孫　杰,易　陽(yáng),2,王宏勛,2,王麗梅,閔　婷,2,周　敏,2,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430023;3.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

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蓮藕多糖的提取工藝優(yōu)化及理化特性研究

孫杰1,易陽(yáng)1,2,王宏勛1,2,王麗梅2,3,閔婷1,2,周敏1,2,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023;2.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心,湖北武漢 430023;3.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,湖北武漢 430023)

采用響應(yīng)面法優(yōu)化蓮藕多糖的提取工藝,并初步探析多糖的理化特性。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取提取溫度、提取時(shí)間和均質(zhì)轉(zhuǎn)速為影響因素,以蓮藕多糖提取得率為響應(yīng)值建立三因素三水平回歸模型?；诨貧w模型分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)確定蓮藕多糖提取的最佳工藝條件為:提取溫度89 ℃、提取時(shí)間121 min、均質(zhì)轉(zhuǎn)速11800 r/min,該條件下的多糖得率預(yù)測(cè)值為5.64%,實(shí)際值為5.88%。蓮藕粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白后,DPPH自由基清除能力明顯增強(qiáng),其分子量小于24.2 ku且主要由吡喃型單糖組成。

蓮藕多糖,提取工藝,優(yōu)化,理化特性

目前,關(guān)于蓮藕多糖提取工藝的優(yōu)化研究主要集中于傳統(tǒng)的熱水浸提法[7-8]。超微粉碎能有效增加植物多糖的提取率[9-10],而高速均質(zhì)則是一種高效的濕法粉碎方式。高速均質(zhì)法能通過(guò)強(qiáng)的機(jī)械和液力剪切作用將大顆粒物料直接破碎,廣泛應(yīng)用于植物活性成分的提取制備[11-13],但在植物多糖提取中的應(yīng)用相對(duì)鮮見(jiàn)。本研究以蓮藕濕渣為原料,結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蓮藕多糖的均質(zhì)提取工藝條件,初步純化制備蓮藕多糖,并考察其理化特性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蓮藕武漢市常青花園武商量販超市;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)Sigma公司;總蛋白測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所;水溶性聚氧化乙烯標(biāo)準(zhǔn)品(重均分子量分別為24.2、41.3、67.5、149和313 ku)美國(guó)Waters公司;濃硫酸、苯酚、葡萄糖、氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、丙三醇、乙醇等均為國(guó)藥分析純。

高效液相色譜儀(差示折光檢測(cè)器2414、紫外檢測(cè)器2489、二元泵1525、分子排阻色譜柱Ultrahydrogel 1000)Waters公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠;12N冷凍干燥儀、XHF-D高速分散器寧波新芝生物科技股份有限公司;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市醫(yī)療儀器廠;TD6M醫(yī)用離心機(jī)長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司;V-1100D型可見(jiàn)分光光度計(jì)上海美譜達(dá)儀器有限公司;電子分析天平奧豪斯國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;HR2168粉碎機(jī)飛利浦公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

鉀是農(nóng)作物三大營(yíng)養(yǎng)元素肥料之一，對(duì)保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、糧食安全具有舉足輕重的作用。我國(guó)是一個(gè)缺鉀國(guó)家，資源儲(chǔ)量?jī)H占世界約2%。我國(guó)探明的資源儲(chǔ)量以鹽湖鉀礦為主，分布在青海柴達(dá)木盆地和新疆羅布泊地區(qū)。隨著兩大鉀肥基地建成，特別近十年來(lái)，我國(guó)先后突破了低品位固體鉀鹽、尾礦利用、深部鹵水開(kāi)采等技術(shù)，使得鉀鹽可采量成倍增加。

1.2.1蓮藕多糖的提取制備新鮮蓮藕經(jīng)洗凈去節(jié)后切塊粉碎,取濕藕渣(8.0±0.1)g加入適量的蒸餾水,采用高速勻漿機(jī)均質(zhì)處理5 min后置于熱水浴中浸提。浸提結(jié)束后離心(4500 r/min,10 min)分離上清液。上清液定容至250 mL后待測(cè),或合并真空濃縮(55 ℃)用于制備多糖樣品。將多糖濃縮液等體積分成兩份,其中一份加入4倍體積的無(wú)水乙醇,置于4 ℃沉淀12 h后離心(4500 r/min,10 min)分離沉淀。揮發(fā)除去殘留乙醇后,加少量水將沉淀分散溶解,采用冷凍干燥制備得到蓮藕粗多糖。另一份濃縮液通過(guò)Sevage法去除蛋白質(zhì),經(jīng)醇沉、冷凍干燥后制得脫蛋白多糖。蓮藕多糖得率計(jì)算如下:

