劉貝貝，張 霄，謝雅晶，焦凌霞，劉 媛，張存政，趙巖巖，武愛華，劉賢金

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；3河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

Bt Cry1類毒素共性結(jié)構(gòu)域的分析、表達(dá)及鑒定

劉貝貝1，2，張 霄2，謝雅晶2，焦凌霞3，劉 媛1，2，張存政2，趙巖巖2，武愛華2，劉賢金1，2

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014；3河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

【目的】分析定位Bt Cry1類毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F的共性結(jié)構(gòu)域，克隆并表達(dá)共性結(jié)構(gòu)域蛋白，為篩選Bt毒素廣譜抗體及建立廣譜檢測方法打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坷蒙镄畔W(xué)和分子模擬技術(shù)，通過SWISS-MODEL同源建模分別對5種Cry1類毒素進(jìn)行三維建模，并結(jié)合Ramachandran plot、ERRAT和Verify3D方法評價模型構(gòu)象的合理性。通過分析比對5種Cry1類毒素的三維結(jié)構(gòu)，確定Domain I 區(qū)域作為5種Cry1毒素的共性結(jié)構(gòu)域。以含Cry1Ac基因的蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種為模板設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增獲得共性結(jié)構(gòu)域Domain I基因，將其經(jīng)Nco I和Not I雙酶切連接至原核表達(dá)載體pET-26b（+），構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-26b-Domain I。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、雙酶切以及測序鑒定驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21 （DE3），經(jīng)終濃度為1 mmol·L-1的IPTG在20℃下誘導(dǎo)表達(dá)16 h后檢測共性結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)情況。離心收集誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌菌液，進(jìn)行超聲波破碎處理，收集上清及沉淀，采用 SDS-PAGE 分析融合蛋白的表達(dá)。利用His-Trap HP鎳親和柱純化上清中的可溶性融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、Western blot和ELISA試驗(yàn)驗(yàn)證純化的共性結(jié)構(gòu)域蛋白的生物活性?！窘Y(jié)果】基于氨基酸序列及三維空間比對分析，發(fā)現(xiàn) 5種 Cry1類毒素的Domain I 的序列一致性最高，而且它們的DomainⅠ三維結(jié)構(gòu)幾乎完全重合，確定Domain I 區(qū)域作為5種Cry1毒素的共性結(jié)構(gòu)域；通過PCR、雙酶切及測序鑒定成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-26b-Domain I，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、His-Trap HP鎳親和柱純化獲得了可溶性的Domain I共性結(jié)構(gòu)域蛋白；SDS-PAGE和Western blot證實(shí)表達(dá)的共性結(jié)構(gòu)域蛋白的分子量約為33.4 kD，且能與抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；ELISA試驗(yàn)證實(shí)共性結(jié)構(gòu)域蛋白與5種Cry1類毒素特異性抗體均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，抗原表位分析結(jié)果顯示共性結(jié)構(gòu)域蛋白具有和完整的 Cry蛋白存在多個潛在抗原表位位點(diǎn)的特征，抗原表位區(qū)域所占的比例分別為 48.4%和63.6%，表明共性結(jié)構(gòu)域蛋白具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性?！窘Y(jié)論】基于分子模擬與分子克隆技術(shù)，成功定位及表達(dá)純化獲得共性結(jié)構(gòu)域蛋白，為下一步利用共性結(jié)構(gòu)域?yàn)榘袠?biāo)分子制備廣譜特異性識別Cry1類毒素抗體打下基礎(chǔ)。

