張　悅,田錫煒,王永紅,儲　矩,莊英萍,張嗣良

(華東理工大學國家生化工程技術研究中心,上海 200237)

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擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中在線生理參數CER和RQ用于指導發(fā)酵過程優(yōu)化

張悅,田錫煒,王永紅*,儲矩,莊英萍,張嗣良

(華東理工大學國家生化工程技術研究中心,上海 200237)

生理參數二氧化碳釋放速率(CER)和呼吸商(RQ)對于深入理解生物過程的變化具有非常重要的意義。本研究以擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程為研究對象,解析了發(fā)酵過程中CER和RQ變化與細胞生長和代謝之間關系,結果表明,CER與細胞生長速率密切相關,能夠有效表征菌體的生長狀態(tài),而RQ值能很好地反映過程中代謝途徑的變化。將CER和RQ作為在線指導參數,通過分階段氮源添加策略,使得L-乳酸產率和轉化率較原始發(fā)酵工藝分別提高了5.9%和3.0%,而且副產物乙酸和乙偶姻的濃度分別下降了31.3%和24.7%。因此,通過生理參數CER和RQ的變化對發(fā)酵過程進行優(yōu)化,能夠有效地提高L-乳酸的發(fā)酵產量和質量。

擬干酪乳桿菌,乳酸,二氧化碳釋放速率(CER),呼吸商(RQ)

乳酸是一種天然存在的有機酸,在食品、化妝品、醫(yī)藥和化工行業(yè)具有非常廣泛的應用。近年來,聚乳酸產品作為傳統(tǒng)化石來源塑料的替代品,更是大大帶動了全球范圍對乳酸的需求[1-2]。

氧攝取速率(OUR)、二氧化碳釋放速率(CER)和呼吸商(RQ)分別表示細胞代謝過程中O2的消耗速率、CO2的釋放速率和兩者的比值,它們的水平能夠有效地反映細胞生理代謝狀態(tài)以及代謝通量分布,因此可以作為衡量發(fā)酵水平的重要指標[3-4]。通過OUR、CER和RQ的變化趨勢來確定細胞的代謝情況,是從宏觀和微觀尺度指導發(fā)酵過程優(yōu)化的紐帶[5]。李強等人研究了不同微生物(霉菌、酵母菌和細菌)在不同發(fā)酵體系(單液相體系、雙液相體系、純種發(fā)酵和混合發(fā)酵)下,CER的變化規(guī)律,結果表明CER的變化與體系狀態(tài)的變化有著密切的聯系,因此能夠有效、準確地把握發(fā)酵過程[6]。Zeng等人在微耗氧的2,3-丁二醇發(fā)酵過程研究中發(fā)現,RQ控制在4.46對產物合成最有利,同時轉化率也最高,而且這個值可以通過途徑的反應方程直接計算得到[7]。

雖然在過去凝結芽孢桿菌生產L-乳酸的過程中,已經引入了CER和RQ來對發(fā)酵過程的特征進行表征和分析[8],但是在乳桿菌生產乳酸的研究中仍未有報道。本研究以擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程為研究對象,通過多參數分析過程中CER和RQ的變化規(guī)律,并將其作為監(jiān)控參數跟蹤整個發(fā)酵過程,從而揭示可能存在的潛在限制因素,指導L-乳酸產量、產率和轉化率的提高。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

擬干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)為實驗室保藏菌株;葡萄糖上?；菖d生化試劑有限公司;蛋白胨(Peptone)、酵母提取物(Yeast Extract)Oxoid;牛肉提取物(Beef Extract)上海生工生物有限公司;葡萄糖試劑盒上?？迫A生物工程股份有限公司;蒸餾水實驗室自制;其它試劑來源于國藥集團化學試劑有限公司。

5 L攪拌式生物反應器上海國強生化工程裝備有限公司;pH和溶氧(DO)電極美國梅特勒-托勒多公司;752紫外可見分光光度計上海菁華科技儀器有限公司;SBA-40D生化分析儀山東省科學院;冰點滲透壓儀上海醫(yī)科大學儀器廠;MAX300-LG過程質譜儀美國Extrel質譜公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基成分種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨 10,牛肉提取物 10,酵母提取物 10,檸檬酸氫二銨 2,磷酸氫二鉀 2,乙酸鈉 4,硫酸鎂 0.2,硫酸錳 0.2,氯化鈉 0.03,硫酸鐵 0.01,碳酸鈣 25,吐溫-80 1 mL/L,氫氧化鈉調節(jié)上述溶液pH至6.0,115 ℃滅菌20 min,葡萄糖(40 g/L)與上述其它成分分開配制,115 ℃滅菌20 min;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 200,蛋白胨 13.33,酵母提取物 13.33,乙酸鈉 0.67,硫酸鎂 0.0133,硫酸錳 0.0133,氯化鈉 0.0133,硫酸鐵 0.0133,搖瓶發(fā)酵時,氫氧化鈉調節(jié)上述溶液pH至6.0,115 ℃滅菌20 min。