Y(%)=[(A×B)/C]×100

式中:Y為多糖得率(%);A為由回歸方程求得的多糖濃度(mg/mL);B為多糖液體積(mL);C為蓮藕質(zhì)量(g)。

1.2.2蓮藕多糖的分析方法

1.2.2.1基本成分測(cè)定總糖采用苯酚-硫酸法[14]測(cè)定,還原糖采用DNS法[15]測(cè)定,而多糖含量計(jì)為總糖與還原糖的含量之差。蛋白質(zhì)含量采用總蛋白測(cè)定試劑盒(考馬斯亮藍(lán)法)參考其說(shuō)明書(shū)測(cè)定。

1.2.2.2分子量分布分析采用0.1 mol/L硝酸鈉配制2.5 mg/mL的多糖樣液和聚氧化乙烯標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣,采用差示折光檢測(cè)器(檢測(cè)多糖色譜圖)和紫外檢測(cè)器(280 nm檢測(cè)蛋白質(zhì)色譜圖)分析。進(jìn)樣體積為15 μL,流動(dòng)相為0.1 mol/L硝酸鈉,洗脫流速為0.4 mL/min,柱溫為35 ℃。測(cè)定已知分子量的聚氧化乙烯標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(t,min),建立lgMw-t曲線方程為lgMw=0.003t3-0.173t2+2.872t-9.325。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖樣品出峰時(shí)間對(duì)應(yīng)的分子量大小。

1.2.2.3紅外光譜分析取1 mg樣品與100～200 mg KBr粉末在研缽中混勻研磨,置于模具內(nèi)壓成透明薄片,在4000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.2.2.4DPPH自由基清除率測(cè)定用蒸餾水配制系列濃度的多糖樣液,取50 μL樣液加入0.7 mL的100 μmol/L DPPH溶液中作為實(shí)驗(yàn)組,混勻后在室溫下避光反應(yīng)30 min,并于517 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光值,以水代替樣液作為空白對(duì)照,以甲醇代替DPPH溶液作為樣品對(duì)照[16]。DPPH自由基清除率(%)=[1-(A實(shí)驗(yàn)組-A樣品對(duì)照)/A空白對(duì)照]×100。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1料液比對(duì)多糖提取得率的影響在均質(zhì)轉(zhuǎn)速12000 r/min、浸提溫度70 ℃和浸提時(shí)間2 h的條件下,選取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)進(jìn)行蓮藕多糖的提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2提取溫度對(duì)多糖提取得率的影響在料液比1∶15(g/mL)、均質(zhì)轉(zhuǎn)速12000 r/min和浸提時(shí)間2 h的條件下,選取提取溫度50、60、70、80、90 ℃進(jìn)行蓮藕多糖的提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.3提取時(shí)間對(duì)多糖提取得率的影響在料液比1∶15(g/mL)、均質(zhì)轉(zhuǎn)速12000 r/min和浸提溫度70 ℃的條件下,選取提取時(shí)間1、1.5、2、2.5和3 h進(jìn)行蓮藕多糖的提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.4均質(zhì)轉(zhuǎn)速對(duì)多糖提取得率的影響在料液比1∶15(g/mL)、浸提溫度70 ℃和浸提時(shí)間2 h的條件下,選取均質(zhì)轉(zhuǎn)速6000、9000、12000、15000、18000 r/min進(jìn)行蓮藕多糖的提取實(shí)驗(yàn)。

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選定提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)、均質(zhì)轉(zhuǎn)速(X3)三個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素與水平編碼見(jiàn)表1。

表1　實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面分析采用SAS軟件進(jìn)行處理。組間差異比較采用SPSS軟件的S-N-K檢驗(yàn)完成,顯著性水平為p<0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1料液比對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響由圖1可知,料液比在1∶5～1∶15(g/mL)的范圍內(nèi),蓮藕多糖提取得率隨著料液比的減小而顯著增加(p<0.05),較大溶劑量有利于多糖的傳質(zhì)擴(kuò)散[17-18]。但料液比的進(jìn)一步減小并不能顯著增加多糖得率(p>0.05)。綜合考慮蓮藕多糖的提取得率及后期濃縮制備的工作量,最佳料液比為1∶15(g/mL)。

圖1　料液比對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of lotus root polysaccharides

2.1.2溫度對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響由圖2可知,在提取溫度50～90 ℃的范圍內(nèi),蓮藕多糖提取得率隨著溫度的升高而顯著增加(p<0.05)?？赡苁前殡S溫度的升高,原料溶脹度增大,傳質(zhì)強(qiáng)化,從而使得多糖的溶出率增加[19]。蓮藕多糖的最佳提取溫度為90 ℃。