Bt Cry1類毒素；共性結(jié)構(gòu)域；原核表達(dá)；純化

0　引言

【研究意義】隨著轉(zhuǎn)Bt Cry基因在抗蟲性作物中大面積的推廣及應(yīng)用，在給人類帶來極其顯著的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益的同時，其應(yīng)用存在的生態(tài)安全風(fēng)險以及對人類和其他非靶標(biāo)生物的安全隱患也備受關(guān)注［1-3］，越來越多的國家針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品建立了標(biāo)識系統(tǒng)［4］，因此對 Cry毒素表達(dá)產(chǎn)物安全篩查檢測就尤顯迫切。目前報(bào)道對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中毒素蛋白的檢測方法和市場應(yīng)用的ELISA試劑盒主要是單一毒素的抗體檢測［5-7］，而且不同的毒素需要制備相應(yīng)抗體，周期長、成本高，難以滿足實(shí)際應(yīng)用時一種抗體檢測多種毒素的需求。因此，憑借Bt Cry毒素三維結(jié)構(gòu)具有較高相似性的特點(diǎn)，開發(fā)基于共性結(jié)構(gòu)的Bt Cry毒素廣譜特異性檢測技術(shù)是一項(xiàng)非常有應(yīng)用價值的工作。【前人研究進(jìn)展】目前，針對小分子有害物質(zhì)多殘留免疫分析技術(shù)主要利用小分子的共性結(jié)構(gòu)作為半抗原制備廣譜特異性抗體用于檢測［8-10］。研究發(fā)現(xiàn)盡管Cry毒素的氨基酸序列相似性很低，但是它們的三維結(jié)構(gòu)均非常相似，都是由3個結(jié)構(gòu)域組成，且存在大量的保守區(qū)域［11］。趙新民等［12］在對Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa 和Cry4Aa 4類具有代表性毒素三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測和對比分析中發(fā)現(xiàn)它們的三級結(jié)構(gòu)模型非常相似，其中DomainⅠ幾乎完全相同，結(jié)構(gòu)的相似性高于其序列的相似性；吳洪福等［13］對已解析的Bt晶體蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)它們都有類似的結(jié)構(gòu)，而且單獨(dú)比較各種Cry蛋白的DomainⅠ，發(fā)現(xiàn)它們的DomainⅠ差別最小。而針對多種Cry毒素的廣譜檢測目前還未見報(bào)道。目前，美國Envirologix 公司生產(chǎn)的Cry1Ab/Cry1Ac平板試劑盒，能夠同時檢測Cry1Ab/Cry1Ac兩種毒素［6，14］，這是基于它們的三維結(jié)構(gòu)具有高度相似性的特點(diǎn)，也為后續(xù)研究提供了依據(jù)。【本研究切入點(diǎn)】基于Cry毒素具有共性結(jié)構(gòu)域，以及抗體對共性結(jié)構(gòu)域存在很強(qiáng)的交叉反應(yīng)［15-17］，分析定位Cry1類毒素的共性結(jié)構(gòu)域，通過對其成功表達(dá)及生物活性驗(yàn)證，制備廣譜識別Cry1類毒素的抗體，應(yīng)用于Cry毒素的廣譜檢測?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于序列及空間比對分析，定位共性結(jié)構(gòu)域；表達(dá)純化共性結(jié)構(gòu)域蛋白，并驗(yàn)證其生物活性，為下一步制備廣譜抗體打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

試驗(yàn)于2014年5月至2015年11月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種（Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki 2671）為徐健博士提供（江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所）；表達(dá)載體pET-26b（+）購于Novagen公司；E. coli Trans10、E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)材料與試劑 引物合成由上海生工生物工程有限公司完成；PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自 Axygen公司；Taq DNA聚合酶、Nco I、Not I內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；His-Trap HP純化柱購自GE Healthcare公司；其他試劑均為分析純級試劑。

1.2 方法

1.2.1 序列比對、同源建模及模型評價 從 NCBI數(shù)據(jù)庫檢索5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的氨基酸序列（登錄號分別為ALJ10947.1、KF148682.1、ABQ23438.1、BAM67040.1、ACD50893.1），進(jìn)行多序列比對分析。然后分別以5 種 Cry1類毒素的 Domain I作為目標(biāo)蛋白序列，用BLAST中的 blastp suite對 PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分別進(jìn)行多序列同源性搜索，取同源性最高的晶體結(jié)構(gòu)作為同源建模的模板。其中 Cry1Ac已經(jīng)獲得晶體結(jié)構(gòu)模型［18-19］，無需建模。利用Swiss-Model（http：//swissmodel. expasy.org/）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)同源建模服務(wù)器［20-21］，分別預(yù)測了4種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的 Domain I三維結(jié)構(gòu)，模建結(jié)構(gòu)采用PROCHECK［22］、ERRAT［23］以及Verify3D［24］進(jìn)行評估，檢測其合理性。

