鐘　浩,王　亮,*,劉克營,郭愛珍,胡　曼,劉朋龍,齊向輝,蔡梅紅

(1.江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.新疆天潤生物科技股份有限公司,新疆烏魯木齊 830088)

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開菲爾粒中主要組成菌的分離鑒定及微囊化純培養(yǎng)混合發(fā)酵指標分析

鐘浩1,王亮1,*,劉克營1,郭愛珍1,胡曼1,劉朋龍2,齊向輝1,蔡梅紅1

(1.江蘇大學 食品與生物工程學院,江蘇鎮(zhèn)江 212013;2.新疆天潤生物科技股份有限公司,新疆烏魯木齊 830088)

開菲爾粒是一個復雜的微生物共生體系,包含很多有益生作用的微生物。本文研究了一種開菲爾粒的主要組成菌并制成發(fā)酵劑。通過形態(tài)學特征初步分離純化得出:該開菲爾粒樣品主要由兩株酵母菌、三株乳酸菌以及兩株醋酸菌構成。經(jīng)16S rDNA序列分析進一步確定其種屬,得出其分別為Kluyveromycesmarxianus和Pichiakudriavzevii、Lactobacilluspontis和Lactobacilluskefiri、Acetobacterlovaniensis和Acetobactercibinongensis。采用分離出的菌株純培養(yǎng)微囊化之后進行混合發(fā)酵,得到具有優(yōu)良穩(wěn)定發(fā)酵性能的混合發(fā)酵劑,測定結果顯示發(fā)酵乳的營養(yǎng)成分、揮發(fā)性成分和抑菌性與原粒對比十分接近。

開菲爾粒,分離,鑒定,純培養(yǎng)混合發(fā)酵劑

開菲爾(kefir)是起源于高加索地區(qū)的一種酒精型發(fā)酵乳飲料,幾千年前在前蘇聯(lián)、東歐、中東等地流行,向西方的德國、瑞士、意大利等地傳播,并在北美和南美等地普及開來[1]。Kefir一詞來源于土耳其語“kef”,是爽口、安詳美滿的意思[2]。已經(jīng)有多人報道,其具有抑菌[3]及抗腫瘤活性[4],可調(diào)節(jié)腸道免疫系統(tǒng)[5],保護上皮細胞抵御蠟狀芽孢桿菌入侵的生理功能[6]。這些都可能歸功于開菲爾粒中復雜的菌相組成,其中包含有大量的益生菌。

關于開菲爾粒中菌種篩選的報道眾多,可以看出不同來源、不同環(huán)境下的開菲爾粒中微生物組成和比例具有很大的差別[7-8]。開菲爾粒作為開菲爾發(fā)酵劑,由多種微生物共生而成,主要包括酵母菌、乳酸菌和醋酸菌。到目前為止,開菲爾粒中微生物的共生機理還沒有得到科學的闡述。在大規(guī)模生產(chǎn)中,開菲爾粒中微生物的組成和比例嚴重影響開菲爾的質(zhì)量。而且不穩(wěn)定的菌種組成和比例,使開菲爾風味有很大差別[9]。曾友明等將從開菲爾粒中分離得到的乳酸菌和酵母菌按不同比例制成發(fā)酵劑,進行混合發(fā)酵實驗,菌相組成相對復雜的較容易得到口感風味俱佳的開菲爾[10]。雖然這種方法保證了開菲爾的滋味,但是不易于擴大生產(chǎn),而且菌種的組成和比例不同,開菲爾的風味和營養(yǎng)成分也有很大差異。因此我們對開菲爾粒菌種進行分離鑒定,制成微囊化純培養(yǎng)混合發(fā)酵劑,為之后的開菲爾發(fā)酵劑的研制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

開菲爾粒江蘇無錫養(yǎng)菌世家;生牛乳蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司;MRS培養(yǎng)基乳酸菌選擇培養(yǎng)基,篩選培養(yǎng)基中加入0.0005% 納他霉素抑制真菌生長[11];添加0.1%的氯霉素的PDA培養(yǎng)基酵母菌選擇培養(yǎng)基;Elliker培養(yǎng)基醋酸菌選擇培養(yǎng)基;蔗糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、木糖、L-阿拉伯糖、殼聚糖、明膠、黃原膠、酵母粉、胰蛋白胨、過氧化氫、碘、氯化鈣、海藻酸鈉、氯化鈉、醋酸鉛、硫酸銨亞鐵、結晶紫、考馬斯亮藍、溴麝香草酚藍、蒽酮、濃硫酸、無水乙醇、石油醚、乙醚、磺基水楊酸以上分析試劑均為分析純AR,國藥集團化學試劑有限公司;瓊脂糖、PCR buffer、dNTP、溴化乙錠、TE緩沖液上海生物技術有限公司。