圖2　溫度對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響Fig.2　Effect of temperature on the extraction rate of yield of lotus root polysaccharides

2.1.3時(shí)間對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響由圖3可知,在提取時(shí)間1～2 h范圍內(nèi),蓮藕多糖提取得率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加(p<0.05)。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2 h后,多糖的得率增加不顯著(p>0.05),可能是多糖的溶出過(guò)程已達(dá)到平衡[20]。綜合考慮多糖的提取得率及工藝的能耗,蓮藕多糖的最佳提取時(shí)間為2 h。

圖3　時(shí)間對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響Fig.3　Effect of time on the extractionyield of lotus root polysaccharides

2.1.4均質(zhì)轉(zhuǎn)速對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響由圖4可知,在均質(zhì)轉(zhuǎn)速6000～12000 r/min范圍內(nèi),蓮藕多糖的提取得率隨著均質(zhì)轉(zhuǎn)速的增大而顯著增加(p<0.05),但當(dāng)均質(zhì)轉(zhuǎn)速超過(guò)12000 r/min后,多糖的得率增加不顯著(p>0.05)。均質(zhì)轉(zhuǎn)速越大,物料所受剪切作用越強(qiáng),粉碎粒度越小且與溶劑接觸面積越大,多糖的溶出效果越好[21]。但均質(zhì)轉(zhuǎn)速超過(guò)12000 r/min后,物料粉碎粒度并不能進(jìn)一步降低,且過(guò)細(xì)的顆?？赡墚a(chǎn)生對(duì)多糖的吸附。蓮藕多糖提取的最佳均質(zhì)轉(zhuǎn)速為12000 r/min。

圖4　均質(zhì)轉(zhuǎn)速對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響Fig.4　Effect of homogenization speed on the extraction yield of lotus root polysaccharides

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果如表3所示。以提取溫度X1、提取時(shí)間X2和均質(zhì)轉(zhuǎn)速X3為實(shí)驗(yàn)因素,建立以多糖得率Y為考察指標(biāo)的回歸模型為:

Y=5.56+0.16X1+0.14X2-0.05X3-0.08X12-0.14X1X2+0.03X1X3-0.36X22-0.10X2X3-0.16X32

表3　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

從表4可知,回歸模型達(dá)顯著水平(p<0.05),其決定系數(shù)R2為0.8532,說(shuō)明響應(yīng)值的變化有85.32%來(lái)源于所選因子變化,擬合程度良好,失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05)。從方差分析表中F值可以確定,各因素對(duì)蓮藕多糖提取得率的影響順序?yàn)?提取溫度>提取時(shí)間>均質(zhì)轉(zhuǎn)速,二次項(xiàng)中僅X22對(duì)多糖得率有極顯著的影響(p<0.05)。

表4　回歸模型的方差分析

分析回歸模型響應(yīng)值Y的極值點(diǎn)為:X1=0.9107、X2=0.0273、X3=-0.0818,即最佳工藝參數(shù)為:提取溫度89.11 ℃、提取時(shí)間120.82 min、均質(zhì)轉(zhuǎn)速11754.71 r/min,此時(shí)蓮藕多糖得率的模型預(yù)測(cè)值為5.64%?？紤]實(shí)際可操作性,確定蓮藕多糖提取的優(yōu)化工藝參數(shù)為:提取溫度89 ℃、提取時(shí)間121 min、均質(zhì)轉(zhuǎn)速11800 r/min,多糖得率的模型預(yù)測(cè)值為5.64%。在優(yōu)化的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),蓮藕多糖得率為5.88%,與模型預(yù)測(cè)值的誤差在5%以?xún)?nèi),說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化所得工藝參數(shù)較為準(zhǔn)確可靠。本研究所建立的提取方法通過(guò)均質(zhì)盡可能減小物料粒度,增大與溶劑的接觸面積,增大多糖的溶出效率,與傳統(tǒng)水提法相比能夠大大縮短提取時(shí)間。

2.3蓮藕多糖組成及結(jié)構(gòu)特征

蓮藕粗多糖中多糖和蛋白質(zhì)含量分別為47.94%±1.29%和2.60%±0.07%,其多糖含量較低。經(jīng)過(guò)脫蛋白處理后得到脫蛋白多糖,其多糖和蛋白質(zhì)含量分別為58.89%±1.09%和1.13%±0.13%。樣品中多糖含量偏低,可能與較差的復(fù)溶性有關(guān)。相較之下,脫蛋白多糖樣品中可溶性多糖含量顯著增加(p<0.05),且蛋白質(zhì)含量顯著降低(p<0.05)。對(duì)比蓮藕粗多糖和脫蛋白多糖的體積排阻色譜圖(圖5)可知:脫蛋白多糖主要為低分子量組分(<24.2 ku);粗多糖的分子量分布較寬,其大分子量組分的重均分子量約為233 ku;兩種多糖中蛋白質(zhì)的分子量分布無(wú)明顯差異。

