袁曄，張玲，邵蔚藍(lán)，王武，楊海麟*（.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫4；.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江000）

基于溫控載體表達(dá)膽固醇氧化酶

袁曄1，張玲1，邵蔚藍(lán)2，王武1，楊海麟*1
（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212000）

膽固醇氧化酶在醫(yī)藥檢測、食品加工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面都有重要的應(yīng)用價(jià)值。以來源于Rhodococcus sp.的膽固醇氧化酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，構(gòu)建于溫控表達(dá)載體pHsh上，免去了誘導(dǎo)劑的使用，采用溫度調(diào)控使膽固醇氧化酶基因在大腸桿菌中成功表達(dá)。在搖瓶水平對(duì)酶的表達(dá)量進(jìn)行優(yōu)化，最終的酶量為855 U/L。使用鎳柱將酶純化，得到單一條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為55 kDa。分析其酶學(xué)性質(zhì)，最適pH 7.0，在pH 5.0～7.0穩(wěn)定；最適反應(yīng)溫度40℃，在50℃保溫，其半衰期為6.9 min。以膽固醇為底物，在pH 7.5、37℃條件下測酶活，計(jì)算得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為3.38 mmol/L，kcat/Km為6.09 s-1·（mmol/L）。

膽固醇氧化酶；pHsh熱激表達(dá)載體；溫度誘導(dǎo)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，目前應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達(dá)系統(tǒng)。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，目的基因表達(dá)水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強(qiáng)等特點(diǎn)［1］。一個(gè)完整的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)至少要有表達(dá)載體和宿主菌兩部分構(gòu)成。常見的表達(dá)體系有Lac/Tac表達(dá)體系［2］，PL/PR表達(dá)體系［3］和T7表達(dá)體系［4-5］，Lac/Tac表達(dá)體系需要添加誘導(dǎo)劑IPTG，但由于IPTG本身具有一定的毒性，常用乳糖代替；PL/ PR表達(dá)體系是利用溫控啟動(dòng)的，熱刺激過程中，大腸桿菌熱休克，蛋白質(zhì)表達(dá)也會(huì)被激活，其中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，且大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí)，溫度升高需要較長的時(shí)間，對(duì)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)量有一定的影響。T7啟動(dòng)子常融合前兩種啟動(dòng)子，但是這是一種強(qiáng)啟動(dòng)子，目的蛋白質(zhì)的過量表達(dá)常使其形成無活性的包涵體狀態(tài)。3種表達(dá)體系各有利弊［6］。pHsh表達(dá)體系是基于E.coli胞內(nèi)σ32因子調(diào)控?zé)嵝菘说鞍踪|(zhì)的表達(dá)而設(shè)計(jì)的，當(dāng)受到熱激時(shí)，σ32因子的數(shù)量急劇增加，使目的蛋白質(zhì)大量表達(dá)，誘導(dǎo)是由溫度控制，并不需要添加誘導(dǎo)劑，操作簡便［7-8］。

膽固醇氧化酶（COD）屬于黃素氧化酶類，是膽固醇降解過程中的第一個(gè)酶，多數(shù)情況能催化膽固醇的氧化，并以氧氣為電子受體生成膽甾鄄4鄄烯鄄3鄄酮和H2O2［9］。膽固醇氧化酶應(yīng)用廣泛［10］，可用于醫(yī)學(xué)檢測［11］、甾體激素或甾體類藥物的合成［12］，以及針對(duì)鱗翅目昆蟲的殺蟲劑［13］，還可用于生產(chǎn)低膽固醇且具有保健功能的食品，具有較好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［14］。

COD已經(jīng)構(gòu)建在E.coli BL21（DE3）鄄pET28a （+）表達(dá)系統(tǒng)中，由于表達(dá)載體pET28a是lac啟動(dòng)子，在表達(dá)的過程需要添加昂貴的誘導(dǎo)劑，而且具有T7強(qiáng)啟動(dòng)子，使表達(dá)產(chǎn)物快速過量而多呈無活性的包涵體狀態(tài)。本研究中采用pHsh熱激表達(dá)載體，構(gòu)建并表達(dá)COD，研究了其酶學(xué)性質(zhì)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株、載體與基因宿主大腸桿菌E.coli BL21（DE3），由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存；重組E.coli BL21（DE3）/pET28a（+）鄄COD，作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存；溫控質(zhì)粒pHsh，由南京師范大學(xué)邵蔚藍(lán)教授惠贈(zèng)。

