劉　野,蘇　杭,宋煥祿,蘇柯冉,王　鑫

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

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8種納豆揮發(fā)性香氣成分的比較研究

劉野,蘇杭,宋煥祿,蘇柯冉,王鑫

(北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

為比較不同種類納豆揮發(fā)性香氣成分的差異,本研究通過(guò)采用SPME結(jié)合GC-O-MS、感官評(píng)價(jià)分析和電子鼻技術(shù)對(duì)自制納豆與5種日本納豆和2種國(guó)產(chǎn)納豆的氣味進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,自制納豆與其他品牌的納豆相比,在香氣成分的種類上差別不大,但在整體化合物含量上與日本納豆還有一定的差距,特別是具有較強(qiáng)呈味能力的酮類和吡嗪類物質(zhì),而自制納豆中這兩類化合物含量均高于國(guó)產(chǎn)納豆。通過(guò)電子鼻分析，自制納豆與北海道納豆、燕京納豆香氣成分和整體呈現(xiàn)的香韻較為類似。

納豆,揮發(fā)性香氣化合物,GC-O-MS,感官評(píng)價(jià),電子鼻

納豆(Natto)是一種由蒸煮好的大豆經(jīng)納豆芽孢桿菌(BacilluSubtilisNatto)發(fā)酵而制成的保健食品,作為一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品,可追溯上千年歷史之久。納豆色澤棕黃,表面附著一層粘性物質(zhì),挑起時(shí)會(huì)呈現(xiàn)拉絲的狀態(tài),因其獨(dú)特的風(fēng)味和功能在日本廣受歡迎[1]。納豆具有獨(dú)特的風(fēng)味和粘性,并富含多種營(yíng)養(yǎng)成分:蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素、維生素等,因其含有納豆激酶、γ-多聚谷氨酸[2]、納豆異黃酮、超氧化物歧化酶[3]、大豆磷脂、皂苷[4]、卵磷脂、亞油酸、亞麻酸、果糖、生育酚等多種生理活性物質(zhì),能增強(qiáng)體質(zhì),提升機(jī)體免疫力。

目前,關(guān)于納豆的研究主要集中于納豆芽孢桿菌的菌種的分離篩選,及納豆功能活性的研究,而對(duì)于其風(fēng)味的研究則很少。僅有的幾篇關(guān)于納豆風(fēng)味的文獻(xiàn)也主要著眼于納豆風(fēng)味改良方面的研究。關(guān)茵等對(duì)料液比、蒸煮時(shí)間、蒸煮溫度、發(fā)酵時(shí)間和接種量等工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整以減少納豆的氨味[5]。陳文珊等研究認(rèn)為3%味精,姜汁:茶葉比例為10∶1時(shí),產(chǎn)品香氣和滋味最為協(xié)調(diào)[6]。謝元等則從工藝參數(shù)和輔料添加兩方面入手對(duì)納豆風(fēng)味進(jìn)行改良[7]。上述研究均缺少對(duì)納豆揮發(fā)性香氣成分的分析和比較。由于不同品牌納豆生產(chǎn)工藝存在一定差異，因此產(chǎn)品風(fēng)味也有較大區(qū)別。納豆風(fēng)味是其重要品質(zhì)指標(biāo)，會(huì)影響到人們對(duì)于納豆的消費(fèi)和食用。因此本研究通過(guò)對(duì)自制的納豆與市售7種納豆進(jìn)行了SPME提取結(jié)合GC-O-MS定量分析,并對(duì)自制納豆與市售納豆、日本納豆與國(guó)產(chǎn)納豆揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行比較分析,并通過(guò)電子鼻技術(shù)結(jié)合PCA對(duì)幾種納豆氣味進(jìn)行相似度分析，一方面可以確定納豆含有的揮發(fā)性香氣成分的種類和含量范圍，另一方面為納豆生產(chǎn)企業(yè)工藝改良提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1原料

表1　實(shí)驗(yàn)用納豆Table 1　Natto in this study

1.1.2試劑實(shí)驗(yàn)所用的主要試劑有系列烷烴C7～C30;標(biāo)準(zhǔn)化合物2,3-丁二酮、5-甲基-2-己酮、2-庚酮、3-羥基-2-丁酮、2-壬酮、1-辛烯-3-醇、糠醇、2-乙基丁酸、3-甲基丁酸、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、6-甲基-2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基-3-乙基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯甲醛、吡啶、2-戊基呋喃和內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮均購(gòu)置于美國(guó)Sigma-Aldrich公司,色譜純。