圖5　蓮藕粗多糖和脫蛋白多糖的體積排阻色譜圖Fig.5　Size exclusion chromatograms of crude polysaccharides and the polysaccharides which removed protein of lotus root

由圖6可知,粗多糖在指紋區(qū)干擾譜帶較多且吸收強(qiáng)度較弱,而脫蛋白多糖譜圖中干擾譜帶少同時(shí)吸收強(qiáng)度大,說(shuō)明脫蛋白后多糖的紅外特性明顯加強(qiáng)。粗多糖在3453 cm-1附近有強(qiáng)且寬的-OH吸收峰,系多糖骨架上的-OH形成的分子間、內(nèi)氫鍵;在1628 cm-1處的吸收峰是多糖水合振動(dòng)峰;在1080 cm-1處的峰是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰。脫蛋白多糖在3400～3600 cm-1范圍內(nèi)同樣有寬而強(qiáng)的吸收峰;1733 cm-1處的吸收峰為糖醛酸的吸收峰;1630 cm-1處的吸收峰為多糖水合振動(dòng)峰;1086 cm-1處的峰為吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[22]。

圖6　蓮藕粗多糖和脫蛋白多糖的紅外光譜圖Fig.6　IR spectra of crude polysaccharides and the polysaccharides which removed protein of lotus root

2.4蓮藕多糖的DPPH自由基清除能力

由圖7可知,蓮藕多糖能有效清除DPPH自由基,且清除率隨多糖濃度(50～800 μg/mL)的增大均顯著增加(p<0.05)。在相同濃度下,脫蛋白多糖的DPPH自由基清除率均顯著高于粗多糖(p<0.05)。植物多糖的自由基清除能力大多與其分子量和糖醛酸含量呈正相關(guān)[23-25],而蓮藕多糖的DPPH自由基清除能力可能主要取決于低分子量組分中的糖醛酸含量。

圖7　蓮藕粗多糖和脫蛋白多糖的DPPH自由基清除能力Fig.7　DPPH radical scavenging activities of crude polysaccharides and refined polysaccharides of lotus root

3　結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到蓮藕多糖的最佳提取工藝參數(shù)為:提取溫度89 ℃、提取時(shí)間121 min、均質(zhì)轉(zhuǎn)速11800 r/min,在此條件下的多糖提取得率為5.88%,與回歸模型的理論預(yù)測(cè)值相近。本研究所建立的提取方法通過(guò)均質(zhì)能最大程度減小物料粒度,增大物料與溶劑的接觸面積,增大多糖的溶出效率,與傳統(tǒng)水提法相比能夠大大縮短提取時(shí)間,提高提取效率。蓮藕粗多糖經(jīng)Sevage法脫蛋白后,DPPH自由基清除能力明顯增強(qiáng),其分子量小于24.2 ku且主要由吡喃型單糖組成。

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Optimization of extraction and physicochemical property of polysaccharides from lotus root

SUN Jie1,YI Yang1,2,WANG Hong-xun1,2,WANG Li-mei2,3,MIN Ting1,2,ZHOU Min1,2,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China;2.Hubei Engineering Research Center for Fresh Food,Wuhan 430023,China;3.College of Biological & Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

Response surface methodology(RSM)was applied to optimize the extraction conditions of water-soluble polysaccharides from lotus root. The physicochemical properties of polysaccharides were then analyzed. Three independent variables,extraction temperature,extraction time and shearing speed,were chosen to establish the quadric regression equation for predicting the yield of polysaccharides. The optimum extraction conditions were obtained as follows:extraction temperature 89 ℃,extraction time 121 min and shear speed rate 11800 r/min,which led to estimated and observed values of maximal yield of polysaccharides of 5.64% and 5.88%,respectively. Crude polysaccharides extracted from lotus root were purified by Sevage method. The purified polysaccharides showed a stronger DPPH radical scavenging activity compared with the crude ones. Their molecular weights were less than 24.2 ku and mainly composed of pyranoid monosaccharides.

lotus root polysaccharides;extraction process;optimization;physicochemical property

2015-09-29

孫杰(1986-)，男，在讀碩士，研究方向：植物活性成分分析評(píng)價(jià)，E-mail：sunjsz0710@163.com。

周敏(1976-)，女，博士，副教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與安全，E-mail：mzhou268@163.com。

湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BBA203)；武漢輕工大學(xué)校立科研項(xiàng)目(2013D16)。

TS201.1

B

1002-0306(2016)12-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.040