徐文強，楊瑩，彭井華，陳貞月，王占坤，馬雙雙，宋小莉

(山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355)

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葛根與地龍聯(lián)合應用對大鼠腦缺血再灌注損傷的預防作用及其機制探討

徐文強，楊瑩，彭井華，陳貞月，王占坤，馬雙雙，宋小莉

(山東中醫(yī)藥大學，濟南 250355)

目的觀察葛根與地龍聯(lián)合應用對大鼠腦缺血再灌注損傷的預防作用，并探討其可能機制。方法106只Wistar大鼠隨機分為7組，A組以0.787 5 g/kg葛根+0.525 g/kg地龍灌胃，B組予1.575 g/kg葛根+1.05 g/kg地龍，C組予1.575 g/kg葛根，D組予1.05 g/kg地龍，E組予6.3 mg/kg尼莫地平片，F(xiàn)、G組均予0.9%生理鹽水10 mL/kg。連續(xù)給藥14 d后，A、B、C、D、E、F組均制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型，G組除不插栓線外，全過程同其他組。計算各組腦組織腦梗死體積，采用水溶性四氮唑法檢測血清超氧化物歧化酶(SOD)，硫代巴比妥酸法檢測血清丙二醛(MDA)，比色法檢測血清乳酸脫氫酶(LDH)。結(jié)果與G組比較，F(xiàn)組腦梗死體積增加，血清SOD活性降低，LDH、MDA含量升高；與F組比較，A、B、C、D、E組腦梗死體積減少，B組血清SOD活性升高及LDH、MDA含量降低；與C組比較，B組腦梗死體積減少，血清SOD活性升高，LDH、MDA含量降低；與D組比較，A、B組腦梗死體積減少，血清SOD活性升高，MDA含量降低。結(jié)論葛根與地龍聯(lián)合應用可有效預防大鼠腦缺血再灌注損傷，尤以高劑量葛根、地龍聯(lián)合應用效果更佳，其機制可能與增加血清SOD活性及降低LDH、MDA含量有關。

葛根；地龍；腦缺血再灌注損傷；動物實驗

缺血性腦血管疾病是人類致殘和致死的主要病因之一，其發(fā)病率逐年升高，患病人群也有年輕化趨勢。積極尋找新的抗腦缺血藥物、提高現(xiàn)有藥物的臨床療效是目前亟待解決的難題。在中藥歸經(jīng)理論中，引經(jīng)藥可以引導與之配伍的其他藥物達于病所，從而提高療效[1]。葛根為陽明經(jīng)的引經(jīng)藥，能升陽明清氣、引藥上行。文獻[2～4]報道，針刺陽明經(jīng)腧穴可改善腦卒中患者運動功能，明顯改善患者血液流變學指標，療效顯著。因此，通過配伍引藥葛根，借助其引經(jīng)報使作用，對于提高抗腦缺血藥物的療效具有重要的意義。本研究觀察了葛根與地龍聯(lián)合應用對大鼠腦缺血再灌注損傷的預防作用，并探討其可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、藥品與試劑SPF級Wistar大鼠106只，雌雄各半，體質(zhì)量280～300 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供。地龍、葛根(山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院)，尼莫地平(山東新華制藥股份有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，TTC染色試劑、PBS緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2實驗動物分組及葛根、地龍用法健康Wistar大鼠106只，實驗條件下適應性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為7組，A、B、C、D、E、F組各16只，G組10只。A組大鼠以0.787 5 g/kg葛根+0.525 g/kg地龍灌胃，B組予1.575 g/kg葛根+1.05 g/kg地龍，C組予1.575 g/kg葛根，D組予1.05 g/kg地龍，E組予6.3 mg/kg尼莫地平片，F(xiàn)、G組均予0.9%生理鹽水10 mL/kg。

1.3腦缺血再灌注損傷模型制備連續(xù)給藥14 d后，各組大鼠均經(jīng)1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔麻醉后，分離頸總動脈及頸內(nèi)動脈、頸外動脈。G組不進行任何操作，縫合傷口；其余各組均采用大腦中動脈線栓法[5]建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，即結(jié)扎頸總動脈以及頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，在頸總動脈下穿線備用，在頸總動脈作一切口，將栓線從切口插入到頸內(nèi)動脈，松開動脈夾，插入18～20 mm遇到阻力即可用備用穿線固定，縫合傷口后，將大鼠放入籠中，并采取保溫措施。缺血2 h將栓線拔離動脈分叉口。再灌注24 h后參照文獻[6]方法進行五分制標準評分，無神經(jīng)功能缺損癥狀計0分，不能完全伸展右側(cè)前肢計1分，向右側(cè)旋轉(zhuǎn)計2分，向右側(cè)傾倒計3分，不能自發(fā)行走、意識障礙計4分，去除評分為0分和4分的大鼠。

1.4大鼠腦組織腦梗死體積測算腦缺血2 h再灌注24 h后，各組大鼠麻醉后斷頭取腦，于-20 ℃冰箱中速凍20 min，將鼠腦切成5片，隔2 mm切一片。將切片置于2%TTC中，用錫箔紙蓋住后，放入37 ℃溫箱15～30 min，不時翻動腦片，使均勻接觸到染色液。用Image pro plus6.0測得梗死面積，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積，結(jié)果以梗死灶體積占全腦體積的百分率表示。