SW-CJ系列潔凈工作臺蘇州安泰空氣技術有限公司;QYC 200全溫空氣搖床上海福瑪實驗設備有限公司;FE-20 pH計梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;BPMJ-250F型霉菌培養(yǎng)箱上海一恒科學儀器有限公司;手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器上海三申醫(yī)療器械有限公司;BSA124S-CW電子天平賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;MyCycler型PCR儀、Universal Hood II型凝膠成像儀、PowerPac型DNA電泳儀伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀HP6890/5973、頂空固相微萃SPMC-57328美國Agilent公司;微量紫外分光光度計北京瑞利分析儀器公司。

1.2實驗方法

1.2.1開菲爾粒的活化將實驗室保存的開菲爾粒按照3%比例接種到滅菌牛乳中,30 ℃、140 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h,用滅過菌的50目篩子過濾分離出活化的開菲爾粒,用無菌水沖洗干凈,再將其又加入到新的滅菌乳中30 ℃、140 r/min培養(yǎng)24 h。循環(huán)三次后的開菲爾粒供分離使用[12]。

1.2.2菌種的分離和保存取1 mL開菲爾添加到9 mL無菌水中,混勻后用無菌水梯度稀釋,吸取105、106、107的開菲爾稀釋液各100 μL分別在MRS篩選培養(yǎng)基,PDA培養(yǎng)基,Elliker培養(yǎng)基上均勻涂布,各設三個重復,于30 ℃培養(yǎng)。待菌落長出后,挑取培養(yǎng)基上的優(yōu)勢菌落在相應的平板上劃線分離培養(yǎng),革蘭氏染色直至鑒定為純菌,挑取進行過氧化氫酶實驗(用無菌牙簽挑取少許單菌落于滴有一滴3% H2O2溶液的干凈載玻片上,觀察是否有氣泡產(chǎn)生,有則為陽性,無則為陰性)。分別移入到相應的斜面培養(yǎng)基上進行培養(yǎng),培養(yǎng)好后將斜面試管放在4 ℃冰箱中保存。挑取單菌落于相應的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,吸取1 mL菌液于2 mL凍存管中,然后添加滅菌甘油至終濃度為15%,封口膜密封好之后置于-75 ℃超低溫冰箱凍存。

1.2.3菌落形態(tài)學鑒定通過觀察菌落的大小、形狀、顏色和表面形態(tài)等特征,初步區(qū)分菌種的差異和類別[13]。在添加1%的氯霉素的PDA培養(yǎng)基上挑選出有明顯菌落形態(tài),鏡檢菌體較大的初步認定為酵母菌;篩選MRS培養(yǎng)基表面挑選出有明顯菌落形態(tài)、革蘭氏陽性、H2O2陰性的菌株初定為乳酸菌;在Elliker培養(yǎng)基表面挑選出有明顯菌落形態(tài)、革蘭氏陰性、H2O2陽性的菌株初定為醋酸菌。

1.2.4分子生物學鑒定DNA的提取挑取分離得到的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌,分別制成菌懸液,然后進行反復凍融(-80 ℃,2 h,室溫融化,重復三次)破壞細胞結構,使細胞的DNA釋放出來。

酵母菌和乳酸菌的PCR擴增與檢測:

引物:酵母菌ITS1-5.8S-ITS2rDNA測序引物:ITS1:tccgtaggtgaacctgcgg;ITS4:tcctccgcttattgatatgc。乳酸菌和醋酸菌16SrDNA測序引物:27F:agagtttgatcctggctcag;1492R:tacggctaccttgttacgactt。

PCR擴增反應體系:按照以下加樣混合:10×PCR buffer,2.5 μL;Taq酶,0.15 μL;dNTP,2 μL;模板DNA,2 μL;上游引物,0.5 μL;下游引物,0.5 μL;雙蒸水,17.35 μL。