1.1.2工具酶與試劑工具酶NcoⅠ，XbaⅠ，T4 DNALigase，Taq DNA聚合酶，均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購自上海生工生物工程有限公司；膠回收試劑盒，DNA相對(duì)分子標(biāo)準(zhǔn)，購于上海捷瑞有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨，Oxoid公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶，上海藍(lán)園生物有限公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基，LB+M9優(yōu)化培養(yǎng)基，TB培養(yǎng)基，詳見文獻(xiàn)［15］。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)ChOb基因序列（GenBank登錄號(hào)為DQ345780.1），以及質(zhì)粒載體pHsh的序列，設(shè)計(jì)合成以下引物。上游引物：5'鄄TGCTCTAGACCCCCAGCCGCACCCT鄄3'；下游引物：5'鄄CATGCCATGGCTGGATGTCGGACGAG鄄3'。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.2分子操作技術(shù)重組E.coli BL21（DE3）/ pET28a（+）鄄COD接于LB培養(yǎng)基，在37℃、200 r/ min的搖床上過夜培養(yǎng)。8 000 r/min離心1 min收集菌體，質(zhì)粒提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化按產(chǎn)品說明書操作。

1.2.3ChOAb基因序列的擴(kuò)增以重組質(zhì)粒pET28a（+）鄄COD為模板，進(jìn)行COD基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，64.8℃退火45 s，72℃延伸2 min，30次循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物。

1.2.4pHsh鄄COD表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、XbaⅠ將PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒pHsh分別進(jìn)行雙酶切，37℃反應(yīng)2 h。隨后兩個(gè)反應(yīng)液分別用膠回收試劑盒純化，將兩個(gè)片段連接，使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法得到重組E.coli BL21（DE3）/pHsh鄄COD，利用含100滋g/mL氨芐青霉索的LB平板篩選具抗性單菌落，然后搖瓶培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒，雙酶切鑒定。

1.2.5粗酶液的制備從固體LB培養(yǎng)基上取單菌落至含100滋g/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，選取較低溫度30℃，200 r/min過夜培養(yǎng)，即為種子液。接體積分?jǐn)?shù)5%種子液接種于新LB培養(yǎng)基，在較低溫度30℃培養(yǎng)至OD600=0.7，42℃較高溫度誘導(dǎo)5 h。發(fā)酵結(jié)束后，8 000 r/min離心5 min收集菌體，稱濕質(zhì)量，按1∶20（g/mL）的比例加入20 mmol/L pH 7.5的磷酸緩沖液重懸菌液，超聲破碎4 min停1 min，超聲30 min后8 000 r/min離心10 min，棄沉淀，即獲得粗酶液。

1.2.6COD酶活測定酶活測定的原理及具體方法參照文獻(xiàn)［16］。酶活力單位定義：在37℃下，每分鐘轉(zhuǎn)化1 μmol膽固醇生成膽甾鄄4鄄烯鄄3鄄酮所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.7COD的純化按鎳柱使用說明書純化。

1.2.8重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析以下都以酶活力最高值為100%計(jì)算相對(duì)活性，確定膽固醇氧化酶酶學(xué)性質(zhì)：

1）最適pH：使用pH 4～10的檢測液在37℃下測定酶活力。

2）pH穩(wěn)定性：將酶在不同的pH值（4～12）緩沖液中37℃放置1 h后測定酶活。

3）最適溫度：控制pH為7.5，在30～60℃范圍內(nèi)每隔5℃測定酶活。

4）溫度穩(wěn)定性：控制pH為7.5，在50℃保溫不同的時(shí)間，測定酶活。

5）酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定：以0.2～2 mmol/L的膽固醇為底物，在37℃，pH 7.5條件下測定酶的活性。采用雙倒數(shù)作圖法，計(jì)算動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1重組pHsh鄄COD的構(gòu)建

用1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，如圖1所示，為一條約1.7 kb的特異性條帶，與預(yù)期的COD基因大小一致。將PCR酶切產(chǎn)物與pHsh載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，挑取轉(zhuǎn)化子，37℃過夜培養(yǎng)提取質(zhì)粒。根據(jù)引物上設(shè)計(jì)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，分別用NcoⅠ、XbaⅠ酶切轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖1，有1.7 kb 及2.4 kb兩條帶，與預(yù)期的目的條帶一致，說明重組pHsh鄄COD構(gòu)建成功。將重組pHsh鄄COD送上海生工生物工程有限公司測定其中ChOb基因序列，結(jié)果與GenBank中序列一致。