1.5大鼠血清SOD活性及MDA、LDH含量檢測缺血再灌注24 h后，大鼠腹主動脈取血5 mL。3 500 r/min離心10 min，取上清液，采用水溶性四氮唑法檢測血清SOD活性，硫代巴比妥酸法測定血清MDA，比色法測定血清LDH，操作按試劑盒說明書進行。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠腦梗死體積比較去除神經(jīng)功能學評分為0分和4分的大鼠以及在飼養(yǎng)過程中死亡的大鼠，每組樣本數(shù)為8只。A、B、C、D、E、F、G組大鼠鬧梗死體積分別為15.660 0%±5.901 6%、13.160 0%±7.581 9%、24.760 0%±7.669 4%、20.760 0%±7.969 9%、27.760 0%±6.193 0%、35.570 0%±3.959 1%，F(xiàn)組與G組比較，A、B、C、D、E組與F組比較，A、B組與C組比較，B組與D組比較，P均<0.05。

2.2各組大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量比較大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量比較見表1。

表1　　　　各組大鼠血清SOD活性及LDH、MDA含量

注：與G組比較，*P<0.01；與F組比較，ΔP<0.05；與C組比較，★P<0.05；與D組比較，#P<0.05。

3　討論

腦血管病是目前公認的三大死亡原因之一，在我國腦血管病的病死率僅次于惡性腫瘤[7]。腦缺血占腦血管病的80%～85%，臨床上一般用溶栓治療來解除梗塞,建立缺血區(qū)域血流再灌注，讓缺血組織和器官重新獲得氧、營養(yǎng)物質(zhì)，并清除有害的代謝產(chǎn)物。然而，近年研究發(fā)現(xiàn)[8]，及時恢復血液再灌注雖有利于減輕缺血損傷，使某些可逆性損傷在功能上獲得恢復，但缺血后恢復血流也有其不利的一面，如某些情況下出現(xiàn)能導致組織損傷和功能障礙進一步加重的再灌注損傷。因此，尋找有效的預防腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護藥物、提高藥物療效、減少不良反應是目前抗腦缺血藥物研究的熱點。

引經(jīng)是在中醫(yī)藥學歸經(jīng)與配伍理論基礎上，經(jīng)過長期臨床實踐總結(jié)出的用藥經(jīng)驗。引經(jīng)藥指藥物對某些臟腑經(jīng)絡有特殊的親和作用，因而對這些部位的病變具有主要或者特殊的治療作用。古人云：“引經(jīng)之藥，劑中用為向?qū)?，則能接引眾藥，直入本經(jīng)，用力寡而獲效捷也。”利用引經(jīng)藥可引導相應中藥以及靶向藥物進入病所病灶來扶正祛邪。臨床上常用的引經(jīng)藥有葛根、柴胡、桔梗等。葛根，為豆科植物野葛的干燥根，習稱野葛，有解肌退熱、透疹、生津止渴、升舉清陽之功。葛根是臨床預防心腦血管疾病的常用藥物，且實驗研究也證實其抗腦缺血的藥理作用[9,10]。葛根是陽明胃經(jīng)的引經(jīng)藥，實驗研究[11]表明隨著葛根濃度的升高，食管癌細胞水通蛋白1表達也上調(diào)，可使其他藥物容易進入靶部位來增強療效，發(fā)揮治療作用。

地龍是我國重要的中藥材之一，李時珍在《本草綱目》稱之具有通經(jīng)活絡、活血化瘀等作用。文獻[12,13]報道，地龍可以提高腦缺血再灌注損傷后腦組織SOD、GSH-PX活性，降低Caspase-3活性，清除自由基、炎癥細胞因子、減輕氧應激損傷及抗神經(jīng)細胞凋亡等作用。本研究顯示，B組SOD活性增加，MDA、LDH含量降低，相對梗死體積最小，且較單用地龍或葛根效果好，說明地龍與引經(jīng)藥葛根配伍具有協(xié)同作用。雖然A組各指標與其他組的差異不如B組，但仍優(yōu)于單藥組。提示通過兩藥聯(lián)合應用，能更加有效地清除機體內(nèi)氧自由基，避免細胞氧化性損傷，減少腦組織缺血性損害，降低腦部細胞的損傷程度。這可能與葛根引藥效入陽明經(jīng)，引導地龍藥效的充分發(fā)揮有關。因此，通過對地龍與引經(jīng)藥葛根合用的藥理作用研究，為現(xiàn)代臨床應用引經(jīng)理論預防腦缺血再灌注損傷提供一種重要思路與依據(jù)。

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山東省高等學?？萍加媱濏椖?J13LK52)；山東中醫(yī)藥大學2015年度國家級大學生研究訓練計劃(SRT)項目(201510441076)。

楊瑩(E-mail: yangying2245@126.com)，宋 小 莉(E-mail: sxlbwd@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.013

R743.31

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1002-266X(2016)15-0041-03

2015-12-03)