PCR擴增條件:細菌:預變性95 ℃,5 min;變性95 ℃,1 min;退火55 ℃,1 min;延伸72 ℃,90 s,重復上述3個步驟35個循環(huán),然后延伸72 ℃,10 min,最后10 ℃冷卻。酵母菌:預變性95 ℃,5 min;變性95 ℃,1 min;退火55 ℃,2 min;延伸72 ℃,40 s,重復上述3個步驟36個循環(huán),然后延伸72 ℃,10 min,最后16 ℃冷卻。

擴增結束后,取2.5 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL 10×Loading buffer混合均勻,1%瓊脂糖凝膠電泳,利用溴酚藍作指示劑,檢測PCR擴增產(chǎn)物。最后用EB作染色劑,利用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實驗結果。

PCR擴增產(chǎn)物序列的測定及分析:將擴增成功的PCR產(chǎn)物送往南京金斯瑞生物技術有限公司進行測序,將測得的DNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,使用NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)(http://www. ncbi.nlm.Gov/Blast/)對序列同源性進行對比分析。

1.2.5微囊化混合純培養(yǎng)發(fā)酵劑的制備將分離得到的菌純培養(yǎng),分別制成微膠囊[14]。配制含有0.3%黃原膠和5%氯化鈣的混合溶液,121 ℃滅菌20 min。然后將準備好的混合液與菌種混合,并慢慢滴入經(jīng)過滅菌處理的0.8%的海藻酸鈉溶液中,形成液芯微膠囊。將微膠囊濾出并用滅菌生理鹽水沖洗掉表面的海藻酸鈉。然后將微膠囊放入5%的氯化鈣溶液中進行固化處理。30 min后,濾出沖洗,再放入0.2%的殼聚糖溶液中浸泡30 min,使微膠囊表面形成一層保護膜,增加微膠囊的抗逆性。最后濾出微膠囊,沖洗,在4 ℃的環(huán)境下進行保存。將酵母菌、乳酸菌和醋酸菌制成的微膠囊按照2∶7∶1混合制成發(fā)酵劑,按照10%的比例接種到滅菌乳中,30 ℃,120 r/min發(fā)酵24 h,取發(fā)酵液(命名為M)保存于4 ℃下備用。然后用濾出的發(fā)酵劑繼續(xù)相同條件下發(fā)酵,連續(xù)發(fā)酵10 d。同時用開菲爾原粒做對照實驗(命為K)。

1.2.6發(fā)酵乳理化特性的測定乳酸菌、酵母菌和醋酸菌的菌落計數(shù)方法:參照GB 4789.2-2010;pH的測定:利用pH計進行測定;酸度的測定:參照GB 5413.34-2010;蛋白質(zhì)含量的測定:利用考馬斯亮藍法測定[15];糖含量的測定:蒽酮比色法[16];脂肪含量的測定:羅紫-哥特里法[17];酒精含量的測定:利用氣相色譜法[18]。

持水性(WHC)的測定:取20 mL的發(fā)酵乳,8000×g,4 ℃離心15 min。取上清液稱重。按以下公式計算持水性:

W1:上清液重量,W2:開菲爾樣品重量。

1.2.7GC-MS分析發(fā)酵乳中揮發(fā)性香氣成分發(fā)酵乳處理:取5 mL樣品注入20 mL的頂空瓶中,45 ℃前處理10 min。將萃取頭插入頂空瓶中,45 ℃吸附30 min,于氣相進樣口解吸附5 min,然后進行氣質(zhì)分析。

氣相條件:初始溫度40 ℃持續(xù)4 min;以5 ℃/min的速率升溫至140 ℃,保持10 min;再以5 ℃/min的速率升溫至210 ℃,保持12 min;最后以10 ℃/min的速率升溫至240 ℃。傳輸線溫度保持250 ℃。檢測器溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件:電離電壓70 eV,離子源溫度:250 ℃,掃描范圍:29～300 amu,發(fā)射電流100 μA,檢測電壓1.4 kV。

1.2.8抑菌實驗取微囊發(fā)酵劑發(fā)酵10 d后的發(fā)酵乳進行抑菌實驗。分別用金黃色葡糖球菌和大腸桿菌做指示菌。將100 μL兩種指示菌菌懸液均勻涂布接種到LB瓊脂培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基凝固后,利用滅過菌的打孔器打孔。然后將M和K分別注滿到孔中,以200 mg/L氨芐青霉素作為對比,30 ℃培養(yǎng)24 h。用尺子測量抑菌圈直徑,通過比較抑菌圈大小來確定兩種發(fā)酵液的抑菌效果[19]。