1.2.2培養(yǎng)條件種子培養(yǎng):用50 mL無菌水將新鮮茄子瓶斜面中的菌體懸浮,取15 mL懸浮液接種于85 mL種子培養(yǎng)基中,在37 ℃,110 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h;搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將20 mL種子培養(yǎng)液接種于80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為20%,250 mL三角搖瓶置于37 ℃,110 r/min培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24和48 h,發(fā)酵初始加入一定量碳酸鈣調節(jié)過程pH;5 L罐發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵過程中工作體積為4 L,接種量為20%,溫度和轉速分別為37 ℃和150 r/min,通氣量為0.125 vvm[9];氮源分階段添加實驗:將發(fā)酵初始添加所有氮源(13.33 g/L酵母膏和13.33 g/L蛋白胨)作為對照組,分階段補加策略為實驗組,實驗組條件為:發(fā)酵初始和發(fā)酵8 h分別添加50%對照組初始氮源濃度(6.67 g/L酵母膏和6.67 g/L蛋白胨)。上述所有實驗均進行三次平行。

1.2.3細胞生物量測定用稀鹽酸稀釋發(fā)酵液至一定濃度,在紫外可見分光光度計下測定620 nm波長時的吸光值,使得測定的光密度值(OD)處于0.2～0.8之間。細胞生物量通過細胞干重(DCW)來表示,兩者關系為:1 OD相當于0.41 g/L DCW。

1.2.4發(fā)酵液中L-乳酸、葡萄糖和乙酸、甲酸、乙偶姻的測定取一定量發(fā)酵液在5000 r/min條件下離心10 min,棄去菌體,稀釋上清液使得葡萄糖和L-乳酸濃度分別處于1和0.5 g/L以下。L-乳酸濃度通過SB-40C生物傳感分析儀進行測定,葡萄糖濃度通過試劑盒進行測定,副產物通過Agilent 1100高效液相色譜進行測定。檢測條件:色譜柱為Varian Metacarb H Plus柱(300 mm×7.8 mm),流動相為5 mmol/L硫酸,流速為0.4 mL/min,檢測溫度為50 ℃,檢測器為紫外檢測器,檢測波長為210 nm,進樣量為 10 μL。

1.2.5發(fā)酵過程中OUR、CER和RQ測定OUR、CER和RQ計算通過對發(fā)酵尾氣的分析數據計算得到。以進氣和尾氣中惰性氣體N2維持恒定建立平衡方程,求得OUR、CER和RQ的計算公式如下[10]:

式中,Fin:進氣流量(L/min);V:發(fā)酵液體積(L);Cinert in、CO2in、CCO2in:分別為進氣中惰性氣體、氧氣及二氧化碳的質量分率;CO2out、CCO2out:分別為排氣中氧氣和二氧化碳的質量分率;Pin:進氣的絕對壓強(Pa);tin:進氣的溫度(℃);h:進氣的相對濕度(%)。

1.2.6生長速率根據下述公式,選取0.2 h為時間間隔,可計算得到整個發(fā)酵過程中菌體的生長速率:

dX/dt=μ×X

1.3數據處理

生長曲線采用Origin 8.5進行擬合。

2　結果與分析

2.1擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中生理代謝特性的變化

在擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸的過程中,菌體的生長期為12 h左右,同時L-乳酸的合成與菌體生長表現出非常良好的相關性,這也證實了乳酸合成是一個生長相關系數非常高的過程(圖1A)。由于乳酸發(fā)酵過程為微耗氧發(fā)酵過程,而且菌體一直處于氧限制狀態(tài),因此其OUR水平保持在同一水平(圖1B)。但是值得注意的是,過程中CER和RQ的變化趨勢卻明顯不同于OUR,圖1(B)可以看出,CER值在發(fā)酵4 h左右開始迅速上升,并在11 h 左右達到頂峰,此后CER值開始下降,并隨著發(fā)酵的進行,其下降趨勢開始變緩。RQ是微生物CER和OUR的比值,因此其變化趨勢與CER非常相似,從初始的1.3逐漸上升至最高的9.4(9 h左右),然后再漸漸下降到發(fā)酵結束時的1.8。

