楊文雅,李長征,張海暉,張　迪,蔡梅紅,王　佳,段玉清

(江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212000)

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蛹蟲草多糖的亞臨界水萃取及其抗氧化活性研究

楊文雅,李長征,張海暉,張迪,蔡梅紅,王佳,段玉清*

(江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212000)

以蛹蟲草為原料,通過單因素和響應面分析實驗對亞臨界水提取蛹蟲草多糖的工藝條件進行優(yōu)化并對所得到的多糖進行結構鑒定和抗氧化活性測定。結果表明,優(yōu)化得到的最佳提取條件為:pH為8,提取溫度180 ℃,水料比為21∶1(mL/g),萃取時間為13 min時,萃取得率為7.13%,與傳統(tǒng)熱水浸提法相比,亞臨界水浸提法在提取得率和提取時間方面均具有明顯的優(yōu)勢(傳統(tǒng)熱水浸提法分別為1.72%,180 min)。傳統(tǒng)熱水浸提法和亞臨界水浸提法得到的蛹蟲草多糖均具有一定的還原能力,并且其DPPH·清除作用的IC50值分別為0.324、0.314 mg/mL。紅外光譜分析表明熱水浸提和亞臨界水浸提得到的蛹蟲草多糖具有相同的結構特征。

蛹蟲草,多糖,亞臨界水,抗氧化

亞臨界水(Subcritical water extract,SWE)是指溫度介于100～374 ℃之間,在一定壓力下能維持液體狀態(tài)的水[1-3],并且隨著溫度的升高,水的極性、表面張力和黏度都急劇下降,對中極性和非極性化合物的溶解能力會大大增加,其性質更接近于有機溶劑[4]。與現(xiàn)有的超臨界CO2萃取技術相比,亞臨界水萃取技術具有成本低廉,設備簡單,可以選擇性連續(xù)提取不同極性化合物及操作簡便等優(yōu)點[5],是一種具有潛力的綠色提取技術。目前,亞臨界水萃取技術已在揮發(fā)油、多酚類物質、多糖、黃酮和花青素等有效成分的提取中得到了廣泛應用[6],但蛹蟲草多糖的亞臨界水萃取尚未見報道。

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又稱北冬蟲夏草,蛹草菌,蛹草等。其中含有蟲草酸、蟲草素和蟲草多糖以及超氧化物歧化酶等多種生物活性物質,具有抗氧化、增強免疫、抗炎、抗腫瘤以及延緩衰老等生理功效[7-8]。蛹蟲草多糖(Cordyceps militaris polysacchaide,CMP)是蛹蟲草中的重要的活性物質,具有抗腫瘤、抗氧化、增強免疫功能等作用,具有廣闊的開發(fā)前景[9],在目前的研究中主要采用水提法和無水乙醇沉淀法相結合的方法提取蛹蟲草多糖,并加以超聲波輔助和微波輔助等方法來提高多糖的提取率,進行進一步的研究。

本文利用亞臨界水萃取技術,研究蛹蟲草多糖的萃取技術參數,確定最佳工藝,并對亞臨界水萃取的蛹蟲草多糖的抗氧化活性及其初級結構進行研究。以期解決傳統(tǒng)熱水浸提多糖溶出率低的技術問題。為蛹蟲草資源的綜合開發(fā)利用提供理論依據和參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蛹蟲草干燥蛹蟲草菌絲體由徐州鴻宇農業(yè)科技有限公司提供。

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、鹽酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、過氧化氫等均為分析純,購于上海國藥集團化學試劑有限公司。

BS224S型電子天平Sartorius Germany;HH-S4數顯恒溫水浴鍋江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠;GSH型亞臨界水反應釜鎮(zhèn)江丹徒環(huán)球機電配件廠;UV-265FW紫外可見分光光度計 Shimadzu Co. Japan;DL-5C離心機上海安亭有限公司;Avatar 360 FT-IR傅立葉變換紅外光譜儀美國Nicolet公司。