1.1.3儀器氣相色譜儀7890A、三重四級(jí)桿質(zhì)譜7000B美國(guó)Agilent公司；Sniffer 9000嗅味檢測(cè)儀瑞士Brechbühler公司；極性DB-Wax毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)美國(guó)J&W公司；JA2003型數(shù)字電子天平上海天平儀器廠；HH-1型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋金壇市至翔科教儀器廠；固相微萃取針(DVB/CAR/PDMS纖維層)美國(guó)Supelco公司；PEN-3型電子鼻德國(guó)Airsense公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1自制納豆的制備條件參考童軍鋒等方法[8]。該納豆制備條件為通過(guò)以納豆激酶活性為主要指標(biāo)優(yōu)化后條件。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了浸泡時(shí)間、蒸煮時(shí)間、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、后熟時(shí)間這6個(gè)工藝的最佳參數(shù)，分別為浸泡時(shí)間15 h、蒸煮時(shí)間45 min、接種量3 %、發(fā)酵溫度38 ℃、發(fā)酵時(shí)間28 h、后熟時(shí)間1 d。而后通過(guò)響應(yīng)曲面優(yōu)化出納豆激酶活性最高時(shí)的工藝參數(shù)為浸泡時(shí)間15 h、蒸煮時(shí)間51 min、發(fā)酵溫度37.5 ℃。

1.2.2靜態(tài)頂空-固相微萃取(SPME)稱取5 g納豆樣品粉碎后置入40 mL頂空瓶中,加入1 μL濃度為已配制好的濃度為0.816 μg/μL的內(nèi)標(biāo)物2-甲基-3-庚酮溶液,密封;50 ℃水浴平衡20 min;將固相微萃取針頭插入頂空瓶,推動(dòng)針頭使其處于頂空吸附狀態(tài),吸附40 min后進(jìn)樣,分流比5∶1。

1.2.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-O-MS)參數(shù)GC條件:進(jìn)樣口溫度250 ℃,采用DB-Wax和DB-5 ms兩種極性不同的色譜柱,柱溫箱升溫程序:初始溫度40 ℃,保持3 min,然后以5 ℃/min升至200 ℃,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持3 min,后運(yùn)行3 min。載氣為高純氦氣,恒定流速1.2 mL/min,分流比5∶1。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(electron impact,EI)離子源,離子源溫度230 ℃,電子能量70eV,傳輸線溫度280 ℃,四級(jí)桿溫度150 ℃,溶劑延遲為4 min,質(zhì)量掃描范圍35～350 AMU,掃描時(shí)間200 ms,檢測(cè)電壓350 V。

嗅聞方法:嗅覺(jué)檢測(cè)器接口溫度為200 ℃,毛細(xì)管柱末端分離出的化合物以1∶1分流比分別進(jìn)入MS與嗅聞檢測(cè)儀。由3名專業(yè)嗅聞實(shí)驗(yàn)員在嗅聞檢測(cè)儀前通過(guò)嗅聞?dòng)涗浵銡饣衔锏谋Ａ魰r(shí)間,氣味強(qiáng)度以及氣味特征。

1.2.4化合物定性本實(shí)驗(yàn)中化合物的定性是由嗅聞、NIST譜庫(kù)分析以及線性保留指數(shù)(RI值)3種方法結(jié)合共同來(lái)定性分析。

1.2.4.1嗅聞定性單一的未知化合物從GC-MS中分離出來(lái),進(jìn)入嗅聞口,3名嗅聞人員通過(guò)對(duì)化合物的嗅聞來(lái)記錄化合物的保留時(shí)間和氣味特征,并最終共同來(lái)確定其香氣特征。

1.2.4.2質(zhì)譜(MS)定性未知化合物信息通過(guò)Masshunter Workstation數(shù)據(jù)處理軟件采集并處理,在NIST譜庫(kù)2.0中進(jìn)行檢索,匹配度較高的幾種作為可能的化合物。

1.2.4.3線性保留指數(shù)(RI值)定性以正構(gòu)烷烴C6～C25的混合標(biāo)品通過(guò)與樣品相同的升溫程序,并通過(guò)樣品中各化合物的保留時(shí)間與各正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間計(jì)算出RI值,并與標(biāo)準(zhǔn)RI值進(jìn)行比對(duì),從而對(duì)化合物定性。RI值的計(jì)算公式:

