郭耀華,尚鑫茹 ,岳蘭昕 ,樊曉盼,馬儷珍,*,張　玲

(1.天津農學院水產學院,天津 300384;2.天津農學院食品與生物工程學院,天津市農副產品深加工技術工程中心,天津 300384;3.天津市寬達水產食品有限公司,魚糜高值轉化及品質控制技術企業(yè)重點實驗室,天津 300304)

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鯰魚骨肉泥的酶解工藝優(yōu)化

郭耀華1,2,尚鑫茹2,岳蘭昕2,樊曉盼2,馬儷珍2,*,張玲3

(1.天津農學院水產學院,天津 300384;2.天津農學院食品與生物工程學院,天津市農副產品深加工技術工程中心,天津 300384;3.天津市寬達水產食品有限公司,魚糜高值轉化及品質控制技術企業(yè)重點實驗室,天津 300304)

利用鯰魚副產物(魚頭、魚皮、魚骨和碎肉等)制備的骨肉泥為實驗對象,以多肽得率和鈣溶出率為考察指標進行Box-Behnken響應面實驗設計,探究胃蛋白酶的酶解時間、加酶量和液料比三因素對酶解效果的影響。通過所得的結果和二次多項回歸方程確立了最優(yōu)的工藝條件:液料比(水∶骨肉泥,m∶m)是6.73∶1,胃蛋白酶的加酶量7000 U/g,酶解溫度37 ℃,pH為3.0,酶解時間6 h。此條件酶解骨肉泥得到的酶解液中,多肽得率為43.07%,鈣溶出率為44.62%。

鯰魚骨肉泥,酶解,多肽得率,鈣溶出率

鯰魚副產物包括魚頭、魚皮、魚骨和魚碎肉,這些副產物中含有豐富的蛋白質和鈣,且蛋白質組成復雜[1],其中膠原蛋白是構成動物體的重要功能物質,現(xiàn)在廣泛應用于食品、醫(yī)藥、組織工程和化妝品等領域[2]。這些副產物大多都被丟棄或加工成低價值魚粉,不僅造成環(huán)境污染,更引起極大的浪費。

多數(shù)蛋白在人體內是以短肽或者寡肽的形式被吸收[3],且鈣離子在人體內以螯合態(tài)的形式被吸收[4],所以蛋白水解產物中的鈣與多肽可以形成鈣螯合肽,促進鈣的吸收。目前市場上的補鈣制劑主要包括無機鈣、有機鈣和氨基酸螯合鈣,無機鈣、有機鈣雖然能在一定程度上緩解人體缺鈣的壓力,但都存在一定的副作用。氨基酸螯合鈣能很好地被人體吸收,但成本高、不能做到蛋白與鈣同補,多肽螯合鈣可以有效地解決這些問題。

可以通過水解的方式獲得膠原多肽,水解是使用化學或生物化學的方法將大分子的蛋白質降解成為大小不同的多肽分子[5],用于酶解的蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶等[6]。

現(xiàn)在國內外對外源蛋白酶類酶解利用富含蛋白類的食物的研究報道較多,大多是制備抗氧化肽、抑菌肽、降血壓肽、多肽螯合鈣和免疫肽等。如李亞欣[7]等用堿性蛋白酶酶解豬骨膠原制備具有抗氧化活性的肽類,研究骨膠原肽和魚皮膠原肽對機體的抗氧化能力、血脂代謝和鈣利用的影響;任小青[8]等以鯰魚骨為原料,從鯰魚骨理化性質,鯰魚骨酶解工藝優(yōu)化,鯰魚骨酶解物抑菌性能、抑菌機理及其在食品中的應用三個方面對鯰魚骨副產物高附加值利用進行了系統(tǒng)的研究;封梅[9]等采用堿性蛋白酶水解草魚蛋白制備具有血管緊張素轉化酶抑制活性的降血壓肽;付文雯[10]等以新鮮牛骨為原料,制成粉末,采用木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶分布酶解的方法確定最佳的膠原多肽生產工藝,對酶解骨渣脫鈣制備多肽螯合鈣。Won-Kyo Jung[11]等使用胃蛋白酶通過羥基磷灰石親和層析法回收狹鱈魚類加工中丟棄的骨干中的低分子量肽和具有高親和力的鈣。