1.2實驗方法

1.2.1蛹蟲草多糖的測定方法采用苯酚硫酸法[10]。準確稱取標準葡萄糖10 mg于100 mL容量瓶中,加蒸餾水至刻度,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL,各以水補至2.0 mL,然后加入6%苯酚(現(xiàn)配)1.0 mL及濃硫酸5.0 mL,靜置10 min,搖勻,室溫放置20 min以后于490 nm測吸光度,以2.0 mL蒸餾水按同樣顯色操作作為空白,以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,進行線性回歸得到標準曲線方程。

蛹蟲草多糖的提取得率(%)=提取液中蛹蟲草多糖的質量/蛹蟲草菌絲體干粉的質量×100

1.2.2蛹蟲草多糖中總多酚的測定采用Folin-clocalteau法[11],以沒食子酸為標準品,配制成濃度梯度為12.5、25、50、100、150、200 μg/mL 6個樣液,將Folin試劑取出一定體積稀釋10倍,取該稀釋液4 mL加入到1 mL樣液中,然后加入5 mL 7.5%的碳酸鈉溶液,25 ℃靜置2 h后在765 nm測定吸光度,并以吸光度為縱坐標,沒食子酸濃度為橫坐標,得到總多酚含量的標準曲線方程。

1.2.3亞臨界水萃取蛹蟲草多糖的單因素實驗以蛹蟲草的多糖得率為實驗指標,對影響多糖得率的pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、溫度(100、120、140、160、180 ℃)、浸提時間(4、8、12、16、20 min)、水料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 mL/g)4個因素進行單因素實驗,并確定最佳的工藝參數。

1.2.4亞臨界水萃取蛹蟲草多糖的響應面分析實驗參考以上單因素實驗所得結果,選取釜液pH、提取溫度、提取時間和水料比為四個考察因素,利用Box-Behnken方法,選取4個中心點進行29組實驗,實驗設計見表1。

表1　實驗因素水平表Table 1　Table of factors and levels

1.2.5蛹蟲草粗多糖提取工藝參照文獻方法[12],在90 ℃,180 min,水料比20∶1 mL/g的條件下進行傳統(tǒng)熱水浸提。脫脂蟲草粉末→熱水浸提→離心→上清液→濃縮→乙醇沉淀→脫蛋白→透析→冷凍干燥→蟲草多糖粗提物。

在最優(yōu)工藝條件下進行亞臨界水浸提。脫脂蟲草粉末→亞臨界水浸提→離心→上清液→濃縮→乙醇沉淀→脫蛋白→透析→冷凍干燥→蟲草多糖粗提物。

1.2.6還原能力的測定參照文獻方法[13],將兩種蛹蟲草多糖提取物配制成不同的質量濃度,取多糖溶液1 mL于試管中,分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH6.6)和2.5 mL 1%的鐵氰化鉀溶液,搖勻,在50 ℃保溫20 min后取出,快速冷卻,加入2.5 mL 10%的三氯乙酸,混勻后離心(3000 r/min)10 min,取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液,混勻后,在700 nm處測定吸光度。吸光度越大,表明樣品還原能力越強。用蒸餾水作為空白對照。

1.2.7DPPH·清除率的測定參見文獻[14],將兩種蛹蟲草多糖提取物配制成不同的質量濃度,取多糖溶液2 mL于試管中,加入2 mL DPPH·無水乙醇溶液(0.2 mmol/L),混勻后在室溫下避光反應30 min,于517 nm處測定吸光度,記為Ax。空白組為2 mL無水乙醇代替DPPH溶液,加入2 mL多糖樣品,在517 nm下測定吸光度,記為Ax0。對照組分別加入2 mL DPPH溶液,2 mL無水乙醇,在517 nm下測定吸光度,記為A0。對DPPH·清除率計算公式如下:

清除率(%)=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100

1.2.8紅外光譜掃描取少量熱水及亞臨界水萃取的粗多糖,與100～200 mg經干燥的KBr粉末在紅外燈下于瑪瑙研缽中輕輕研磨均勻。經壓片機壓成薄片,進行紅外光譜測定。

