邵維莉，吳道勛，李　楊，2，劉　熙，劉光明，張海珠，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理　671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理　671000）

藥學(xué)

云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠免疫功能的影響

邵維莉1，吳道勛1，李楊1，2，劉熙1，劉光明1，張海珠1，2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

目的：研究云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠免疫功能的影響。方法：昆明種小鼠灌胃給予高、中、低劑量（400、200、100 mg/kg）的松塔提取物，陽(yáng)性對(duì)照藥左旋咪唑（25 mg/kg），連續(xù)給藥10 d后，處死小鼠，測(cè)定小鼠血清中免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和補(bǔ)體C3、C4的含量，測(cè)全外周血細(xì)胞數(shù)，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。結(jié)果：云南松松塔提取物能增加外周血中的免疫球蛋白IgA、IgM、補(bǔ)體C4的含量和白細(xì)胞數(shù)，與正常組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠的免疫功能有一定的增強(qiáng)作用。

云南松；松塔；正常小鼠；免疫球蛋白；補(bǔ)體；外周血細(xì)胞

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.08.001

松塔（Pinecone）系松科（Pinaceae）松屬（Pinus）植物的球果，別名松果、松球，其植物來(lái)源有華山松、云南松、紅松、油松及思茅松等。研究發(fā)現(xiàn)松塔中的一些抗癌活性成分具有抗腫瘤、抗菌及抗病毒作用〔1-2〕并有高效、低毒的特點(diǎn)〔3-4〕。并且，SAKAGAMI等〔5〕還提出松塔提取物中的抗腫瘤、抗HIV、抗菌活性成分可能是多糖的耦合物。此外，隨著研究的深入，郭美仙等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)云南松松塔提取物對(duì)乙醇損傷大鼠肝細(xì)胞有一定的抗氧化作用，于冬梅等〔7〕及劉中祿等〔8〕最近研究表明云南松提取物具有一定抗癌活性和抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，高濃度下對(duì)正常肝細(xì)胞和小鼠淋巴細(xì)胞毒性小。NAGASAWA等〔9〕還報(bào)道了日本白松松塔提取物降低小鼠乳汁中乳房腫瘤病毒（MMTV）含量的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)以有關(guān)松塔的各項(xiàng)研究為基礎(chǔ)，大膽推測(cè)云南松松塔是通過(guò)影響機(jī)體免疫系統(tǒng)從而改善機(jī)體的狀況，探討云南松松塔乙醇提取物（YN-DEF）對(duì)正常小鼠的免疫功能的影響，為進(jìn)一步研究云南松的藥用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　試驗(yàn)材料

YN-DEF（云南松松塔）：采自大理州漾濞縣，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥學(xué)教研室段寶忠副教授鑒定為松科屬植物云南松（Pinus yunnanensis Franch.）的松塔乙醇提取物；IgA、IgM、IgG、C3、C4酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（MABTECH生物公司）、鹽酸左旋咪唑（廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150115），XFA6000動(dòng)物血細(xì)胞分析儀用稀釋液（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PD1501）；HB探針清洗液（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PB9407）；ANI-3D溶血?jiǎng)暇┢绽梳t(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PF24020），HB含酶清洗液（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，批號(hào)：PB7501）。

昆明種小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（滇）2011-0004。

酶標(biāo)分析儀（基因有限公司，Gen5型），全自動(dòng)動(dòng)物血細(xì)胞分析儀（南京普朗醫(yī)療設(shè)備有限公司，型號(hào)XFA6000）。

2　方法

2.1動(dòng)物分組與給藥分組：50只小鼠，實(shí)驗(yàn)組設(shè)置為正常組，陽(yáng)性對(duì)照組，給藥高劑量組、中劑量組、低劑量組，共5組。雌雄各半，每組10只。

給藥：正常組給予生理鹽水，0.2 mL/10 g；陽(yáng)性對(duì)照組鹽酸左旋咪唑（0.2 mL/10 g）25 mg/kg；給藥高劑量組、中劑量組、低劑量組（0.2 mL/10 g），分別以400、200、100 mg/kg給藥，各組連續(xù)給藥10 d。