本實驗前期研究了堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶對魚骨肉泥中多肽得率和鈣生物利用率的影響,研究顯示胃蛋白酶的效果較好[12]。本實驗以胃蛋白酶為研究對象,為了得到更多的多肽,需進行適度酶解,因此單因素實驗以多肽轉化率為考察指標。在單因素實驗基礎上,以多肽得率和鈣生物利用率為考察指標,采用響應面法優(yōu)化胃蛋白酶最佳酶解工藝條件,以期為得到更多的多肽螯合鈣奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

革胡子鯰魚(Clarias gariepinus)天津市紅旗水產批發(fā)市場，平均每條重(1250±25) g,30 min內鮮活運至食品加工車間進行宰殺;胃蛋白酶(酶活4.74×105U/g)、牛血清蛋白購自北京索萊寶科技有限公司;Na2HPO4、檸檬酸、氫氧化鈉、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、濃硫酸、硼酸、95%乙醇、無水乙醚分析純,購自天津市風船化學試劑科技有限公司;氧化鑭分析純,購自上?；瘜W試劑一廠;Ca標準溶液國家有色金屬及電子材料分析測試中心;硝酸優(yōu)級純。

TOMY SX-500高壓滅菌鍋日本;UDK159全自動凱氏定氮儀意大利VELP公司;AA-6300原子吸收分光光度計日本島津;ST40R冷凍離心機賽默飛世爾科技公司;WFJ 7200可見分光光度計尤尼柯(上海)儀器有限公司;MM12絞肉機廣東韶關市新通力食品機械有限公司;FA1104A分析天平上海精天電子儀器有限公司;THZ-98AB恒溫振蕩器上海一恒科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1魚骨泥的制備首先將鯰魚放入5～7 ℃水中10 min使其致暈,立即宰殺,剖肉片后,將剩余的魚頭、魚骨、魚皮及碎肉等副產物,在高壓滅菌鍋中經121 ℃(0.1 MPa)保持2 h的處理,取出后在沸水中反復煮制,不斷棄掉上層油脂,最后用1層紗布過濾,絞肉機絞碎后得到魚骨肉泥,冷凍貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2酶解工藝稱取10 g魚骨肉泥,加入一定量蒸餾水,用檸檬酸和Na2HPO4調節(jié)pH為3,加入一定量的胃蛋白酶混合均勻,密封后置于恒溫振蕩器中,轉速為170 r/min,在胃蛋白酶的最適溫度(37 ℃)和pH(3.0)條件下酶解一定時間。然后在沸水浴滅酶10 min,迅速冷卻,離心20 min(6500×g,4 ℃),收集上清液,分別測定多肽含量及鈣含量,按以下公式計算多肽得率及鈣溶出率。

式中:Y:多肽得率(%),X0:上清液中多肽濃度(g/mL),XR:鯰魚骨肉泥中蛋白質的百分含量(%),V0:上清液體積(mL),SR:鯰魚骨肉泥樣品重量(g)。

式中:Y:鈣溶出率(%),X0:上清液中鈣濃度(g/mL),XR:鯰魚骨肉泥中鈣的百分含量(%),V0:上清液體積(mL),SR:鯰魚骨肉泥樣品重量(g)。

1.2.3單因素實驗

1.2.3.1胃蛋白酶的酶解時間對魚骨肉泥中多肽得率的影響取10 g魚骨肉泥和50 mL蒸餾水,調節(jié)pH至3,加入6000 U/g(每克魚骨肉泥加6000 U胃蛋白酶)胃蛋白酶,酶解時間分別為2、3、4、5、6、7 h。

1.2.3.2液料比(蒸餾水與魚骨肉泥比例)對胃蛋白酶作用魚骨肉泥中多肽得率的影響取10 g魚骨肉泥,分別按照2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1的質量比加入蒸餾水,調節(jié)pH至3,加入6000 U/g胃蛋白酶,酶解3 h。

1.2.3.3胃蛋白酶的添加量對魚骨肉泥中多肽得率的影響取10 g魚骨肉泥和50 mL 蒸餾水,調節(jié)pH至3,分別加入2000、4000、6000、8000、10000、12000 U/g胃蛋白酶,酶解3 h。