1.2.2 共性結(jié)構(gòu)域基因克隆 通過對5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）DomainⅠ的核苷酸序列及三維結(jié)構(gòu)比對，以其中任意一種毒素的DomainⅠ擴(kuò)增表達(dá)共性結(jié)構(gòu)域，是可行的。因此以筆者實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的含 Cry1Ac的蘇云金芽孢桿菌庫斯塔克亞種為模板來設(shè)計(jì)其DomainⅠ引物。設(shè)計(jì)引物時在DomainⅠ氨基酸序列C端加長6個氨基酸，并插入限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，以方便后續(xù)試驗(yàn)中原核表達(dá)載體的構(gòu)建以及共性結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)、純化研究。上游引物為5′-CATGC/CATGGATAACAATCCGAA CAT-3′，下劃線部分為NcoⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物為5′-ATAAGAATG/CGGCCGCGGATCCTCGAATTGG ATATCTTC-3′，下劃線部分為NotⅠ酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72℃終延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后，PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收、純化目的片段。

1.2.3 pET-26b-DomainⅠ重組質(zhì)粒的構(gòu)建 DomainⅠ基因PCR回收、純化產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-26b同時進(jìn)行NcoⅠ和NotⅠ雙酶切處理，純化回收后，T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli Trans10感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的菌液涂布于 LB-Kan（含 50 μg·mL-1Kanamycin）平板上，挑取陽性轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR擴(kuò)增鑒定及序列測定（由上海生物工程公司完成）。將測序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行序列同源性比對。

1.2.4 DomainⅠ共性結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)及純化 通過測序及雙酶切驗(yàn)證后，將pET-26b-DomainⅠ重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3），篩選陽性菌株。挑取陽性克隆，接種于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，次日按 1%比例轉(zhuǎn)接于含 50 μg·mL-1Kanamycin的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600約為 0.6—0.8，加入終濃度為 1 mmol·L-1IPTG，20℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h，以空載菌株為對照。4℃ 10 000×g離心15 min，收集菌體稱量濕重，以100 mg·mL-1比例用磷酸緩沖液（PBS，pH 7.4）重懸菌體，加入溶菌酶（終濃度1 mg·mL-1），PMSF（100 mmol·L-1）混勻后，于冰浴中超聲破碎菌體，12 000 ×g離心收集上清液，SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(dá)情況。

將收集的 DomainⅠ上清液上樣于經(jīng) Binding Buffer A（20 mmol·L-1磷酸鹽，500 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1咪唑，pH 7.4）預(yù)平衡的HisTrap HP 1 mL預(yù)裝柱中，反復(fù)上樣，用5—10倍柱體積Binding Buffer A洗去未與柱子結(jié)合的蛋白，再用分別含20、50、100、200、300、400、500 mmol·L-1咪唑的Elution Buffer B（其他成分同Binding Buffer A）洗滌柱子，收集各個梯度的洗脫液，SDS-PAGE分析蛋白純化效果。

1.2.5 Western blot和ELISA試驗(yàn)鑒定 純化的共性結(jié)構(gòu)域蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% MPBS（含5%脫脂奶粉的PBS）室溫封閉過夜，洗膜后，加入HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體（1∶5 000）作為二抗，室溫孵育2 h，洗膜后用DAB底物顯色試劑盒顯色，至目的條帶清晰終止反應(yīng)。

分別取100 μL 4 μg·mL-1的純化的共性結(jié)構(gòu)域蛋白和5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的標(biāo)準(zhǔn)蛋白包被于96孔酶標(biāo)板上，同時設(shè)置陰性對照組，4℃包被過夜。次日用洗滌緩沖液PBST（含0.05% Tween 20的PBS）洗板3次，每次3 min。每孔加入200 μL 3% MPBS封閉，37℃孵育2 h后洗滌，然后每孔分別對應(yīng)加入100 μL 1∶1 000稀釋的純化的抗Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F多克隆抗體，37℃孵育2 h后洗滌，再加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。PBST洗滌4—5次后加TMB顯色15 min，每孔加50 μL的2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)后于450 nm 測OD值。