2.2檢測(cè)指標(biāo)末次給藥后禁食12 h，從眼內(nèi)眥靜脈取血，取20 μL全血測(cè)白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板；剩余全血分離血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，頸椎脫臼處死小鼠取肝組織勻漿。取其胸腺和脾臟稱量，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟重量（mg）/小鼠體重量（g），胸腺指數(shù)=胸腺重量（mg）/小鼠體重量（g）；分別用血清檢測(cè)免疫球蛋白IgA、IgM、IgG和補(bǔ)體C3、C4。

2.3數(shù)據(jù)分析采用SPSS21.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用表示，各組均數(shù)的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果與分析

3.1云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠外周血免疫球蛋白的影響給藥組與正常組對(duì)比，云南松松塔提取物高、中、低劑量組對(duì)正常小鼠外周血中的免疫球蛋白IgA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低劑量組還呈現(xiàn)出對(duì)免疫球蛋白IgM的增強(qiáng)作用，與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；此外，各給藥組對(duì)IgG的變化無(wú)論是與陽(yáng)性組比較還是與正常組比較均無(wú)明顯影響（P＞0.05），但I(xiàn)gG隨著濃度的增加呈增加趨勢(shì)，呈一定的量效關(guān)系。見表1。

表1　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠血清中免疫球蛋白的影響

表1　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠血清中免疫球蛋白的影響

注：與正常組比較aP＜0.05。

組別正常組陽(yáng)性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組IgG/ （g/L）0.036±0.032 0.044±0.027 0.032±0.008 0.046±0.016 0.054±0.026劑量/ （mg/kg）—25 100 200 400 IgA/ （g/L）0.191±0.093 0.274±0.047a0.273±0.018a0.294±0.054a0.256±0.040aIgM/ （g/L）0.255±0.068 0.263±0.032 0.320±0.084a0.263±0.038 0.284±0.064

3.2云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠外周血中補(bǔ)體的影響給藥組與正常組比較，各組均對(duì)正常小鼠外周血中的補(bǔ)體C4有顯著性的增加作用，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但其增加作用并不隨濃度的增加呈逐漸遞增或遞減趨勢(shì)。與陽(yáng)性對(duì)照組比較，雖然中、高劑量組并無(wú)明顯差異性，但與低劑量組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。此外，針對(duì)各給藥組對(duì)補(bǔ)體C3的影響，無(wú)論是與陽(yáng)性對(duì)照組比較還是和正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但隨著濃度的增大，其作用呈逐漸增加的趨勢(shì)，構(gòu)成一定的量效關(guān)系。見表2。

表2　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠外周血清中補(bǔ)體的影響

表2　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠外周血清中補(bǔ)體的影響

注：與正常組比較aP＜0.05；與陽(yáng)性組相比bP＜0.05。

組別正常組陽(yáng)性組低劑量組中劑量組高劑量組C4/（g/L）0.045±0.017 0.050±0.019 0.071±0.011a b0.064±0.012a0.062±0.018a劑量/（mg/kg）—25 100 200 400 C3/（g/L）0.739±0.425 0.557±0.374 0.666±0.084 0.698±0.193 0.786±0.183

3.3云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠免疫器官指數(shù)的影響給藥組與正常組和陽(yáng)性組比較，云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)作用均不明顯，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠免疫器官指數(shù)的影響

表3　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠免疫器官指數(shù)的影響

脾臟指數(shù)/（mg/g）3.82±1.83 3.02±0.87 3.31±1.28 2.95±2.21 3.21±0.72組別正常組陽(yáng)性組低劑量組中劑量組高劑量組劑量/（mg/kg）—25 100 200 400胸腺指數(shù)/（mg/g）3.54±1.45 2.73±1.05 2.77±0.90 2.71±1.11 2.86±2.00