1.2.4響應面法實驗設計在單因素實驗基礎上,通過響應面實驗設計,以酶解時間、酶添加量和液料比3個因子為自變量,分別以X1、X2和X3來表示,并以+1、0、-1分別代表自變量的高、中、低水平。以多肽得率和鈣溶出率為參考指標,分別以Y1、Y2來表示。因素水平及編碼見表1所示。

表1　響應面設計因素與水平

1.2.5指標測定方法鈣的測定參照GB/T 5009.92-2003(原子吸收分光光度法);蛋白質含量測定:參照GB/T5009.5-2003(凱氏定氮法);多肽含量測定:雙縮脲法。

1.2.5.1試劑配制方法標準蛋白溶液:稱取0.1 g牛血清蛋白定容至10 mL,配成濃度為10 mg/mL蛋白質標準溶液。

雙縮脲試劑:稱取1.5 g CuSO4和6.0 g酒石酸鉀鈉,加入500 mL蒸餾水,在磁力攪拌下加入300 mL現(xiàn)配的10% NaOH溶液,定容至1000 mL,裝于棕色試劑瓶中,4 ℃冷藏保存。

1.2.5.2樣品測定取1 mL樣品液加入4 mL雙縮脲試劑,3 mL無水乙醚,震蕩搖勻后在2 ℃下8500×g離心10 min,吸取下層溶液,540 nm下測定吸光度值,以蒸餾水作為空白,以空白溶液調零。

1.2.5.3標準曲線繪制分別吸取標準蛋白溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,再依次加入蒸餾水1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL,其它步驟同1.2.5.2。

1.2.5.4多肽濃度的測定

X1=c×f

式中:X1:酶解液中多肽濃度(mg/mL);c:測定用試樣中多肽濃度(mg/mL);f:稀釋倍數(shù)。

1.3數(shù)據(jù)處理

各個樣品測3次,取平均值,采用Microsoft Excel 2003作數(shù)據(jù)分析,利用軟件Sigmaplot 10.0繪制曲線,利用Design Expert進行響應面分析。

2　結果與分析

2.1不同酶解時間對魚骨肉泥中多肽得率的影響

胃蛋白酶的加酶量對魚骨肉泥中多肽得率的影響如圖1所示。由圖1看出,隨著酶解時間的延長,酶解前5 h多肽得率呈增長趨勢,第5 h達到最大值,隨后又不斷減小。這是因為隨著酶解時間的繼續(xù)增加,部分多肽進一步水解成氨基酸,使得多肽得率下降。鈣溶出率隨著酶解時間的增加出現(xiàn)兩次最高峰,3 h和5 h,這兩個時間的Ca溶出率差異不顯著,而5 h多肽得率明顯高于3 h,因此最終選擇酶解5 h。

圖1　不同酶解時間對魚骨肉泥中多肽得率和鈣溶出率的影響Fig.1　The effects of different enzymatic hydrolysis time on obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate

2.2不同加酶量對魚骨肉泥中多肽得率的影響

胃蛋白酶的添加量對魚骨肉泥中多肽得率的影響如圖2所示。隨著加酶量的增加,多肽得率整體呈現(xiàn)上升趨勢,中間出現(xiàn)2次峰值,分別在加酶量為6000 U/g和10000 U/g時。當加酶量出現(xiàn)第一個峰值之后多肽得率下降是由于隨著加酶量增加多肽進一步酶解為氨基酸;而之后又繼續(xù)上升并在12000 U/g時出現(xiàn)2次峰值是因為酶濃度過高導致酶的自溶,檢測結果中不僅包括膠原多肽,還包括過量的胃蛋白酶。且從圖2中還可以看出,加酶量為6000 U/g時Ca溶出率最大,所以,從經濟角度考慮選擇加酶量為6000 U/g為宜。

圖2　不同加酶量對酶解液中多肽得率和鈣溶出率的影響Fig.2　The effects of different enzyme concentration on obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate

2.3不同液料比對魚骨肉泥中多肽得率的影響

不同液料比對魚骨肉泥中多肽得率的影響如圖3所示。由圖3可以看出,隨著液料比的增加,多肽得率明顯增加,4∶1之后增加趨勢平緩,在6∶1時達到最大值,之后呈現(xiàn)下降趨勢。水作為酶解的反應介質,可以使酶和底物更好地結合,促進酶的作用。水的存在可以使酶盡快分散,防止局部酶濃度過高導致酶解產物的濃度過高,抑制酶解反應。液料比過低會使酶濃度過高,增加酶的自溶;而液料比過高會使有效的酶濃度過低,反應速率減慢。還可以看出液料比為5∶1時鈣溶出率最大,之后基本保持不變,而多肽得率在液料比為6∶1時最大,因此最終選擇液料比為6∶1為宜。