2.2E.coli BL21（DE3）/pHsh鄄COD發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成不同，對(duì)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)有較大的影響［15，17-18］。選擇不同的培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的影響如圖2所示。以TB培養(yǎng)基誘導(dǎo)COD時(shí)COD的酶活及比酶活較高，LB+M9培養(yǎng)基次之；僅以LB培養(yǎng)基誘導(dǎo)的COD酶活及產(chǎn)量最低，可能是LB培養(yǎng)基中沒有緩沖體系，pH的改變影響酶的表達(dá)；M9培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)的酶活也不高，M9培養(yǎng)基以無機(jī)鹽為主，可能營養(yǎng)條件不足，影響大腸桿菌的生產(chǎn)及表達(dá)。所以選擇TB培養(yǎng)基重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

圖1　ChOb基因的PCR擴(kuò)增與重組pHsh鄄COD的雙酶切驗(yàn)證Fig.1　PCR amplification of ChOb and analysis of pHsh鄄COD restriction enzyme digestion

圖2　不同培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)條件的影響Fig.2　Effect of different culture media on the induced condition

2.2.2誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定將種子液按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入TB培養(yǎng)基，培養(yǎng)不同時(shí)間后誘導(dǎo)，確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。如圖3所示，隨著誘導(dǎo)菌液OD600不斷升高，誘導(dǎo)后的酶活及平均產(chǎn)率也在升高。當(dāng)OD600為1.7左右后誘導(dǎo)，酶活及平均產(chǎn)率最高；OD600高于2后誘導(dǎo)，酶活及平均產(chǎn)率隨之下降。由圖，確定誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為菌液培養(yǎng)至OD600為1.5～1.7。

2.2.3誘導(dǎo)溫度的選擇由于σ32因子在高溫下被打開，低于30℃培養(yǎng)，重組蛋白質(zhì)表達(dá)的量極少，選擇將發(fā)酵液分別在30、37、42℃下誘導(dǎo)5 h，結(jié)果如圖4所示。30℃誘導(dǎo)，并沒有進(jìn)行熱激，此時(shí)菌體量多，但是酶活很低，表明此時(shí)主要是菌體量不斷增長，而有酶活可能只是菌體的本底表達(dá)；37℃誘導(dǎo)，菌體量比較多，且酶活有所提高，表明37℃培養(yǎng)，即可激發(fā)啟動(dòng)子，讓酶進(jìn)行表達(dá)；42℃誘導(dǎo)，菌體量比較少，但是酶活較高，表明在42℃下培養(yǎng)，菌體主要進(jìn)行酶的表達(dá)，單位菌體產(chǎn)酶量也最高。因此誘導(dǎo)溫度選擇42℃。

圖3　不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)酶產(chǎn)量的影響Fig.3　Effect of different induction opportunity on the induced condition

圖4　不同誘導(dǎo)溫度對(duì)酶產(chǎn)量的影響Fig.4　Effect of different induction temperature on the induced condition

2.2.4發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化將發(fā)酵液在42℃下誘導(dǎo)不同時(shí)間，如圖5所示。菌體量在3～9 h內(nèi)不斷上升，超過13 h后菌體量開始下降，其中5 h的單位菌體產(chǎn)酶量最高，選擇5 h為誘導(dǎo)時(shí)間。最終酶量855 U/L。

2.3COD的純化

COD的純化是依賴于酶的C端帶有His鄄tag，可用鎳柱進(jìn)行純化（見圖6）。純化過程配制咪唑濃度梯度進(jìn)行洗脫，分別是50，100，200，300 mmol/L以及400 mmol/L，將洗脫液處理后，用SDS鄄PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)在使用400 mmol/L咪唑濃度洗脫時(shí)，出現(xiàn)單一條帶，約為55 kDa，與目的條帶大小一致。

2.4重組COD的酶學(xué)性質(zhì)研究

對(duì)重組膽固醇氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究（圖7—10）。該酶的最適pH為7.0，在pH 5.0～7.0保存較穩(wěn)定，在pH 7.0～11.0酶活緩慢下降，在pH 4.0及pH 12.0的緩沖液中，酶已喪失活性。

圖5　不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶產(chǎn)量的影響Fig.5　Effect of different induction time on the induced condition