2　結(jié)果

2.1 序列比對、同源建模及模型評價

5種 Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的3個結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對如圖1-A，可以看出Domain I 的序列一致性最高達(dá)到71%。分別以Cry1Ab、Cry1B、Cry1C和Cry1F的DomainⅠ為目標(biāo)蛋白序列，對PDB蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行序列同源性搜索，結(jié)果顯示Cry1Ab、Cry1C和Cry1F 的 Domain I同源性最高的模版均是Cry1Ac（PDB編號為4arx.A），而Cry1B的 Domain I選定的模板為Cry3Bb1（PDB編號為1ji6.A）。

經(jīng)Swiss-Model構(gòu)建的4種毒素Domain I三維結(jié)構(gòu)模型，通過Ramachandran plot（圖1-B）、ERRAT 和Verify3D（表1）評價構(gòu)象合理性，從結(jié)果可以看出所構(gòu)建的4種DomainⅠ結(jié)構(gòu)模型是合理可信的，可以用于后續(xù)研究。對5種Cry1類毒素的DomainⅠ三維結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行重合比對（圖 1-C），發(fā)現(xiàn)它們的三維結(jié)構(gòu)幾乎完全重合，因此以任意的DomainⅠ擴(kuò)增表達(dá)共性結(jié)構(gòu)域是可行的。

2.2 共性結(jié)構(gòu)域基因的克隆與序列分析

圖1　5種Cry1類毒素氨基酸序列多重比對（A）、三維模型的拉氏圖分析（B）及三維結(jié)構(gòu)比對（C）Fig. 1 Multiple alignment of amino acid sequences （A）， Ranmachandan plot （B） and comparison of the tertiary structures （C） of five toxins

以徐健博士提供的 Bt菌株提取的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增獲得了大小約為 800 bp的擴(kuò)增條帶（圖2-A）。擴(kuò)增出的條帶與預(yù)期大小一致。然后將純化后的PCR產(chǎn)物連接至pET-26b載體中并進(jìn)行測序，序列分析結(jié)果表明，該基因編碼區(qū)序列為880 bp，編碼293個氨基酸。經(jīng)NCBI網(wǎng)站Blastp搜索比對后發(fā)現(xiàn)與Cry1Ac Domain I序列一致性為100%，序列比對得到蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2-B）。

表1　模型評價Table 1 Evaluation of model structures

圖2　DomainⅠ基因的PCR擴(kuò)增（A）及其序列同源性分析（B）Fig. 2 PCR amplification （A） and sequence homologous analysis （B） of DomainⅠ

2.3 pET-26b-DomainⅠ表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

通過 pET-26b-DomainⅠ化轉(zhuǎn)至 E. coli BL21 （DE3）以后，挑取陽性單菌落進(jìn)一步PCR擴(kuò)增、酶切鑒定。PCR電泳結(jié)果（圖3-A）顯示，陽性菌落擴(kuò)增片段大小與預(yù)計(jì)大?。s1 039 bp）一致。提取陽性菌落的重組質(zhì)粒，經(jīng)NcoⅠ和NotⅠ酶切得到800 bp左右的目的片段（圖3-B），說明DomainⅠ的表達(dá)載體pET-26b-DomainⅠ構(gòu)建成功。

2.4 共性結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)與純化

通過測序及雙酶切驗(yàn)證后，將陽性克隆在20℃培養(yǎng) 16 h條件下表達(dá)，離心分別收集上清和菌體，加PBS重懸菌體后冰上超聲破碎菌體，分別收集上清和沉淀。經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，破碎上清在33.4 kD處出現(xiàn)明顯的特異性蛋白條帶，與理論分子量大小一致（圖4-A）。將誘導(dǎo)的Domain I上清經(jīng)HisTrap HP預(yù)裝柱梯度洗脫純化后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖4-B，經(jīng)梯度洗脫后，最終Domain I（約33.4 kD）在咪唑濃度為300 mmol·L-1時被洗脫下來，純化的目的蛋白條帶單一。