CER是細胞釋放CO2的速率,它綜合表征了細胞內產生CO2途徑通量的比例,其中碳代謝主要包括磷酸戊糖途徑、檸檬酸循環(huán)以及一些涉及CO2的回補途徑等。而RQ值的變化主要受到4個因素影響,包括微生物生長、微生物維持、產物合成以及副產物合成。一般來說,有氧條件下,微生物利用葡萄糖作為碳源生長時的RQ在1左右,而且葡萄糖完全氧化時其RQ也為1。具體結合到擬干酪乳桿菌微耗氧發(fā)酵生產L-乳酸的過程,由于乳酸菌在缺少外界添加血紅素的情況下,電子傳遞鏈無法行使完全的功能,因此細胞在生長和維持時需要的能量更多是依賴于底物水平磷酸化而獲得,同時乳酸合成過程是一個生長非常相關的過程,表明發(fā)酵過程中CER和RQ值的變化更多受到產物和副產物途徑通量比例的影響。

圖1　擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中菌體生長、產酸和耗糖的變化(A)以及生理參數OUR、CER和RQ的變化(B)Fig.1　Time courses of cell growth,L-lactic acid production and glucose consumption(A),and physiological parameters OUR,CER and RQ(B)by L. paracasei

2.2生理參數CER和RQ用于指導擬干酪乳桿菌生長和代謝的分析

通過分析發(fā)酵過程中菌體生長的變化曲線(圖1A),發(fā)現其非常符合S型變化。運用Origin 8.5中S型擬合曲線(Doseresp)進行擬合后,R2能夠達到0.996。

此外,以0.2 h為間隔,計算整個發(fā)酵過程中菌體的生長速率,并將生長速率和CER進行對比(圖2),可以看出兩者的變化趨勢基本一致,都呈現先上升后下降的趨勢,而且在8.5 h左右達到頂峰。這就說明發(fā)酵過程中CER變化與菌體生長密切相關,并能有效地反映菌體生長狀態(tài)。

圖2　擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中,菌體生長速率和CER的比較Fig.2　Comparison of cell growth rate and CER in L-lactic acid production by L. paracasei

表1列出了葡萄糖代謝生成產物和副產物時的反應式和對應RQ值以及產生的ATP值。當1 mol葡萄糖經過同行乳酸轉化后理論上能產生2 mol乳酸,并伴隨2 mol ATP生成。同時這個過程既不需要氧氣也不生成CO2,所以不存在RQ值。但是當生成副產物乙酸時,其過程產生的ATP量是生成乳酸時的2倍,但也會伴隨產生4 mol NADH,從而造成還原力的不平衡,需要通過氧氣將其氧化再生成NAD+。結合胞外副產物圖譜可以發(fā)現,擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中,測得的主要副產物為乙偶姻、乙酸和甲酸(圖3)。值得注意的是,在快速生長期(0～8 h),雖然細胞會積累少量的副產物乙偶姻,但是此階段主要產生的副產物為乙酸和甲酸,其中乙酸更多積累于0～12 h快速生長期,而甲酸則基本上在4 h后開始積累。發(fā)酵初始階段,發(fā)酵液存在氧,此時丙酮酸甲酸裂解酶活性會受到嚴重抑制[11-12],因此丙酮酸更多通過丙酮酸脫氫酶體系生成乙酰輔酶A,再轉化為乙酸。當發(fā)酵4 h以后,發(fā)酵液中溶氧已經降為0,此時會有甲酸通過丙酮酸甲酸裂解酶生成,同時產生的氧氣乙酰輔酶A在轉化為乙酸的同時,可能會伴隨乙醇的合成,因此在RQ曲線上表現為RQ值迅速上升,并遠遠大于1。相比之下,穩(wěn)定期是細胞大幅度合成和積累乙偶姻的階段。有報道指出,乙偶姻作為一種中性物質,在細胞代謝中具有防止發(fā)酵液酸化,參與調解NADH/NAD+平衡以及儲存碳源的生理作用[13]。

表1　擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中,葡萄糖代謝生成相關產物的化學反應式

圖3　擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中,胞外副產物隨時間的變化Fig.3　Time courses of extracellular byproducts in L-lactic acid production by L. paracasei