1.2.9數(shù)據(jù)處理方法本文中的數(shù)據(jù)都是經(jīng)過平行實驗獲得的平均值,并使用origin8.5和SPSS16進行數(shù)據(jù)分析處理(p<0.05為影響顯著)。

2　結果與討論

2.1菌落的形態(tài)學分析

通過菌落的形態(tài)學分析,初步區(qū)別出不同的菌,為下面的分子生物學鑒定奠定基礎。在酵母菌分離培養(yǎng)基上,有兩種具有不同菌落形態(tài)的酵母菌(J1、J2);在乳酸菌的分離培養(yǎng)基上,挑選革蘭氏染色紫色和過氧化氫酶實驗陰性的菌株初步確定為乳酸菌,通過菌落的觀察,有三種不同的乳酸菌(R1、R2、R3);在醋酸菌分離培養(yǎng)基上,通過革蘭氏染色紅色和過氧化氫酶實驗呈陽性分離得到,有兩種菌落形態(tài)不同的醋酸菌(C1、C2)。

表1　菌落形態(tài)特征Table 1　Colony morphology

2.2開菲爾粒中菌種基因序列鑒定結果分析

為了測定酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的PCR效果,將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,結果如圖1,每個樣做兩個平行。在1500 bp和750 bp左右的位置上有清晰的條帶,無彌散和非特異性擴增現(xiàn)象,說明PCR結果滿足條件。

圖1　分離菌種的電泳圖譜Fig.1　Electrophoretic mapping of separation species

將測序得到的酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的基因序列通過BLAST與數(shù)據(jù)庫中的菌株進行相似性分析比較。當相似性大于99%時,該菌種可以直接鑒定到種的水平。從每個種中挑取有代表性的基因序列與模式菌株的序列利用軟件MEGA5.10構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2　酵母菌基于IST1-5.8S-IST2rDNA序列構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig .2　Phyogenetic tree based on IST1-5.8S-IST2rDNA sequences and constructed using the neighbor joining method for yeast

圖3　乳酸菌基于16S rDNA序列構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3　Phyogenetic tree based on 16S rDNA sequences and constructed using the neighbor joining method for lactobacillus

圖4　醋酸菌基于16S rDNA序列構建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig .4　Phyogenetic tree based on 16S rDNA sequences and constructed using the neighbor joining method for acetic acid bacteria

從圖2可以看出,酵母菌J1和J2分別與Kluyveromycesmarxianusstrain CCT 7735和Pichiakudriavzeviiclone STA 197lsu的距離最近,且相似性都達到99%以上,故J1和J2分別被鑒定為Kluyveromycesmarxianusstrain和Pichiakudriavzeviiclone。從圖3可以看出,乳酸菌R1、R2和R3分別與Lactobacilluspontisstrain NM129-2、Lactobacilluskefiristrain NM180-3和Lactobacilluskefiristrain NM132-3的距離非常接近,而且相似性達到99%以上,因此R1被鑒定為Lactobacilluspontisstrain,R2和R3被鑒定為Lactobacilluskefiristrain。從圖4可以看出,醋酸菌C1和C2分別與AcetobacterlovaniensisstrainKS7和Acetobactercibinongensisstrain MGB31-7的距離非常接近,而且相似性達到100%,因此醋酸菌C1和C2分別被鑒定為Acetobacterlovaniensisstrain和Acetobactercibinongensisstrain。

2.3微囊發(fā)酵劑菌種數(shù)量的變化

由圖5可知,隨著發(fā)酵循環(huán)數(shù)的增加,微膠囊中各菌種的數(shù)量逐漸增加。到一定程度后,由于營養(yǎng)物質(zhì)和生存空間的限制及菌種之間的相互作用,各菌種的數(shù)量最后趨于穩(wěn)定[20]。微膠囊發(fā)酵劑中酵母菌、乳酸菌和醋酸菌的初始數(shù)量級分別是106、107、105cfu/mL,連續(xù)發(fā)酵十次后,各菌種的數(shù)量級基本穩(wěn)定在1010、1012、109cfu/mL?？梢钥闯鋈樗峋鸀橹饕M成菌,而醋酸菌含量相對較少。

圖5　發(fā)酵循環(huán)數(shù)對包埋發(fā)酵劑中菌種數(shù)量的影響Fig.5　Effect of number of fermentation cycles on the cell counts of bacteria and yeast in entrapped starter cultures