注:ta為未知化合物a的保留時(shí)間,tN為正構(gòu)烷烴CN的保留時(shí)間,樣品的保留時(shí)間需落在正構(gòu)烷烴CN和CN+1之間。

1.2.5化合物定量本實(shí)驗(yàn)采用模糊定量與相對(duì)校正因子來(lái)對(duì)化合物進(jìn)行精確定量,相對(duì)校正因子由單點(diǎn)校正法得到。將質(zhì)譜的掃描條件改為選擇離子掃描(SIM)。相對(duì)校正因子計(jì)算如下:配制合適濃度的混標(biāo)和內(nèi)標(biāo),通過(guò)GC-MS/SCAN,確定每個(gè)化合物的出峰時(shí)間以及特征離子,然后再通過(guò)GC-MS/SIM,確定每個(gè)化合物精確的峰面積[9]。

每個(gè)化合物的相對(duì)較正因子的計(jì)算公式:

注:fi是被鑒定出的每個(gè)化合物的相對(duì)校正因子;mi和ms分別是化合物標(biāo)品和內(nèi)標(biāo)的濃度;Ai和As分別是化合物標(biāo)品和內(nèi)標(biāo)的峰面積。

1.2.6納豆感官評(píng)定方法納豆風(fēng)味感官評(píng)定由經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的7人完成,品評(píng)需在安靜、無(wú)味的環(huán)境下進(jìn)行。品評(píng)前一小時(shí)需禁止評(píng)定人員進(jìn)食氣味較大或影響品評(píng)感官的食物。品評(píng)期間獨(dú)自完成。切換樣品時(shí),溫水漱口,間隔5min。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用5分制,無(wú)法感受到記為0分,能強(qiáng)烈感受到為5分。稱取各樣品10g置于40mL頂空瓶中,嗅聞,評(píng)分。

1.2.7電子鼻技術(shù)樣品測(cè)試方法電子鼻檢測(cè)利用10種對(duì)不同化合物敏感程度不同的傳感器陣列,詳見(jiàn)表4。

表2　感官鑒評(píng)對(duì)應(yīng)模型Table 2　Model applied in sensory evaluation

表4　不同種類納豆間香氣成分含量的分析Table 4　The volatile compound content of eight kinds of natto

續(xù)表

表3　電子鼻傳感器信息Table 3　Sensor Information of electronic nose

取3 g納豆樣品置于40 mL頂空瓶?jī)?nèi),密封待測(cè)。電子鼻采樣時(shí)間為1s/組;傳感器自清洗時(shí)間為300 s,在換不同樣品時(shí),清洗時(shí)間600 s;樣品準(zhǔn)備時(shí)間5 s;傳感器歸0時(shí)間10 s;進(jìn)樣流量300 mL/min;分析采樣時(shí)間120 s。

1.2.8數(shù)據(jù)分析方法主成分分析(PCA)方法是將所提取的傳感器多指標(biāo)的信息進(jìn)行轉(zhuǎn)換和降維,并對(duì)降維后的特征向量進(jìn)行線性分類,最后在PCA分析的散點(diǎn)圖上顯示主要得兩維散點(diǎn)圖。

2　結(jié)果與討論

2.1氣相-嗅聞-質(zhì)聯(lián)用(GC-O-MS)對(duì)不同納豆香氣成分分析

由表4所示,不同的品牌納豆間的香氣成分組成也各不相同。這是由于納豆發(fā)酵過(guò)程中,原料、發(fā)酵菌種和生產(chǎn)工藝都會(huì)影響發(fā)酵的過(guò)程,進(jìn)而改變香氣成分的組成。在納豆中,共有9大類別的化合物,由于醚類和醛類化合物檢測(cè)出的含量極少,只有竹炭和完熟納豆中檢測(cè)到含量只有55.91、47.90 ng/g的二甲醚,而醛類物質(zhì)只在竹炭納豆和完熟納豆中檢測(cè)到,給香氣體系中增添青香與水果香味。其他類物質(zhì)中主要是呋喃類、惡唑類和麥芽酚,分別提供熟大豆味、烤香味和奶油味,因其在納豆中含量較少,圖中未顯示。