>2.3分階段氮源添加策略對擬干酪乳桿菌生成L-乳酸的影響

圖4　不同氮源補加策略下,過程菌體生長速率的比較Fig.4　Comparison of process cell growth rate with different nitrogen source addition strategies

綜合上述分析,菌體在快速生長期需要更多的能量供給,通過乳酸合成途徑產生的ATP已經不能完全滿足生長的需求,進而部分通量轉向高產ATP的乙酸途徑。同時宏觀生理參數CER和RQ能夠有效地表征菌體生長和代謝途徑的變化。因此,為了提高發(fā)酵過程中乳酸發(fā)酵的效率,在接下來的實驗中,以CER和RQ的在線監(jiān)測為指導,分階段氮源添加為控制菌體生長的策略(詳見1.2.2),從而達到發(fā)酵過程優(yōu)化的目的。表2列出了實驗組和對照組各發(fā)酵參數的對比情況。兩種條件下,菌體能達到的最大生物量相差不大,分別為9.82、10.04 g/L。但是實驗組較之對照組的乳酸產量、產率和轉化率均有不同程度的提高。通過比較實驗組和對照組的過程生長速率變化(圖4),可以發(fā)現實驗組生長速率較對照組來得更為平緩,其達到生長速率最大值的時間要落后于對照組,同時最大值也更小,但是其生長時間要大于對照組,因此從側面解釋了乳酸作為生長非常相關型產物在實驗組條件下產量、產率和轉化率高的原因。相對應的,實驗組條件下CER和RQ的最大值都要明顯小于對照組,分別下降了32.5%和29.3%(表2),這也就說明在生長過程中副產物的合成也可能會少于對照組。胞外副產物的測定結果證實了實驗組條件下,雖然最終甲酸轉化率基本不變,但是乙酸和乙偶姻的轉化率分別下降了31.3%和24.7%,分階段添加氮源策略控制了菌體的快速生長,延長了生長期,使得乳酸整體產率和轉化率分別提高了5.9%和3.0%(表2)。

表2　不同氮源補加策略下,各種發(fā)酵參數的比較

3　結論

本實驗研究了擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產L-乳酸過程中CER和RQ的變化,發(fā)現CER與菌體生長密切相關,能夠有效表征發(fā)酵過程中菌體的生長狀態(tài),同時RQ能夠有效解析發(fā)酵過程中代謝途徑的變化。通過以CER和RQ為在線指導參數,分階段添加氮源后,能夠有效控制菌體的快速生長,并延長生長期,使得整體產率和轉化率分別提高了5.9%和3.0%,而主要副產物乙酸和乙偶姻含量則分別下降了31.3%和24.7%,最終達到降低副產物合成,提高發(fā)酵效率的目的。本研究將CER和RQ作為發(fā)酵指導參數應用于乳酸發(fā)酵過程優(yōu)化的策略也希望能為其它發(fā)酵的生物過程提供借鑒。

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Optimization of L-lactic acid fermentation process inLactobacillusparacaseithrough on-line physiological parameter CER and RQ

ZHANG Yue,TIAN Xi-wei,WANG Yong-hong*,CHU Ju,ZHUANG Ying-ping,ZHANG Si-liang

(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Carbon dioxide evolution rate(CER)and respiratory quotient(RQ)are two important physiological parameters for deep understanding of bioprocesses. In this study,on the basis of L-lactic acid production byLactobacillusparacasei,the relationships of CER and RQ with cell growth and metabolism were investigated. The results indicated that CER was closely related to cell growth rate,and it could characterize the cell growth status effectively. Furthermore,during the fermentation,intracellular metabolic pathway change could be well reflected by macroscopical RQ level. Through adoption of CER and RQ as online indicative parameters,and applying rational step wise nitrogen source addition strategy,overall L-lactic acid productivity and yield improved by 5.9% and 3.0%,respectively,while the primary byproducts acetic acid and acetoin decreased by 31.3% and 24.7%. On the basis of these results,both of L-lactic acid quantity and quality could be efficiently improved through on-line monitoring physiological parameters CER and RQ.

Lactobacillusparacasei;lactic acid;carbon dioxide evolution rate(CER);respiratory quotient(RQ)

2015-10-10

張悅(1985-)，女，碩士，實驗師，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail：zhangyue@ecust.edu.cn。

王永紅(1966-)，女，教授，研究方向：發(fā)酵工程、代謝工程，E-mail: yhwang@ecust.edu.cn。

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)(2013CB733600)；國家高技術研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021201)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)12-0233-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.036