2　結果與分析

2.1蛹蟲草提取物中多糖和多酚的含量測定

2.1.1苯酚硫酸法測定總糖的標準曲線如圖1所示,葡萄糖在0.00～60 μg范圍內,其濃度與吸光度線性關系良好。經線性回歸,標準曲線方程為A=0.00749C-0.01786(R2=0.9914)

式中:C-葡萄糖濃度((g/mL);A-吸光值(OD490)。

圖1　總糖標準曲線Fig.1　The standard curve of total polysaccharide

2.1.2Folin-clocalteau法測定總多酚的標準曲線根據標準沒食子酸的濃度及其對應的吸光值的關系,得到的總多酚濃度的標準曲線如圖2,經線性回歸,總多酚含量的標準曲線方程為:Y=0.0054C-0.0198(R2=0.9949),式中:C-沒食子酸((g/mL);A-吸光值(OD765)說明沒食子酸在此濃度范圍內和吸光度線性關系良好。

圖2　總多酚標準曲線Fig.2　The standard curve of total polyphenol

從標準曲線中計算得到蛹蟲草提取物中多糖和多酚含量如表2所示。由表中可知,亞臨界水浸提法得到的總糖和總酚含量均略高于熱水浸提法,這與亞臨界水本身的強溶解和強分解能力是分不開的,并且亞臨界水提取可以在數分鐘的短時間內完成,較傳統(tǒng)熱水提取法具有較高的效率。

表2　蛹蟲草提取物中多糖和多酚含量Table 2　Polysaccharide and polyphenol content of cordyceps militaris extract

2.2單因素實驗結果與分析

2.2.1pH對多糖得率的影響pH對多糖得率的影響如圖3所示,蟲草多糖的提取得率在pH變化的范圍內隨pH的增大先增大后減小,當pH=7時,提取得率達最大,并且過酸或者過堿都會對蟲草多糖的穩(wěn)定性產生影響,因此綜合考慮選擇pH7左右為宜。

圖3　pH對多糖得率的影響Fig.3　Influence of pH on the yield of polysaccharide

2.2.2溫度對多糖得率的影響溫度對多糖得率的影響如圖4所示,在溫度變化范圍內隨提取溫度的升高,蟲草多糖的提取得率先增加后減小,分析認為溫度過高,不利于多糖的提取,而且溫度太高會破壞多糖的結構并致使多糖分解或有其它物質溶出,從而導致提取得率的降低,而溫度過低時,浸提不完全[15],因此從得率和節(jié)能方面綜合考慮選擇最適提取溫度為160 ℃。

圖4　提取溫度對多糖得率的影響Fig.4　Influence of extracting temperature on the yield of polysaccharide

2.2.3浸提時間對多糖得率的影響浸提時間對多糖得率的影響如圖5所示,在提取時間達到12 min之前,多糖的提取得率隨著時間的延長而提高,但再增加時間,多糖的提取得率有所下降,可能是因為多糖在水中浸提時間過長,破壞它的結構,導致多糖含量減少,綜合考慮選取提取時間12 min左右為宜。

圖5　提取時間對多糖得率的影響Fig.5　Influence of extracting time on the yield of polysaccharide

2.2.4水料比對多糖得率的影響水料比對多糖得率的影響如圖6所示,隨著水料比的增加,蟲草多糖的提取得率先增大后減小,當達到30∶1(mL/g)時,蟲草多糖的提取得率最大。在提取過程中若水料比太小,提取不完全,水料比過大,會降低了提取液中固形物的含量,不利于后續(xù)操作。綜合蟲草多糖提取得率考慮,選擇水料比為30∶1(mL/g)左右為宜。

圖6　水料比對多糖得率的影響Fig.6　Influence of water-to-material ratio on the yield of polysaccharide