2.5 Western blot、ELISA和抗原性分析

Western blot結(jié)果證實(shí)，純化的 Domain I（含6×His標(biāo)簽）對抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體有免疫反應(yīng)，且蛋白分子量大小在33.4 kD左右，同預(yù)期結(jié)果一致（圖5-A）。ELISA結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化的Domain I分別與5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）特異性抗體均具有很強(qiáng)的結(jié)合能力（圖5-B）。通過Jameson-Wolf法分別預(yù)測Cry1Ac和DomainⅠ氨基酸的抗原性指數(shù)（圖5-C），結(jié)果顯示DomainⅠ蛋白和 Cry1Ac蛋白均存在多個潛在的抗原表位位點(diǎn)，抗原表位區(qū)域所占的比例分別為48.4%和63.6%。說明Domain I區(qū)域存在較強(qiáng)的免疫原性，能夠在在免疫過程中產(chǎn)生針對Domain I的特異性抗體。

圖3　pET-26b-Domain I 重組質(zhì)粒菌液PCR（A）及雙酶切（B）驗(yàn)證Fig. 3 PCR amplification （A） and restricted enzymes digestion （B） of pET-26b-Domain I plasmid

圖4　共性結(jié)構(gòu)域蛋白表達(dá)與純化的SDS-PAGE分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the common structural domain expression and purification

3　討論

本研究對5種Cry1類毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1F）的氨基酸全序列進(jìn)行了比對，發(fā)現(xiàn)它們的 DomainⅠ序列 Identity最高。利用Swiss-Model對DomainⅠ進(jìn)行同源建模分析，發(fā)現(xiàn)5種毒素的DomainⅠ三維結(jié)構(gòu)幾乎完全重合。趙新民等［12］對Cry1Aa、Cry2Aa、Cry3Aa和Cry4Aa 4類具有代表性的毒素結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)比較，發(fā)現(xiàn)它們的三級結(jié)構(gòu)模型非常相似，而且所有的3個結(jié)構(gòu)域中結(jié)構(gòu)域I中的 α螺旋幾乎完全重疊，結(jié)構(gòu)差異最小，只有結(jié)構(gòu)域 II、III有細(xì)微差別；吳洪福等［13］對已解析的 Bt晶體蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)它們都有類似的結(jié)構(gòu)，而且單獨(dú)比較各種Cry蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅰ，發(fā)現(xiàn)它們的結(jié)構(gòu)域Ⅰ差別最小。本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)論完全一致，這也是筆者選取DomainⅠ作為共性結(jié)構(gòu)域的依據(jù)。

圖5　共性結(jié)構(gòu)域蛋白的Western blot（A）、ELISA（B）和抗原性（C）分析Fig. 5 Western blot （A）， ELISA （B） and antigenicity （C） analysis of the common structural domain protein

目前，關(guān)于DomainⅠ單獨(dú)表達(dá)純化也有文獻(xiàn)報(bào)道［25］，本文在前人研究的基礎(chǔ)上對共性結(jié)構(gòu)域DomainⅠ進(jìn)行表達(dá)，但前期純化及 ELISA、Western blot驗(yàn)證均沒有結(jié)果，分析原因可能是目的蛋白在折疊時由于空間位阻使His標(biāo)簽沒有充分暴露。根據(jù)融合蛋白連接肽的設(shè)計(jì)原則［26-27］，筆者對DomainⅠ蛋白與His標(biāo)簽蛋白之間的連接肽長度進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使其在優(yōu)化前的5個氨基酸基礎(chǔ)之上增加至11個氨基酸，使目的蛋白在正常折疊的同時，His標(biāo)簽也能充分暴露在其C端，最終純化得到共性結(jié)構(gòu)域蛋白。

抗原表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析中，α螺旋、β折疊的結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變，多位于蛋白質(zhì)內(nèi)部形成構(gòu)象表位，不易與配體結(jié)合，一般不作為抗原表位，而β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲比較松散，易形成線性表位，有利于抗體結(jié)合，符合作為抗原表位的特性［28-29］。本研究中的共性結(jié)構(gòu)域蛋白主要是一個由7個α螺旋組成的螺旋束，但從其三維結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)也具有作為連接鏈的無規(guī)則卷曲（圖1-C），通過ELISA試驗(yàn)也證明它具有與抗Cry毒素抗體特異結(jié)合的能力，說明其共性結(jié)構(gòu)域蛋白中存在的無規(guī)則卷曲可以形成抗原表位，使其具有免疫原性和免疫反應(yīng)性。此研究結(jié)果為下一步利用共性結(jié)構(gòu)域蛋白制備其單、多克隆抗體或者通過時菌體展示技術(shù)制備廣譜抗體進(jìn)行多種Cry毒素篩選提供理論基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