2.4發(fā)酵乳中物化指標和營養(yǎng)成分變化的比較

2.4.1發(fā)酵乳中持水率的變化由圖6可知K和M的持水性逐漸增大,在六個循環(huán)發(fā)酵后,兩者的持水性都基本達到穩(wěn)定。在前三個循環(huán),M的持水性高于K的持水性,之后被超越。研究發(fā)現(xiàn),由于胞外多糖含有很高的水合能力和蛋白水解活性,因此胞外多糖的含量會影響發(fā)酵液的持水性[21]。而發(fā)酵劑中菌種的數(shù)量和活性會影響胞外多糖的產(chǎn)量,從而影響發(fā)酵液的持水性。

表2　微膠囊發(fā)酵劑發(fā)酵乳(M)與開菲爾粒發(fā)酵生產(chǎn)開菲爾(K)中營養(yǎng)成分的比較Table 2　Effects of number of fermentation cycles on chemical properties in the kefir produced by micro capsule(M)or kefir grains(K)

圖6　發(fā)酵循環(huán)對K和M持水性的影響Fig.6　Effect of number of fermentation cycles on WHC of K and M

2.4.2發(fā)酵乳中營養(yǎng)成分變化由表2對比可以看出兩種發(fā)酵乳的pH隨著發(fā)酵循環(huán)數(shù)的增加而降低(p<0.05),酸度則是在增加,最后都趨于穩(wěn)定。前三個循環(huán)M的發(fā)酵效力明顯沒有K高,可能是由于微囊發(fā)酵劑中囊膜對囊內(nèi)物質(zhì)有一定的阻礙作用[22],同時乳酸菌和醋酸菌生長比酵母緩慢,所以產(chǎn)酸相對較慢。

在開菲爾中,乙醇賦予了開菲爾獨特的口感和風味,因此,酒精是評價開菲爾的一個重要指標。由表2可以看出,K和M酒精含量的變化是緩慢的,但是隨著發(fā)酵循環(huán)的增加,酒精含量有明顯的變化(p<0.05)。在前幾個循環(huán)的發(fā)酵中,M中的酒精含量比K低,第七個循環(huán)后酒精含量達到穩(wěn)定,并與K基本持平。這是因為酒精含量是由酵母菌決定的[23],酵母菌數(shù)量隨著發(fā)酵循環(huán)數(shù)的增加而增加。另外,隨著發(fā)酵的進行,微膠囊中酵母菌的活菌數(shù)不斷增加,從第七個循環(huán)開始達到最大量并保持穩(wěn)定。

除了酒精含量,蛋白質(zhì)、糖和脂肪含量等因素都是衡量開菲爾品質(zhì)的重要因素。由表2看出,兩種發(fā)酵乳中蛋白質(zhì)和糖的含量都是隨著循環(huán)數(shù)的增加而減少(p<0.05),可能是菌種生長消耗所致。而脂肪含量基本不變(p>0.05),維持在3.7 g/L左右。

2.5微囊化發(fā)酵劑發(fā)酵乳和開菲爾的揮發(fā)性風味成分分析

表3為兩種發(fā)酵乳的揮發(fā)性香氣化合物及其相對百分含量。通過比較發(fā)現(xiàn),兩種發(fā)酵乳都檢測出17種揮發(fā)性香氣成分,而且含有比例基本一樣。其中酒精和乙酸乙酯含量最高,酒精是酵母菌的直接代謝產(chǎn)物,而乙酸乙酯是酵母菌胞內(nèi)酶的代謝產(chǎn)物。另外,對奶香風味產(chǎn)生重要影響的醛和羰基化合物,特別是乙偶姻和乙醛,相對含量也相差不大。研究發(fā)現(xiàn),醇類物質(zhì)、乙醛和乙偶姻是發(fā)酵乳中最重要的風味成分[24],K和M中主要的風味成分基本相同。