2.3響應面實驗結果和方差分析

在單因素實驗結果的基礎上,利用Box-Behnken對影響蛹蟲草多糖亞臨界水提取效果的因素進行響應面分析實驗,并對實驗結果進行統(tǒng)計分析,結果如表3。

表3　響應面分析方案及結果Table 3　Scheme and results of response surface analysis

表4　回歸模型方差分析Table 4　Analysis of variance for the fitted regression model

以蛹蟲草多糖提取率為響應值(Y),通過Design-Expert 7.1.3統(tǒng)計軟件對實驗結果進行回歸分析,并剔除不顯著項,得到的回歸方程簡化為:

Y=4.92+0.41X2-0.52X1X3-0.50X1X4-0.77X2X3-0.70X2X4-0.67X3X4+1.01X22-0.44X32+0.42X42。

對此回歸模型進行方差分析,結果如表4所示。從表4中可知,該模型的F=22.66,p<0.0001,高度顯著;失擬項p=0.6855>0.05,說明失擬項相對于誤差項不顯著;決定系數R2=0.9577,說明該模型的擬合性較好,可用此模型來分析和預測多糖亞臨界水提取的工藝參數。由表5可知,一次項X2,交互作用項X1X3、X1X4對蛹蟲草多糖提取率影響顯著,二次項X22、X32、X42,交互作用項X2X3、X2X4、X3X4對多糖提取率影響極顯著,通過對各影響因素進行F值檢驗,得到因素之間貢獻作用依次是溫度(X2)>萃取時間(X1)>pH(X3)>水料比(X4)。

通過響應面分析得出最佳提取條件為:提取溶液pH為7.87,提取溫度179.37 ℃,水料比為20.61∶1(mL/g),萃取時間為13.11 min。在此條件下,蛹蟲草提取得率理論值可達7.71%?？紤]到實際操作,將多糖提取條件修正為pH為8,提取溫度180 ℃,水料比為21∶1(mL/g),萃取時間為13 min,實際測得蛹蟲草多糖得率為7.13%。因此,采用RSA法優(yōu)化得到的提取工藝參數準確可靠,具有實用價值。然而,普通熱水提取多糖的得率只有1.72%。

2.4蛹蟲草多糖還原能力測定

還原力的測定是用來評價抗氧化劑活性的常用方法,可通過測定還原力的大小來說明其抗氧化活性的大小[16]。從圖7以看出,在濃度為0.6～1.5 mg/mL范圍內,還原能力均隨濃度的增加而增大,與同濃度的VC相比,蛹蟲草多糖所表現(xiàn)出的還原力相對較弱。從圖中還可以看出兩種方法浸提得到的多糖還原能力相當,這可能是由于兩種多糖提取物中總酚及總糖含量相當,且有研究表明多糖的還原能力與其中含有的酚類物質含量有關[17],螯合了較多的金屬離子,從而影響了粗多糖的還原能力。

表5　回歸系數的顯著性檢驗Table 5　Significance test of each regression coefficient

圖7　還原能力的測定Fig.7　Effect of reduction capacity

注:*顯著性水平5%;**顯著性水平1%。

2.5蛹蟲草多糖對DPPH·的清除

DPPH·是一種比較穩(wěn)定,可以長時間保存的有機物自由基,廣泛被用來測定純抗氧化劑或植物提取物的體外抗氧化活性。從圖8可以看出,VC與蛹蟲草多糖均具有良好的DPPH·清除能力,在0.2～1.0 mg/mL范圍內其對DPPH·的清除能力隨濃度的升高而增強,當濃度為1.0 mg/mL時,VC的清除能力是98.8%,熱水和亞臨界水多糖的清除率分別為84.23%和85.02%,較VC的弱。且亞臨界水提取的多糖清除能力略高于熱水提取的多糖,其IC50值分別為0.314和0.324 mg/mL,可能是由于亞臨界水處理使高分子量的多糖斷裂,產生較多的羥基基團以提供與DPPH·孤對電子配對的質子,進而影響了對自由基的清除能力[18]。