分析并定位了共性結(jié)構(gòu)域，克隆、表達(dá)及純化共性結(jié)構(gòu)域蛋白；證實(shí)DomainⅠ區(qū)域存在抗原表位并具有很強(qiáng)的免疫原性及反應(yīng)性；經(jīng)Western blot和ELISA鑒定了共性結(jié)構(gòu)域蛋白的生物活性。試驗(yàn)結(jié)果可為Cry1類毒素共性結(jié)構(gòu)域廣譜抗體的制備及建立多種Cry毒素廣譜篩選提供理論依據(jù)及技術(shù)指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Analysis， Expression and Identification of the Common Structural Domain of Bacillus thuringiensis （Bt） Cry1 Toxins

LIU Bei-bei1，2， ZHANG Xiao2， XIE Ya-jing2， JIAO Ling-xia3， LIU Yuan1，2， ZHANG Cun-zheng2，ZHAO Yan-yan2， WU Ai-hua2， LIU Xian-jin1，2
（1College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095；2Institute of Food Quality Safety and Detection Research， Jiangsu Academy of Agricultural Science/Key Laboratory of Food Quality and Jiangsu Province-State Key Laboratory Breeding Base/Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-product Safety and Quality， Ministry of Agriculture，
Nanjing 210014；3School of Food Science， Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003， Henan）

【Objective】The objective of this study is to express the optimal common structural domain through analyzing and locating the common structure of five Bacillus thuringiensis Cry1 toxins. This research will lay a foundation for producing the generic antibody and developing the detection method for Cry1 toxins. 【Method】Through bioinformatics， molecular simulation technique and homology modeling to build the three-dimensional structure models of five Cry1 toxins. The structures were evaluated using three programmes， Ramchandran plot， Verify3D and ERRAT. Domain I was identified as the common structure domain of five Cry1 toxins finally. In order to construct the pET-26b-Domain I vector， primers were designed according to the Cry1Ac gene of Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki. As well as insert with Nco I and Not I digestion sites. When it was identified by PCR， restriction enzyme digestion and sequencing， the recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 （DE3） which was induced with 1 mmol·L-1IPTG， 20for 16 h. The supernatant and precipitate were collected and verified by SDS-PAGE after E. coli BL21 （DE3）cells were collected and crushed by ultrasonic wave. The soluble fusion protein was purified by His-Trap HP nickel affinity column and verified by SDS-PAGE， Western blot and ELISA. 【Result】 According to the analysis of amino acid sequences and threedimensional structures of the five Cry1 toxins， the sequences of Domain I were the highest identity part and its three-dimensional structure was very similar and then the Domain I was chosen as the common structure domain of the five Cry1 toxins. The expression vector pET-26b-Domain I was constructed successfully， and soluble Domain I protein was expressed and purified. The molecular weight of the fusion protein was confirmed to be 33.4 kD by SDS-PAGE and Western blot， which also showed specific activity to anti-6×His monoclonal antibody. The ELISA assay showed that the Domain I protein had a good sensitivity with the specific antibodies of the five Cry1 toxins， and the epitope prediction results showed that both the Domain I protein and the complete Cry protein existed multiple potential epitopes， and the percentage of their antigenic peptides were 48.4% and 63.6%， respectively. These results indicate that the Domain I protein has good immunogenicity and immune response. 【Conclusion】Based on molecular simulation and molecular cloning technology， the conserved structural domain protein was successfully expressed and purified. This study has established a foundation for the following studies and the common structural domain protein would as target molecule for the production of the generic antibody of Cry1 toxins in further research.

Bacillus thuringiensis Cry1 toxins； common structural domain； prokaryotic expression； purification

2016-03-18；接受日期：2016-04-25

國家自然科學(xué)基金（31371778、31301703）、國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303088）、江蘇省自主創(chuàng)新項(xiàng)目（CX（14）5068）

聯(lián)系方式：劉貝貝，E-mail：2013102120@njau.edu.cn。通信作者劉賢金，E-mail：jaasliu@jaas.ac.cn