武雪亮，王立坤，薛軍，楊東東，屈明，郭飛，楊瑞敏，馬鵬程，劉博

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

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結(jié)直腸癌組織中Id-1、MMP-9的表達(dá)變化及其意義

武雪亮，王立坤，薛軍，楊東東，屈明，郭飛，楊瑞敏，馬鵬程，劉博

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

目的觀察結(jié)直腸癌組織中癌基因DNA結(jié)合分化抑制蛋白1(Id-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達(dá)變化，并探討其意義。方法結(jié)直腸癌組織50例份(觀察組)，正常結(jié)直腸組織50例份(對(duì)照組)，分別采用免疫組化法、RT-PCR法、Western blotting法檢測(cè)兩組Id-1、MMP-9，分析Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果觀察組及對(duì)照組Id-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為72%、24%，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率分別為78%、22%，兩組比較，P均<0.05。Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)均與結(jié)直腸癌漿膜浸潤(rùn)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)相關(guān)(P均<0.05)。觀察組及對(duì)照組Id-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±0.03、0.20±0.04，MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.88±0.04、0.21±0.03，兩組比較，P均<0.05。觀察組及對(duì)照組Id-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.82±0.04、0.31±0.02，MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為0.86±0.05、0.29±0.03，兩組比較，P均<0.05。結(jié)論結(jié)直腸癌組織中Id-1、MMP-9表達(dá)升高，二者表達(dá)與結(jié)直腸癌漿膜浸潤(rùn)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤(rùn)相關(guān)。

結(jié)腸癌；直腸癌；DNA結(jié)合分化抑制蛋白1；基質(zhì)金屬蛋白酶9

最新流行病學(xué)研究顯示，未來(lái)5年我國(guó)結(jié)直腸癌新發(fā)病例將呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡有提前趨勢(shì)，嚴(yán)重危害國(guó)民健康。復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(直接浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移等)是結(jié)直腸癌患者預(yù)后差的主要原因[1,2]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，DNA結(jié)合分化抑制蛋白1(Id-1)能誘導(dǎo)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲，其表達(dá)缺失、沉默與多種惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、預(yù)后密切相關(guān)[3～7]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)不僅能降解間質(zhì)內(nèi)的基質(zhì)成分，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞突破基底膜侵襲鄰近組織，而且能促進(jìn)腫瘤微血管的形成，加速血行轉(zhuǎn)移。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織中Id-1、MMP-9的表達(dá)變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2012年5月～2014年5月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者50例，男29例，女21例；年齡33～70歲，中位年齡56歲，其中≥60歲34例、<60歲16例；腫瘤直徑≥5 cm 31例，<5 cm 19例；有漿膜浸潤(rùn)39例，無(wú)漿膜浸潤(rùn)11例；高分化12例，中分化21例，低分化17例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期37例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例；有肝轉(zhuǎn)移15例，無(wú)肝轉(zhuǎn)移35例；有脈管浸潤(rùn)16例，無(wú)脈管浸潤(rùn)34例。手術(shù)留取結(jié)直腸癌組織50例份(觀察組)和癌旁(距離腫瘤組織>5 cm)正常組織50例份(對(duì)照組)。

