黃 濤，黃曉暢，邱恒清，嚴(yán)國榮，黃貽忠，張弋峰，江嘉程，周李生，任 軍，麻駿武，肖石軍，黃路生，楊 斌，艾華水

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045）

巴馬香豬周身皮膚厚度的測(cè)量及其與7號(hào)染色體候選SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

黃 濤，黃曉暢，邱恒清，嚴(yán)國榮，黃貽忠，張弋峰，江嘉程，周李生，任 軍，麻駿武，肖石軍，黃路生，楊 斌，艾華水

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建豬遺傳改良與養(yǎng)殖技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045）

【目的】 測(cè)定中國地方小型豬品種巴馬香豬成年時(shí)周身9個(gè)典型部位的皮膚厚度，揭示巴馬香豬不同部位皮膚厚度變化規(guī)律；進(jìn)行9個(gè)部位皮膚厚度與候選SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，在巴馬香豬群體中驗(yàn)證影響皮膚厚度的7號(hào)染色體主效QTL，為進(jìn)一步在巴馬香豬群體中大規(guī)模開展皮膚厚度等形態(tài)變化的分子遺傳控制機(jī)理及其相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)，從而增強(qiáng)人們對(duì)豬皮膚的認(rèn)知?！痉椒ā繌囊粋€(gè)由319頭300日齡巴馬香豬組成的成年屠宰群體中，隨機(jī)選取50頭，包括27頭母豬和23頭閹割公豬，分別取頭臉、肩、背、肷、臀、胸、下腹、腋下和管等9個(gè)部位的皮膚，利用電子游標(biāo)卡尺對(duì)這些不同部位皮膚厚度進(jìn)行精確測(cè)量，利用R語言基本統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行不同部位和不同性別間皮膚厚度的差異分析以及不同部位間皮膚厚度的相關(guān)分析。在豬7號(hào)染色體34.5—36.2 Mb的區(qū)域選取46個(gè)SNPs位點(diǎn)，利用MassARRAY時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行基因分型，結(jié)合上述測(cè)定的皮厚表型，利用廣義混合線性模型及 R 語言SNPassoc軟件包進(jìn)行目標(biāo)候選區(qū)域的關(guān)聯(lián)分析。根據(jù)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果和基因的生物學(xué)功能確定可能的位置候選基因?！窘Y(jié)果】（1）單因素方差分析表明巴馬香豬9個(gè)部位的皮膚厚度存在極顯著差異（P = 2.95×10-117），肷部和背部的皮膚最厚，分別為（5.15 ± 0.92）和（4.97 ± 0.85）mm，下腹和腋下的皮膚最薄，分別為（1.77 ± 0.36）和（1.97 ± 0.68） mm。皮膚厚度從厚到薄依次是肷部、背部、肩部、頭臉、臀部、管部、胸部、腋下和下腹。（2）閹割公豬腋下皮膚厚度顯著小于母豬的（P = 0.021），其它部位皮膚厚度在母豬和閹割公豬間差異均不顯著。（3）除了下腹皮膚厚度與背部、肩部、頭臉部的不相關(guān)（P＞0.05）外，巴馬香豬不同部位兩兩之間皮膚厚度均呈現(xiàn)不同程度地顯著或極顯著正相關(guān)。（4）關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，9個(gè)不同部位的皮膚厚度表型均與候選區(qū)域的某些SNPs存在極顯著的關(guān)聯(lián)，從強(qiáng)到弱依次是肷部、肩部、背部、腋下、臀部、胸部、頭臉、管部和下腹。從而，證實(shí)了巴馬香豬群體存在影響豬皮膚厚度的7號(hào)染色體主效QTL。（5）3個(gè)與皮膚厚度關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的SNPs值得進(jìn)一步關(guān)注，分別位于7號(hào)染色體的34856565、35543837和35573869位置。肷部的皮膚厚度與SNP（chr7:34856565）的關(guān)聯(lián)顯著性最強(qiáng)（Pcor= 5.15×10-6），這個(gè)SNP也是肩部皮膚厚度最關(guān)聯(lián)（Pcor= 5.75×10-6）的位點(diǎn)。SNP（chr7:35543837）是腋下（Pcor= 3.05×10-5）、臀部（Pcor= 0.010）、胸部（Pcor= 0.013）和頭臉（Pcor= 0.025）皮膚厚度的最關(guān)聯(lián)位點(diǎn)，也是肩部皮膚厚度的次最關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。SNP（chr7:35573869）則是背部皮膚厚度的最關(guān)聯(lián)位點(diǎn)（Pcor= 1.17×10-5），SNPs（chr7:35543837和chr7:34856565）次之。（6）根據(jù)最強(qiáng)關(guān)聯(lián)SNPs所在基因及基因生物學(xué)功能，初步推測(cè)ANKS1A和HMGA1基因可能是影響皮膚厚度的候選因果基因?！窘Y(jié)論】較全面地測(cè)量了中國小型地方豬品種巴馬香豬周身皮膚厚度，揭示了巴馬香豬皮膚厚度在不同部位之間的變化規(guī)律。在巴馬香豬群體中驗(yàn)證了影響皮膚厚度的7號(hào)染色體主效QTL位點(diǎn)，肷部、背部和肩部皮膚厚度表型性狀與候選SNPs位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)，可能適合下一步大規(guī)模深入分析。ANKS1A和HMGA1基因可能是影響皮膚厚度的候選因果基因，但需要進(jìn)一步生物學(xué)功能試驗(yàn)證明。