2.6抑菌實驗結果分析

益生菌能夠通過調(diào)節(jié)免疫、新陳代謝活動及抑制病菌生長等途徑來抑制疾病的發(fā)生。而開菲爾中包含大量的益生菌,如酵母菌和乳酸菌等。氨芐青霉素、K、M在金黃色葡萄球菌和大腸桿菌平板抑菌圈直徑大小分別為1.56 cm和1.85 cm、1.40 cm和1.25 cm、1.40 cm和1.20 cm。結果表明K和M對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有明顯的抑制效果,這是由于乳酸菌能產(chǎn)酸和細菌素,酵母菌可以產(chǎn)乙醇等抑菌物質(zhì),此外,Rodrigues等報道了開菲爾中的胞外多糖有很強的抑菌作用[3]。無論是M還是K,與氨芐青霉素的抑菌效果對比都略有不足。其中K的抑菌效果略好,這可能是因為開菲爾中菌相更復雜且包含很多弱勢菌,而本實驗僅利用它的優(yōu)勢菌。結果顯示微膠囊發(fā)酵劑的抑菌效果已經(jīng)非常接近開菲爾粒,但還是有一定差距。

表3　兩種發(fā)酵乳的揮發(fā)性成分比較Table 3　Volatile components of two fermented milk

3　結論

以開菲爾粒為菌種分離源,通過菌落形態(tài)學鑒定和分子生物學鑒定,確定了開菲爾粒中的優(yōu)勢菌種分別是酵母菌、乳酸菌和醋酸菌。其中酵母菌包括Kluyveromycesmarxianusstrain和Pichiakudriavzeviiclone,乳酸菌包括Lactobacilluspontisstrain NM129-2和Lactobacilluskefiristrain,醋酸菌包括Acetobacterlovaniensisstrain和Acetobactercibinongensisstrain。其中Acetobactercibinongensis在開菲爾粒中的報道主要集中于PCR-DGGE技術菌相分析過程中[25],而未見從開菲爾粒中分離鑒定得到該菌株的相關報道。

通過微囊化純培養(yǎng)制成混合發(fā)酵劑與開菲爾原粒對比,在蛋白質(zhì)、糖、脂肪、酒精、揮發(fā)性風味成分、抑菌等方面已經(jīng)與傳統(tǒng)開菲爾非常接近,但是在含量和效果等方面還未完全達到?？赡苄枰ㄟ^進一步優(yōu)化接種量和接種比例來獲得風味更好的發(fā)酵乳。

[1]Otles S,Cagindi Oe. Kefir:A probiotic dairy-composition,nutritional and therapeutic aspects[J]. Pakistan Journal of Nutrition,2003,2(2):54-59.

[2]Sabir F,Beyatli Y,Cokmus C,et al. Assessment of potential probiotic properties oflactobacillusspp.,lactococcusspp.,andpediococcusspp. Strains isolated from kefir[J]. Journal of Food Science,2010,75(9):568-573.

[3]Rodrigues KL,Caputo LRG,Carvalho JCT,et al. Antimicrobial and healing activity of kefir and kefiran extract[J]. International journal of antimicrobial agents,2005,25(5):404-408.

[4]Shiomi M SK,Murofushi M. Antitumor activity in mice of orally administered polysaccharide from kefir grain[J]. Japanese journal of medical science & biology,1982,35(2):75-80.

[5]Vinderola G,Perdigón G,Duarte J,et al. Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity[J]. Cytokine,2006,36(5):254-260.

[6]Medrano M,Pérez PF,Abraham AG. Kefiran antagonizes cytopathic effects of bacillus cereus extracellular factors[J]. International journal of food microbiology,2008,122(1):1-7.

[7]Garrote GL,Abraham AG,De Antoni GL. Microbial interactions in kefir:A natural probiotic drink[J]. Biotechnology of Lactic Acid Bacteria:Novel Applications,2010:327-338.

[8]Garrote GL,Abraham AG,DE Antoni GL. Chemical and microbiological characterisation of kefir grains[J]. Journal of dairy research,2001,68(04):639-652.

[9]劉慧,李平蘭,張永春,等. 開菲爾的生理功能,特性及其產(chǎn)品開發(fā)研究進展[J]. 食品科學,2005,26(5):252-255.

[10]曾友明,曾文兵,馮司亮,等. 開菲爾功能菌組的復合及發(fā)酵特性研究[J]. 中國乳品工業(yè),2007,35(3):26-28.

[11]Zhou T,Li B,Peng C,et al. Assessment of the sequential simulated gastrointestinal tolerance of lactic acid bacteria from kefir grains by response surface methodology[J]. Journal of food science,2009,74(6):328-334.

[12]林曉珊,吳虹,楊汝德. 中華開菲爾共生菌的分離與鑒定[J]. 現(xiàn)代食品科技,2009,10:1233-1235.