化合物總體含量中,竹炭納豆中酮類、酯類、醇類的含量均較高,提供更多的酸香、奶香和果香香韻。完熟納豆的吡嗪類、酸類和芳香族類的含量居高,在8種納豆中,完熟納豆是唯一的碎納豆,其加工工藝較為特殊,完熟納豆是將之前豆粒切碎為1/6左右,所以在菌種發(fā)酵時(shí)可以利用大豆內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)成分,接觸面積也更大,所以發(fā)酵得更徹底,而吡嗪和酸類是發(fā)酵后期的產(chǎn)物,完熟納豆中的酸為異丁酸和2-甲基己酸,與其他納豆以2-乙基丁酸作為主要酸成分的構(gòu)成也不同。

圖1　不同種類納豆間化合物含量比較分析圖Fig.1　Comparative analysis of volatile compound content in eight kinds of natto

如圖1所示,實(shí)驗(yàn)自制的工藝納豆與其他品牌的納豆相比,在香氣成分的種類上差別不大,但在整體化合物含量上與日本納豆還有一定的差距,風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的酮類、吡嗪類物質(zhì)與日本納豆在含量上有不小的差距,但高于國(guó)產(chǎn)納豆。不過(guò)自制的納豆在某些化合物含量上例如2-丁酮、吡啶、6-甲基-2-庚酮、2-壬酮、2-乙基丁酸的含量均為最高,且有3種化合物(+)-檸檬烯、4-甲基嘧啶、和2,6-二甲基吡嗪只在自制納豆中檢測(cè)出,分別代表橙子香氣、烤香與堅(jiān)果味。

2.2不同種類納豆感官評(píng)價(jià)結(jié)果

如圖2所示,感官評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出,在納豆的風(fēng)味輪廓中,堅(jiān)果香、焦糖香、焙烤香、酸味、霉腐味是主要的風(fēng)味構(gòu)成,而甜味、奶香、果香的香韻相對(duì)較弱。自制納豆的酸味和霉腐味是較為突出的,堅(jiān)果香氣和奶香味也相對(duì)較強(qiáng),而焙烤香較弱。

圖2　不同種類納豆間氣味輪廓比較分析圖Fig.2　Comparative analysis of odor profile in eight kinds of natto

從儀器檢測(cè)與感官鑒評(píng)結(jié)合來(lái)看,酸類化合物雖然在含量上不高,但在感官鑒評(píng)中酸味卻很明顯,在嗅聞中首先呈現(xiàn)的就是酸味,推測(cè)在不同氣味混合的體系中,人對(duì)酸的感官較為敏感,且在香氣復(fù)雜的情況下,酸味可以較好地辨別。一個(gè)比較反常的現(xiàn)象,在本場(chǎng)水戶納豆和御城納豆中均沒(méi)有檢測(cè)出酸類物質(zhì),但兩者卻呈現(xiàn)出酸味,且前者比后者強(qiáng)很多,推測(cè)在納豆中酸的香韻并不只有酸類提供,有酸味香韻的酮類,例如3-羥基-2-丁酮均會(huì)提供一定的酸感,但酮類的酸味較為柔和,而酸類物質(zhì)較為尖刺。另外,從自制納豆和昆布納豆對(duì)比來(lái)看,酸類物質(zhì)的增加會(huì)使霉腐味更加凸顯,使整體呈現(xiàn)為一種酸臭味。而從本場(chǎng)水戶納豆與御城納豆對(duì)比來(lái)看,御城納豆中不含酸類,但仍呈現(xiàn)較強(qiáng)的霉腐味,這是由于沒(méi)有適量酸味的掩蓋,焙烤味很強(qiáng)烈的同時(shí),腐敗味、氨味愈加明顯。而昆布納豆中,酸的含量適宜,腐敗感較弱,所以,較高或較低的酸含量均會(huì)促進(jìn)腐敗感的增強(qiáng),而合適的酸含量則會(huì)抑制腐敗感,呈現(xiàn)一種釀香、醬香。

在分析中還發(fā)現(xiàn),呈現(xiàn)干酪似霉腐味的物質(zhì)主要為2-乙基丁酸,通過(guò)御城納豆中并不含酸類物質(zhì),只含有相對(duì)酸類含量高的吡嗪類成分,卻氨味、腐敗感依然很強(qiáng)的現(xiàn)象來(lái)看,腐敗味的來(lái)源不只有酸類提供,含有兩個(gè)N原子的吡嗪類物質(zhì)才是人們所形容納豆“氨味”的主要來(lái)源,幾種含N的吡嗪物質(zhì)富集會(huì)整體呈現(xiàn)腐霉味,這也是在感官上本不該出現(xiàn)的不良?xì)馕兜闹饕獊?lái)源。