圖6　COD純化過程SDS鄄PAGE鑒定Fig.6　SDS鄄PAGE identification of COD purified process

該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，由于該酶的熱穩(wěn)定性較差，變性溫度在55℃左右，選取50℃測其熱穩(wěn)定性，可以有效縮短測定時(shí)間。在50℃保溫，測其半衰期為6.9 min，保溫25 min后還剩9.08%的酶活力。以0.2～2 mmol/L的膽固醇為底物，在pH 7.5，37℃條件下測定酶活，計(jì)算得動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km為3.38 mmol/L，kcat/Km為6.09 s-1·（mmol/L）。

圖7　COD最適反應(yīng)pHFig.7　Optimum pH of COD

圖8　COD的pH穩(wěn)定性Fig.8　pH stability of COD

圖9　COD的最適反應(yīng)溫度Fig.9　Optimum temperature of COD

圖10　COD的50℃時(shí)的穩(wěn)定性Fig.1　0Temperature stability of COD

3　討論

膽固醇氧化酶是黃素氧化還原酶家族的典型結(jié)構(gòu)模式酶，利用溫控誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的方式可以作為有效的方法來借鑒。

pHsh溫控表達(dá)載體是受E.coli細(xì)胞內(nèi)σ32調(diào)控，在較高溫度下培養(yǎng)，刺激σ32因子的表達(dá)，隨后激發(fā)目的蛋白質(zhì)大量表達(dá)。由于誘導(dǎo)的條件需要較高的溫度，耐高溫的酶可能比較合適用這種載體進(jìn)行表達(dá)，其中極耐熱性的β鄄葡萄糖醛酸酶基因構(gòu)建在pHsh載體上得到了高效的表達(dá)［19］。

膽固醇氧化酶的表達(dá)，作者所在實(shí)驗(yàn)室曾構(gòu)建在pET鄄28a（+）載體上，誘導(dǎo)的過程需要添加IPTG或者乳糖，且多一步操作過程，也增加了染菌的風(fēng)險(xiǎn)；使用pHsh熱激表達(dá)載體構(gòu)建膽固醇氧化酶，由于其溫控的原理，只需在合適的時(shí)候?qū)囟冗M(jìn)行控制，即可表達(dá)大量的酶，操作十分簡便。重組pET鄄28a（+）鄄COD在大腸桿菌中的高水平表達(dá)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集而形成不溶的、無活性的包涵體［20］；而重組pHsh鄄COD的表達(dá)產(chǎn)物并沒有包涵體，但是由于此COD的穩(wěn)定性較差，較高溫度的誘導(dǎo)可能在誘導(dǎo)過程中一部分酶已經(jīng)失活，從而影響表達(dá)的酶總量，重組pHsh鄄COD表達(dá)的酶量僅是pET鄄28a（+）鄄COD表達(dá)酶量的1/10。

4　結(jié)語

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，重組pHsh鄄COD的表達(dá)最好是使用TB培養(yǎng)基，但從成本角度看，TB培養(yǎng)基的成本仍然比較高，因此可以進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基，降低培養(yǎng)成本。

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Expression of Cholesterol Oxidase with Temperature Induced Vector pHsh

YUAN Ye，ZHANG Ling，SHAO Weilan，WANG Wu，YANG Hailin
（1.Key Laboratory of Industry Biotechnology of Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212000，China）

Cholesterol oxidase is of great value to be applied in medicine，food and agriculture.In this study，cholesterol oxidase from Rhodococcus sp.was constructed into the temperature-induced vector pHsh and then by controlling the culture temperature，the gene was successfully expressed in E.coli without adding inducer.The fermentation optimization of cholesterol oxidase was carried out in the shake flask level.With the optimum condition，the enzyme activity reached 855 U/L.When purified to homogeneity using Ni-NTA，the resulting enzyme had the molecular mass of 55 kDa，the optimal pH 7.0 and temperature 40℃.The enzyme was also stable over a pH range of 5.0～7.0，with t1/2of 6.9 min at 50℃.With cholesterol as substrate at pH 7.5 and 37℃，the kinetic parameters Kmand kcat/Kmwere 3.38 mM and 6.09 s-1·mM-1，respectively.

cholesterol oxidase，pHsh，temperature-induced

Q 78

A

1673—1689（2016）03—0272—06

2014-12-25

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31340027）；江南大學(xué)自主科研重點(diǎn)項(xiàng)目（JUSRP51402A）。

楊海麟（1971—），男，江蘇無錫人，工學(xué)博士，副教授，主要從事發(fā)酵工程方面的研究。E-mail：19891996@sina.com