度為20、 40、60、80、100、120和140μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0、20、40、60、80、100、120和140μg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各1ml，加入8個(gè)10ml的具塞試管中，然后每個(gè)試管中分別加入7%苯酚溶液1ml，最后每個(gè)試管沿管壁迅速加入5ml濃硫酸，搖勻，冷水浴5min后，以第一個(gè)試管樣品為空白對(duì)照，在波長490nm處測(cè)定吸光度（A）值。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.2刺五加的粉碎度將刺五加飲片60℃干燥后，高速粉碎，分別過10、20、40、60目和80目篩。料水比、提取時(shí)間和提取溫度分別使用實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得的最佳提取條件［4］，既料水比1∶25，提取溫度90℃，提取時(shí)間2.5h。分別在5個(gè)具塞的錐形瓶中加入2g不同粉碎度的刺五加粉末，加入50ml純凈水，水浴鍋90℃水浴2.5h，紗布過濾，濾液適當(dāng)稀釋后在490nm處測(cè)定多糖的含量。

1.2.3提取溶劑精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個(gè)具塞的錐形瓶中，分別加入30%、40%、50%、60%和70%的乙醇50ml。

1.2.4提取液的pH值精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個(gè)具塞的錐形瓶中，加入50ml的純凈水，用1M HCl和1M NaOH調(diào)節(jié)pH值分別為5、6、7、8和9 5個(gè)梯度。

1.2.5浸泡時(shí)間精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個(gè)具塞的錐形瓶中，按浸泡時(shí)間1、2、3、4和5h，加入50ml的純凈水。

1.2.6脫脂處理精確稱取2g 80目的刺五加粉末到5個(gè)具塞的錐形瓶中，分別加入乙醚、石油醚、丙酮、甲醇和乙酸乙酯各100ml，浸泡24h，過濾，烘干藥渣，再加入50ml的純凈水。

1.2.7驗(yàn)證性試驗(yàn)使用以上單因素試驗(yàn)獲得的最佳提取條件，對(duì)刺五加多糖提取3次，測(cè)定刺五加多糖的提取率。

3　結(jié)果和分析

3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以葡萄糖配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用苯酚—硫酸法測(cè)定不同濃度的葡萄糖在490nm處的吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同標(biāo)準(zhǔn)濃度葡萄糖與對(duì)應(yīng)吸光值的線性回歸直線如圖1，線性擬合方程為A=0.0095C-0.005，R2=0.9929，試驗(yàn)表明，葡萄糖濃度在20～140μg/ml范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

附圖　葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2刺五加粉碎度對(duì)多糖提取率的影響

刺五加粉碎度對(duì)多糖提取率的影響見表1，由表中數(shù)據(jù)可見，刺五加多糖的提取率隨粉碎度的上升而上升，80目以下最高，10目以上最低，20目、40目和60目相近。藥物的粉碎度越高，越有利于有效成分的溶出，但是20～80目之間的差別不大，80目以上，多糖提取率達(dá)到最高?？紤]到生產(chǎn)中的經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性，臨床生產(chǎn)可以選擇40目粉碎，試驗(yàn)室選擇80目粉碎。

表1　粉碎度對(duì)刺五加多糖提取率的影響　　　　 （%）

3.3提取溶劑對(duì)刺五加多糖提取率的影響提取溶劑對(duì)刺五加多糖提取率的影響見表2，由表中數(shù)據(jù)可見，刺五加多糖的提取率開始隨乙醇濃度的上升而上升，50%達(dá)到最高，然后隨乙醇濃度的增加而下降。乙醇的極性高于水，隨著乙醇濃度的提高，提取液極性增強(qiáng)，有利于溶液滲透到細(xì)胞內(nèi)，但是多糖不溶于乙醇，所以，當(dāng)乙醇濃度超過50%時(shí)，多糖的溶解度下降，導(dǎo)致提取率也降低。臨床選擇50%乙醇作為提取溶劑最優(yōu)。

表2　提取溶劑對(duì)刺五加多糖提取率的影響　　　　 （%）

3.4提取液pH值對(duì)刺五加多糖提取率的影響

提取溶劑pH值對(duì)多糖提取率的影響見表3，由表中數(shù)據(jù)可見，刺五加多糖的提取率在不同pH條件下，以pH6最高。酸堿性對(duì)多糖的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)都有影響，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿都能造成多糖的降解，特別是強(qiáng)酸。試驗(yàn)結(jié)果顯示弱酸pH6有利于多糖的提取。

表3　提取液pH值對(duì)刺五加多糖提取率的影響　　　 （%）

3.5浸泡時(shí)間對(duì)刺五加多糖提取率的影響

浸泡時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見表4，由表中數(shù)據(jù)可見，刺五加多糖的提取率隨浸泡時(shí)間的增加而增加。隨著浸泡時(shí)間的延長，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，有利于有效成分的溶出。但考慮到時(shí)間和經(jīng)濟(jì)因素，選擇2h浸泡即可。

表4　浸泡時(shí)間對(duì)刺五加多糖提取率的影響　　?。╤、%）

3.6脫脂對(duì)刺五加多糖提取率的影響

脫脂對(duì)刺五加多糖提取率的影響見表5，由表中數(shù)據(jù)可見，石油醚對(duì)刺五加的脫脂效果最好。藥物中的脂肪會(huì)影響有效成分多糖的溶出，在提取前通過有機(jī)溶劑脫脂，除去不易溶解的脂肪等雜質(zhì)，更有利于后期多糖的溶出。石油醚的非極性強(qiáng)，價(jià)格便宜，脫脂效果好。

表5　脫脂處理對(duì)刺五加多糖提取率的影響　　?。╤、%）

3.7驗(yàn)證性試驗(yàn)

對(duì)刺五加多糖的三次提取率見表6，由表中數(shù)據(jù)可見，三次刺五加多糖的提取率平均為（3.27± 0.07）%。

表6　刺五加多糖的提取　　　　　　　　（%）

4　結(jié)論

試驗(yàn)通過對(duì)刺五加多糖提取率的影響因素粉碎度、脫脂、pH值、溶劑乙醇濃度和浸泡時(shí)間進(jìn)行單因素提取實(shí)驗(yàn)，獲得了影響刺五加多糖提取的最佳提取條件。試驗(yàn)結(jié)果顯示，粉碎度、提取介質(zhì)和脫脂對(duì)多糖的提取率影響較大，在生產(chǎn)中有必要重點(diǎn)考慮。

［1］任衛(wèi)東. 立足畜牧業(yè)生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，發(fā)展高效生態(tài)畜牧業(yè)［J］. 山東畜牧獸醫(yī)， 2016， 37（230）∶ 46-47.

［2］董文婷， 霍金海， 張海燕等. 刺五加葉的藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2015， 21（23）∶ 220-223.

［3］國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典∶一部［S］. 北京∶ 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010∶ 192.

［4］陳芬芳， 于紅梅， 王瑞等. 刺五加多糖的提取工藝研究［J］. 中國飼料， 2015， 1∶ 22-24.

S853.73

A

1007-1733（2016）08-0008-02

聊城大學(xué)大學(xué)生科技文化創(chuàng)新基金資助，項(xiàng)目編號(hào)：（SF2014210）

2016-04-26）