圖3　不同液料比對酶解液中多肽得率和鈣溶出率的影響Fig.3　The effects of liquid/material on obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate

2.4響應面實驗結果

響應面設計實驗結果見表2所示。實驗號1～12是析因實驗,13～17是中心實驗。17個實驗點分為析因點和零點,其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構成的三維頂點上;零點為區(qū)域中心點,重復3次以估計實驗誤差。

2.5回歸模型的建立及其顯著性分析

利用Design Expert軟件對表2中實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合,得到了酶解液中多肽得率(Y1)對自變量酶解時間(X1)、液料比(X2)和加酶量(X3)的二次多項回歸模型方程:

Y1=-63.36-5.83X1+23.23X2+0.01X3+2.65X1X2+0.004X1X3-0.003X2X3-3.18X12-1.44X22-0.000001X32。

表2　實驗設計結果

表3　多肽得率的回歸模型方差分析

注:p>0.05,不顯著;p<0.05,顯著;p<0.01,極顯著;表4同。

對該回歸方程進行方差分析,由表3方差分析可看出:回歸模型p=0.0061<0.01,表明回歸方程極顯著;而失擬項的p=0.1570>0.05,故其不顯著;而且該模型的決定系數(shù)R2=0.9110,說明它能解釋91.1%響應值的變化規(guī)律,可以得出此方程擬合程度良好,實驗誤差較小,可以用來對酶解上清液多肽得率進行測定。對回歸模型系數(shù)的顯著性分析:一次項X1的p=0.0794,X2的p=0.4832,X3的p=0.3268,表明酶解時間、加酶量、液料比對多肽得率的影響差異不顯著;二次項X1X3的p=0.0028<0.01、X2X3的p=0.0063<0.01,X1X2的p=0.0167<0.05,表明酶解時間和加酶量、液料比和加酶量兩者之間交互作用極顯著,而酶解時間和液料比之間交互作用顯著。

鈣溶出率(Y2)對自變量酶解時間(X1)、液料比(X2)和加酶量(X3)的二次多項回歸模型方程:

Y2=18.07-22.66X1+12.17X2+0.003X3+2.58X1X2-0.002X1X3+0.0002X2X3+2.34X12-1.71X22+0.0000007X32。

對該回歸方程進行方差分析,由表4可看出:回歸模型p=0.0031<0.01,回歸方程極顯著;而失擬項的p=0.3753>0.05,故不顯著;而且該模型的決定系數(shù)R2=0.9275,它能解釋92.75%響應值的變化規(guī)律,故此模型可以用來分析和預測酶解魚骨肉泥制備多肽和鈣的工藝結果。對回歸模型系數(shù)的顯著性分析:一次項X1的p=0.0047,X2的p=0.0002,X3的p=0.0611,表明酶解時間、液料比對鈣溶出率影響顯著,加酶量影響不顯著;二次項X1X2的p=0.0597>0.05,X1X3的p=0.0933>0.05,X2X3的p=0.8524>0.05,表明酶解時間和加酶量、液料比和加酶量、酶解時間和液料比兩者之間交互作用均不顯著。

表4　鈣溶出率的回歸模型方差分析

2.6響應面分析

X1和X2、X1和X3以及X1和X2兩兩之間的交互作用對多肽得率影響顯著,其響應面3D圖見圖4～圖6。

由圖4中的X1和X2交互作用曲線可以看出當X1處于低編碼值(-1,0)時,Y1隨X2的編碼值水平升高而降低,X1處于高編碼值(0,1)時,Y1隨X2的編碼值水平的升高而小幅升高。X2處于低編碼值(-1,0)時,Y1隨X1的編碼值水平升高呈先升高后下降的趨勢,X2處于低編碼值(0,1)時,Y1隨X1的編碼值水平升高同樣先升高后降低。當X1和X2同處于0編碼值時,Y1達到最大值。

圖4　酶解時間和液料比對多肽得率影響Fig.4　The effects of enzymatic hydrolysis time and liquid/material on obtained rate of polypeptide