[13]谷海瀛. 形態(tài)學檢查方法的標準化及其在細菌鑒定中的作用[J]. 中華檢驗醫(yī)學雜志,2006,29(10):951-953.

[14]Zhimin O,Xingyuan S,Hanbing S,et al. Synthesis of duloxetine intermediate(s)-3-chloro-1-(2-thienyl)-1-propanol with liquid-core immobilized candida pseudotropicalis 104[J]. Applied biochemistry and biotechnology,2012,168(8):2297-2308.

[15]Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry. 1976,72(1):248-254.

[16]WANG L-m,XIA W-s. Determination of TPS by Improvement of Anthrone-sulfuric Acid Method[J]. Food Science. 2005,7:044.

[17]Heinrich C. Use of the Rose-Gottlieb method for rapid gravimetric fat determination with the Heraeus apparatus[J]. Deutsche Milchwirtschaft. 1970,21(20):797-798.

[18]Papapostolou H,Bosnea LA,Koutinas AA,et al. Fermentation efficiency of thermally dried kefir[J]. Bioresource technology. 2008,99(15):6949-6956.

[19]Jacobsen CN,Nielsen VR,Hayford A,et al. Screening of probiotic activities of forty-seven strains of lactobacillus spp. Byinvitrotechniques and evaluation of the colonization ability of five selected strains in humans[J]. Applied and Environmental Microbiology,1999,65(11):4949-4956.

[20]楊希娟,師俊玲,樊明濤. 西藏靈菇牛乳發(fā)酵液中的菌相與物質(zhì)變化[J]. 中國食品學報,2007,7(4):42-46.

[21]Yu J,Ahmedna M,Goktepe I. Peanut protein concentrate:Production and functional properties as affected by processing[J].Food Chemistry,2007,103(1):121-129.

[22]包永華,董明盛. 液芯海藻酸鈣包囊固定化技術[J]. 中國釀造,2008,21:14-17.

[23]Beshkova D,Simova E,Simov Z,et al. Pure cultures for making kefir[J]. Food Microbiology,2002,19(5):537-544.

[24]Ott A,Germond J-E,Chaintreau A. Vicinal diketone formation in yogurt:13c precursors and effect of branched-chain amino acids[J]. Journal of agricultural and food chemistry,2000,48(3):724-731.

[25]Gulitz A J. Analysis of the diversity of water kefir microbiota by culture-dependent and-independent approaches[D]. Universit?tsbibliothek der TU München,2013.

Screening of main microorganism from Kefir Grain and analysis of femented milk using mixed microsapsule pure cultures

ZHONG Hao1,WANG Liang1,*,LIU Ke-ying1,GUO Ai-zhen1,HU Man1,LIU Peng-long2,QI Xiang-hui1,CAI Mei-hong1

(1.Jiangsu University,School of Food and Biological Engineering,Zhenjiang 212013,China;2. Xinjiang Ttianrun biotechnology co.,LTD,Urumqi 830088,China)

Kefir grain,as a complex system of microbial symbiosis,contains many useful microorganisms. The research focused on the main microbial composition of kefir grains and the preparation of a microbial starter culture. According to the colony forms and biological properties,the kefir grain samples were consisted of two strains of yeast,three strains of lactic acid bacteria(LAB)and two strains of acetic acid bacteria(AAB). After sequencing the 16S rDNA sequence of the seven strains,it can be concluded that the yeasts were identified asKluyveromycesmarxianusandPichiakudriavzevii,LAB wereLactobacilluspontisandLactobacilluskefiri,AAB wereAcetobacterlovaniensisandAcetobactercibinongensis. Further,the isolated strains were cultivated and microencapsulated. After the microcapsules were mixed and fermented in milk,the performance of the nutrition contents and volatile components and the property of antimicrobial activity were very similar to the original kefir grains.

Kefir grains;isolation;identification;mixed microsapsule pure cultures

2015-08-31

鐘浩(1990-),男,碩士,主要從事開菲爾乳品的研究，E-mail:simba90@126.com。

王亮(1966-),男,博士,研究員,主要從事食品微生物方面的研究,E-mail:wangliang_2004wl@163.com。

新疆生產(chǎn)建設兵團工業(yè)及高新技術科技攻關與成果轉化計劃項目(2015AB032);江蘇大學高級專業(yè)人才科研啟動資金(12JDG069)。

TS252.54

A

1002-0306(2016)05-0148-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.020