圖8　DPPH·的清除Fig.8　Effect of elminating DPPH

2.6紅外光譜分析

根據糖類化合物在紅外光譜圖上呈現(xiàn)的特殊吸收,可以判斷單糖類型,糖苷鍵連接方式及其功能基團等[19]。圖9是兩種多糖的紅外光譜圖,在3600～3200,3000～2800,1400～1200和1200～1000 cm-1區(qū)域之間是多糖的特征吸收峰,其中3300 cm-1左右處強而大的吸收峰是O-H的伸縮震動引起的,2900 cm-1及1400 cm-1處弱而小的峰分別是C-H的伸縮震動及彎曲震動引起的[20-21],在1650 cm-1左右的強吸收是糖分子中結合水的吸收,在1080 cm-1左右區(qū)域的比較大的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動引起的,其中一種屬于C-O-H,另一種則屬于糖環(huán)的C-O-C[22],在350～600 cm-1之間區(qū)域是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[23],從兩種多糖的紅外圖譜可以推測出兩者是吡喃型糖類,并且在結構上沒有明顯差異,因此,經亞臨界水處理后,多糖的結構并未受到影響。

圖9　兩種蛹蟲草多糖紅外光譜分析圖Fig.9　Infrared spectrum of two kinds of cordyceps militaris polysaccharide注:A:熱水浸提蛹蟲草多糖;B:亞臨界水浸提蛹蟲草多糖。

3　結論

通過單因素和響應面分析實驗得到的亞臨界水萃取蛹蟲草多糖的最佳工藝參數是:pH為8,提取溫度180 ℃,水料比為21∶1(mL/g),萃取時間為13 min,多糖得率為7.13%。與熱水浸提法提取多糖相比,亞臨界水具有省時節(jié)能、產率高的優(yōu)點,這些優(yōu)點是因為亞臨界水本身具有的強溶解和強分解能力。對傳統(tǒng)熱水浸提和亞臨界水浸提得到的兩種多糖進行抗氧化活性實驗表明兩種多糖都具有一定的還原能力,其DPPH·清除作用的IC50值分別為0.324、0.314 mg/mL。對兩種多糖的紅外光譜分析表明,亞臨界水處理并未對多糖的結構產生影響,且均具有多糖的特征吸收峰。

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Study on the optimization for the extraction and antioxidant activity of polysaccharide from cordyceps militaris by subcritical water

YANG Wen-ya,LI Chang-zheng,ZHANG Hai-hui,ZHANG Di,CAI Mei-hong,WANG Jia,DUAN Yu-qing*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212000,China)

The extraction condition of polysaccharide from cordyceps militaris by subcritical water was optimized using the single factor and response surface methodology and composition analysis and determination of antioxidant activity of polysaccharide from cordyceps militaris were studied. The results showed that the optimum extraction parameters obtained from response surface analysis were as follows:the ratio of polysaccharide in the extracts was 7.13% at pH value 8,180 ℃ for 13 min with the liquid-solid ratio of 21∶1(mL/g). Compared with the traditional hot water extraction,subcritical water extracting polysaccharide from cordyceps militaris had obvious advantage in saving time,extraction ratio(the methods of alkaline water was 7.13%,180 min). Cordyceps militaris polysaccharide by traditional hot water extraction and subcritical water extraction had certain reducing power and the role of the DPPH· clearing IC50value concentration were 0.324 mg/mL and 0.314 mg/mL.Infrared spectrometry analysis showed that polysaccharide from cordyceps militaris by hot water extraction and subcritical water extraction had the same structure features.

cordyceps militaris;polysaccharide;subcritical water;antioxidant

2015-07-15

楊文雅(1988-)，女，碩士研究生，研究方向:食品營養(yǎng)，E-mail:478451588@qq.com。

段玉清(1973-)，女，博士，教授，研究方向：食品營養(yǎng)，E-mail:dyq101@ujs.edu.cn。

國家自然科學基金(31201346)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)05-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.041