1.2Id-1、MMP-9蛋白檢測(cè)方法①免疫組化法:收集蠟塊并切片，切片厚度為4 μm。HE染色，病理診斷。切片經(jīng)過(guò)80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脫水，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復(fù)；PBS洗3次，加入兔抗人單克隆Id-1抗體(1∶250)、鼠抗人MMP-9單克隆抗體(1∶150)，4 ℃過(guò)夜；PBS洗3次，加入相關(guān)二抗。室溫下使用DAB顯色試劑顯色，蘇木精輕度復(fù)染，1%的鹽酸乙醇分化5 min、梯度乙醇脫水80%、85%、90%、95%、100%、100%及松節(jié)油透明5 min，最后以樹(shù)膠封片。陰性對(duì)照為PBS代替一抗。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色、褐色顆粒，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率并計(jì)分，≤5%計(jì)0分，6%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；無(wú)著色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，黃色計(jì)2分，深黃色計(jì)3分。兩者相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～1 2分為(+++)，(+)～(+++)均視為陽(yáng)性。②蛋白質(zhì)印跡法:RIPA裂解液提取總蛋白并定量。取50 μg蛋白，置入5×緩沖液(4∶1)，100 ℃水浴，5 min 3次，SDS-PAGE電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，取出膜，加5%脫脂奶粉，棄封閉液滴加特異性的一抗(Id-1為1∶1 500，MMP-9為1∶150，GAPDH為1∶150)-4 ℃孵育過(guò)夜，加TBST洗滌液，10 min 3次，滴加特異性二抗(1∶1 500)37 ℃孵育1 h，再次加入TBST洗滌液，10 min 3次，ECL法檢測(cè)條帶，應(yīng)用Gel Pro-Analyzer3.1軟件進(jìn)行密度定量分析，以Id-1/GAPDH和MMP-9/GAPDH值來(lái)作為Id-1、MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3Id-1、MMP-9 mRNA檢測(cè)方法采用RT-PCR法。提取并測(cè)定總RNA濃度，反應(yīng)體系：PCR Buffer×1，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA模板200 ng，Taq酶1.25 μL，隨機(jī)引物濃度0.4 mol/L，RNA酶抑制劑1 μL，反應(yīng)總體積25 μL。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行擴(kuò)增：Id-1：5′-CTGAGGCACTG-GCGAGGAGA-3′，5′-GAGAAGCACCAAACGTGACCAT-3′；MMP-9：5′-TGGAGTCACTGTACACCCTC-3’，5′-CGGACATCCG-CTAAACAGGT-3′；GAPDH(內(nèi)參)：5′-ACC-CACTCC-TCCACCTTGA-3′，5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′。以1 μL DNA樣本作為模板，以去離子水為陰性對(duì)照模板；擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、10 s，退火溫度15 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。應(yīng)用Gel Pro-Analyzer3.1軟件進(jìn)行密度定量分析，以Id-1/GAPDH和MMP-9/GAPDH值來(lái)作為Id-1、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果

2.1兩組Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率比較觀察組及對(duì)照組Id-1陽(yáng)性表達(dá)率分別為72%(36/50)、24%(12/50)，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率分別為78%(39/50)、22%(11/50)，兩組比較，P均<0.05。

2.2Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)均與結(jié)直腸癌漿膜浸潤(rùn)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)相關(guān)(P均<0.05)。

2.3兩組Id-1、MMP-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較觀察組及對(duì)照組Id-1的相對(duì)表達(dá)量分別為0.82±0.04、0.31±0.02，MMP-9的相對(duì)表達(dá)量分別為0.86±0.05、0.29±0.03，兩組比較，P均<0.05。

2.4兩組Id-1、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較觀察組及對(duì)照組Id-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±0.03、0.20±0.04，MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為0.88±0.04、0.21±0.03，兩組比較，P均<0.05。

表1　Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3　討論

目前，結(jié)直腸癌的治療以手術(shù)治療為主，但早期治療效果最佳，且術(shù)后積極復(fù)查預(yù)防復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵。因此，尋找有效、特異性高的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)結(jié)直腸癌的早期診斷及術(shù)后防治有極其重要的價(jià)值。

Id-1是螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族重要成員，在正常組織中呈不表達(dá)或低表達(dá)，而在惡性腫瘤及體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中呈高表達(dá)[9]。Id-1通過(guò)與E2A結(jié)合形成特異性復(fù)合物抑制E2A活化P21，激活CDK2誘導(dǎo)Rb蛋白磷酸化，而Rb蛋白的磷酸化在腫瘤增殖中發(fā)揮重要作用，能抑制細(xì)胞分裂周期中G1/S停滯，促使細(xì)胞分裂周期順利進(jìn)行[10]。此外，Id-1表達(dá)上調(diào)能激活Raf-1及MAPK激酶信號(hào)傳導(dǎo)途徑，抑制細(xì)胞凋亡，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[11]。

MMP-9能有效降解腫瘤細(xì)胞表面的基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞穿過(guò)破壞的基底膜向鄰近組織侵襲，促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[12]。MMP-9還能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞自基底膜的釋放和遷移，促進(jìn)微血管的形成，并為腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)提供必要的空間和營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)[13]。大量研究[14,15]表明，MMP-9在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)狀態(tài)；體外侵襲實(shí)驗(yàn)也證，實(shí)腫瘤細(xì)胞的高侵襲轉(zhuǎn)移能力與MMP-9的過(guò)表達(dá)密切相關(guān)。