圖5　酶解時間和加酶量對多肽得率影響Fig.5　The effects of enzymatic hydrolysis time and the amount of enzyme on obtained rate of polypeptide

由圖5中的X1和X3交互作用曲線可以看出,當X1處于低編碼值(-1,0)時,Y1隨X3的編碼值水平的升高而降低,X1處于高編碼值(0,1)時,Y1隨X3的編碼值水平的升高而升高。X3處于低編碼值或高編碼值時,Y1隨X1的變化與隨X3的變化有相同的結果。兩者在同時應用高編碼值水平或低編碼值水平時,產生明顯的交互作用。當X1和X3同處于1編碼值時,Y1達到最大值。

由圖6中的X3和X2交互作用曲線可以看出,當X3處于低編碼值(-1,0)時,Y1隨X2的編碼值水平的升高而升高,但X3處于高編碼值(0,1)時,Y1卻隨X2的編碼值水平的升高而降低。X2處于低編碼值或高編碼值時,Y值隨X1的變化與隨X2的變化有相同的結果。兩者在同時應用高編碼值水平或低編碼值水平時,產生明顯的拮抗作用。當X3處于1編碼

圖6　加酶量和液料比對多肽得率影響Fig.6　The effects of the amount of enzyme and liquid/material(s%)on obtained rate of polypeptide

值,X2處于-1編碼值時,Y1達到最大值。說明在此體系中加酶量和液料比不能同時應用高編碼值或低編碼值。X3和X2負效應顯著。

2.7驗證實驗

根據(jù)Box-Behnken實驗所得的結果和二次多項回歸方程,利用Design Expert 7.1.3軟件分析,以多肽得率和鈣溶出率為響應值得到的最佳酶解條件為:酶解時間6 h,液料比為6.73∶1,加酶量7000 U/g,得到預測值多肽得率為36.20%,鈣溶出率為49.82%。

為了檢驗模型預測的準確性,將此酶解條件再一次進行驗證實驗,在以多肽得率和鈣溶出率同時為響應值得到的最佳酶解條件下得到的多肽得率為43.07%,鈣溶出率為44.62%。

3　結論

利用鯰魚骨肉泥為實驗對象,以多肽轉化率和鈣生物利用率為考察指標,胃蛋白酶酶解的最佳條件為:液料比為6.73∶1,胃蛋白酶的加酶量7000 U/g,酶解溫度37 ℃,pH為3.0,酶解時間6 h。此條件酶解骨肉泥得到的酶解液中,多肽轉化率為43.07%,鈣溶出率為44.62%。

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Optimization of hydrolysis conditions of catfish bone paste

GUO Yao-hua1,2,SHANG Xin-ru2,YUE Lan-xin2,FAN Xiao-pan2,MA Li-zhen2,*,ZHANG Ling3

(1.The Department of Aquariculture Science of Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384,China;2.The Department of Food Science and Biological Engineering of Tianjin Agriculture University,Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Procesing,Tianjin 300384,China;3.Tianjin KUANDA Aquatic Food Co.,Ltd.,High Value Transformation and Quality Control Technology of Surimi of Enterprise Key Laboratory,Tianjin 300304,China)

It was conducted that the Box-Behnken response surface design experiment used flesh paste which were prepared of catfish by-products(fish head,skin,bones and meat,etc.)as test object and obtained rate of polypeptide and calcium dissolution rate as examining index to explore how the pepsin digestion time,enzyme dosage and liquid/material impacted the hydrolysis effect. The result showed that the optimal process conditions were liquid/material 6.73∶1,enzyme dosage 7000 U/g,hydrolysis temperature 37 ℃,pH value 3.0,reaction time 6 h. The obtained rate of polypeptide was 43.07% and calcium dissolution rate was 44.62% in the obtained hydrolyzate from hydrolysis flesh paste under optimum conditions.

catfish bone paste;enzymatic hydrolysis;obtained rate of polypeptide;calcium dissolution rate

2015-10-19

郭耀華(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：魚副產物綜合利用，E-mail:447522295@qq.com。

馬儷珍(1963-)，女，教授，研究方向：畜產和水產加工技術，E-mail:malizhen-6329@163.com。

天津市科委科技支撐項目(13ZCZDNC01600)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)12-0212-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.12.032