2.3電子鼻對(duì)不同種類納豆香氣成分分析

如圖3所示,電子鼻檢測(cè)到的納豆樣品氣味信號(hào)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)PCA分析,其中主成分1和主成分2的累積方差貢獻(xiàn)率為99.62%,整體累積方差大于85%,說(shuō)明通過(guò)PC1-PC2的二維判別圖可以很好地代表樣品的主要信息特征。以兩個(gè)主成分的0坐標(biāo)界為軸可以看出幾種納豆處于第一象限與第四象限,呈簇狀聚集的樣品說(shuō)明其風(fēng)味的差別較小,實(shí)驗(yàn)自制、北海道、燕京、本場(chǎng)水戶四種納豆呈簇狀聚集,風(fēng)味相似度較高,作為第一組群;御城納豆與其他樣品差別較大,只和完熟納豆有略微的交集,作為第二組群;完熟納豆與昆布納豆有較大的交集,香氣組成上有一定的相似度,作為第三組群;竹炭納豆與其他樣品均不同,作為第四組群。

圖3　8種納豆氣味特征主成分分析(PCA)圖Fig.3　Principal component analysis of odor characteristic in eight kinds of natto

由圖3可知,電子鼻PCA分析與之前的結(jié)論較為相符,御城納豆與竹炭納豆與其他樣品差別較大的原因是御城納豆中不含酸類,且只在其中檢測(cè)出2-乙基-6-甲基吡嗪。而竹炭納豆的特征風(fēng)味組分中,具有酸奶香、干酪香韻的3-羥基-2-丁酮含量很高,是其區(qū)別于其他納豆的主要成因。

本論文自制納豆與北海道納豆、燕京納豆有很大的交集,說(shuō)明這三種樣品的風(fēng)味差別較小,也說(shuō)明自制納豆與北海道納豆中香氣成分和整體呈現(xiàn)的香韻較為類似。

3　結(jié)論

通過(guò)GC-O-MS對(duì)幾種納豆樣品揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行定量分析得出：竹炭納豆中的酮類、酯類、醇類物質(zhì)均最高，完熟納豆中吡嗪類、酸類、芳香族類含量均最高。

通過(guò)感官鑒評(píng)得出如下結(jié)論：納豆中酸類含量在整體風(fēng)味中較低，感官上卻異常明顯，酸類物質(zhì)含量對(duì)整體風(fēng)味的感官上有較大影響，含量過(guò)高或過(guò)低均會(huì)使霉腐味加重；在呈酸味的化合物中，酮類物質(zhì)也起到很大的作用；腐霉味的來(lái)源有兩個(gè)途徑，以2-乙基丁酸為主的酸類物質(zhì)與2,5-二甲基吡嗪為主的吡嗪類物質(zhì)。

通過(guò)電子鼻PCA分析得出：自制納豆與北海道納豆、燕京納豆較為相似，御城納豆、竹炭納豆的風(fēng)味與其他納豆有較大的區(qū)別。

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Comparative study of volatile aroma compounds in eight kinds of natto

LIU Ye,SU Hang,SONG Huan-lu,SU Ke-ran,WANG Xin

(School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology and Business University,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing 100048,China)

In order to compare the difference of volatile compound in different kinds of natto,self-make natto,5 kinds of natto from Japan,and 2 kinds of natto from China were analyzed by SPME-GC-O-MS,sensory evaluation,and electronic nose. Results showed that there was no difference between self-make and the other kinds of natto on compound type,but the whole compound content of self-make natto were less than that of natto from Japan,especially ketone and pyrazine,which were more than that of natto from China. By PCA,there was large intersection among self-make,Hokkaido,and Yanjing natto,suggesting that the three kinds of natto had similar middle note.

natto;volatile aroma compounds;GC-O-MS;sensory evaluation;electronic nose

2015-06-15

劉野(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：食品風(fēng)味化學(xué)，E-mail:liuyecau@126.com。

北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(IDHT20130506)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)05-0302-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.052