研究[16]證實(shí)，將PD98059導(dǎo)入轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中抑制Id-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MMP-9和MT1-MMP表達(dá)水平均隨之下降，腫瘤細(xì)胞的侵襲能力亦明顯降低。此外，在前列腺癌細(xì)胞系的研究[17]中也發(fā)現(xiàn)Id-1能調(diào)節(jié)MMP-9表達(dá)，考慮上調(diào)的Id-1通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)錄而上調(diào)VEGF的表達(dá)，并激活MMP-9的分泌，從而促進(jìn)腫瘤微血管生成和轉(zhuǎn)移。胡斌等[18]發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中Id-1和MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)，Id-1通過(guò)促進(jìn)MMP-9的表達(dá)，調(diào)控大腸癌細(xì)胞的侵襲、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

本研究顯示，觀察組Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率高于對(duì)照組，且Id-1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)程度、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)相關(guān)。此外，RT-PCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果與免疫組化檢測(cè)結(jié)果基本一致。表明Id-1在結(jié)直腸癌組織中的高表達(dá)不僅與結(jié)直腸腺癌的發(fā)生進(jìn)展有關(guān)，而且與腫瘤的浸潤(rùn)和侵襲相關(guān)。郭云[19]對(duì)62例直腸癌組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Id-1在癌組織中呈100%陽(yáng)性染色，與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且與Ki-67和VEGF亦呈正相關(guān)，考慮Id-1與Ki-67、VEGF具有協(xié)同作用。

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Expression changes of Id-1 and MMP-9 in colorectal carcinoma tissues and its clinical significance

WU Xueliang, WANG Likun, XUE Jun, YANG Dongdong, QU Ming, GUO Fei,YANG Ruimin, MA Pengcheng, LIU Bo

(The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

ObjectiveTo observe the expression changes of inhibitor of DNA binding-1 (Id-1) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in the human colorectal carcinoma tissues and to discuss the clinical significance. MethodsThe expression of Id-1 and MMP-9 in 50 specimens of colorectal carcinoma tissues (observation group) and 50 specimens of normal colorectal tissues (control group) was detected by immunohistochemistry, RT-PCR and Western blotting. The correlations between their positive expression and the clinicopathological features were analyzed. ResultsThe positive rates of Id-1 in the observation group and the control group were 72% and 24%, the positive rates of MMP-9 were 78% and 22%, respectively, and there were significant differences between these two groups (all P<0.05). The positive expression of Id-1 and MMP-9 was related with the depth of tumor invasion, TNM stage, lymph node metastasis, vessel invasion and liver metastasis (all P<0.05). The relative expression of Id-1 mRNA in the observation group and the control group was 0.96±0.03 and 0.20±0.04, the relative expression of MMP-9 mRNA was 0.88±0.04 and 0.21±0.03, respectively, and there were significant differences (all P<0.05). The relative expression of Id-1 protein was 0.82±0.04 and 0.31±0.02, the relative expression of MMP-9 in the observation group and the control group was 0.86±0.05 and 0.29±0.03, respectively, and there were significant differences between these two groups (all P<0.05). ConclusionThe expression of Id-1 and MMP-9 was increased in the human colorectal carcinoma tissues, and the expression was related with tumor invasion, TNM stage, lymph node metastasis, liver metastasis and vessel invasion.

colon carcinoma; rectal carcinoma; inhibitor of DNA binding-1; matrix metalloproteinase-9

河北省衛(wèi)計(jì)委醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20150058)；河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(152777237)；張家口市科技局指令性計(jì)劃(1311055D)。

武雪亮(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)橄缾盒阅[瘤的臨床診治與基礎(chǔ)研究。E-mail: wxlwlk@163.com

簡(jiǎn)介：薛軍(1965-)，男，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槲改c道惡性腫瘤的基礎(chǔ)與臨床診治。E-mail: yfyxuejun@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.009

R735.35

A

1002-266X(2016)15-0030-04

2016-01-27)