3.4云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠外周血細(xì)胞的影響給藥組與正常組比較，云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠白細(xì)胞數(shù)有增加的作用，其中高劑量的增加差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而各給藥組與陽(yáng)性對(duì)照組及正常組比較，對(duì)紅細(xì)胞和血小板的影響差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠外周血細(xì)胞的影響

表4　云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠外周血細(xì)胞的影響

注：與正常組比較aP＜0.05。

組別正常組陽(yáng)性組低劑量組中劑量組高劑量組血小板/ （109個(gè)/L）952.20±261.41 1 001.77±243.89 939.33±288.80 823.77±380.81 904.77±202.43劑量/ （mg/kg）—25 100 200 400白細(xì)胞/ （109個(gè)/L）2.50±0.97 3.17±1.50 2.85±0.89 2.51±0.97 3.96±1.17a紅細(xì)胞/ （1012個(gè)/L）7.74±0.49 7.22±0.48 7.46±0.55 7.10±1.11 7.07±0.84

4　討論

IgA、IgM、IgG免疫球蛋白作為機(jī)體的主要效應(yīng)分子，在免疫系統(tǒng)中免疫球蛋白具有免疫防御、免疫監(jiān)視和免疫自穩(wěn)的作用，在血清和體液中的免疫球蛋白的含量可隨著疾病的發(fā)生而改變；而C3、C4補(bǔ)體則既可參與機(jī)體的特異性免疫也可參與機(jī)體的非特異性免疫的調(diào)節(jié)，故免疫球蛋白和補(bǔ)體在機(jī)體中含量直接影響著機(jī)體的免疫功能，兩者含量的測(cè)定結(jié)果均可成為反映機(jī)體免疫狀態(tài)的兩個(gè)重要指標(biāo)。由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，云南松松塔提取物選擇性地提高了免疫球蛋白IgA、IgM及C4補(bǔ)體的含量，表明松塔提取物對(duì)正常小鼠體液免疫和體內(nèi)非特異性免疫有一定的調(diào)節(jié)作用。研究中還發(fā)現(xiàn)，云南松松塔提取物對(duì)正常小鼠的外周白細(xì)胞數(shù)有明顯的增加作用，所以云南松松塔提取物對(duì)增強(qiáng)固有免疫也有一定的效果。但對(duì)免疫器官指數(shù)沒(méi)有明顯的影響，與史志婷等〔10〕研究松塔提取物對(duì)小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，云南松松塔對(duì)增強(qiáng)正常小鼠的免疫功能有一定的作用。以此實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)一步探討云南松松塔增強(qiáng)免疫的作用，將會(huì)為今后選擇治療獲得性或非獲得性免疫低下疾病有效藥物，提供一個(gè)參考依據(jù)。

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〔Abstract〕Objective:To study the effect of pinecone extract of Pinus Yunnanensis on immune function of normal mice.Methods: Kunming mice were administered high，middle and low dose of pinecone extract（400，200，100 mg/kg），25 mg/kg Levamisole by gavage and the mice were sacrificed after 10 days.The content of immunoglobulin IgA，IgM，IgG，complement C3 and C4 in mice serum was measured；the amount of peripheral blood cell，spleen index，and thymus index were measured as well.Results:The pinecone extract of Pinus Yunnanensis could increase immunoglobulin IgA，IgM，complements C4 and WBC in peripheral blood content.Compared with normal group，the difference reflects statistical significance（P＜0.05）.Conclusion:The pinecone extract of Pinus Yunnanensis can enhance the immune function of normal mice.

〔Key words〕Pinus yunnanensis；pinecone；normal mice；immunoglobulin；complement；peripheral blood cell

（責(zé)任編輯李楊）

The Effect of Pinecone Extract of Pinus Yunnanensis on Immune Function of Normal Mice

Shao Weili1，Wu Daoxun1，Li Yang1，2，Liu Xi1，Liu Guangming1，Zhang Haizhu1，2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China）

R285

A

2096-2266（2016）08-0001-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260632；81450053）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2014Z132）

2016-02-28

2016-04-06

邵維莉，碩士研究生，主要從事藥理學(xué)研究.

張海珠，副教授.