巴馬香豬；皮膚厚度；候選SNPs位點(diǎn)；關(guān)聯(lián)分析

0　引言

【研究意義】巴馬香豬原產(chǎn)于廣西巴馬瑤族自治縣，是中國優(yōu)良的小型地方豬品種之一［1］。既有獨(dú)特的肉用經(jīng)濟(jì)價(jià)值［2］，又可用作良好的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型［3-4］。皮膚是動(dòng)物外皮系統(tǒng)中最大的器官，在保護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境和抵御外界環(huán)境病原菌侵入等方面起著重要屏障作用［5］。同時(shí)，豬皮是皮革產(chǎn)業(yè)的重要原料之一［6］，也是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)異種皮膚移植的理想材料［7］。測(cè)量巴馬香豬周身皮膚厚度，了解巴馬香豬皮膚厚度的變化規(guī)律，可增加人們對(duì)巴馬香豬皮膚的認(rèn)知。在巴馬香豬群體中驗(yàn)證 7號(hào)染色體影響皮膚厚度的主效QTL，可為進(jìn)一步在巴馬香豬群體中大規(guī)模開展皮膚厚度等形態(tài)變化的分子遺傳控制機(jī)理及其相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)，為更好地開發(fā)利用巴馬香豬提供參考。【前人研究進(jìn)展】巴馬香豬作為人類疾病模型已在皮膚創(chuàng)傷移植、心血管疾病和肌肉萎縮等疾病研究中應(yīng)用。例如：2006年陳俊穎和魏泓用巴馬香豬皮制作無細(xì)胞真皮，可作為創(chuàng)傷修復(fù)的真皮支架［8］；2008年劉宇以洛伐他汀為典型藥物研究巴馬香豬和人代謝的異同［9］。目前，涉及皮膚厚度的研究主要集中在皮膚科學(xué)的醫(yī)藥研究和皮膚病理治療上，而針對(duì)皮膚厚度的分子遺傳控制機(jī)理研究鮮見報(bào)道。比如，SCHMOOK 等 2001 年報(bào)道了皮膚厚度對(duì)不同藥物的體外滲透力的影響［10］；SETO 等 2010 年報(bào)道了不同方法估計(jì)人皮膚厚度的研究［11］；WONG等2011 年報(bào)道了乳腺癌患者在乳房切除術(shù)后放射治療的皮膚厚度變化情況［12］；YONDEDA等2011 年報(bào)道了在成年女性中骨密度與皮膚厚度的相關(guān)性［13］。在豬中，有少量文獻(xiàn)報(bào)道了有關(guān)豬皮膚厚度的研究，比如豬皮膚厚度與瘦肉率的關(guān)系研究［14］，云南本地豬及其雜交豬的皮膚厚度變化情況［15］，豬皮部位差異的基本規(guī)律及對(duì)制革工藝的影響［16］等。目前尚沒有關(guān)于巴馬香豬的皮膚厚度研究報(bào)道。而從分子遺傳學(xué)角度研究豬皮膚厚度只有AI等2014年報(bào)道的一篇關(guān)于豬皮厚性狀連鎖分析和全基因組關(guān)聯(lián)分析的研究。該研究在二花臉×白色杜洛克F2資源群體和蘇太豬群體中，利用194個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和豬60K SNP芯片，發(fā)現(xiàn)豬4、7和15號(hào)染色體存在影響皮膚厚度主效QTL，其中7號(hào)染色體～35Mb處的主效QTL效應(yīng)最強(qiáng)［17］?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以中國地方小型豬品種巴馬香豬為研究素材，隨機(jī)選取了50頭300日齡的成年豬，測(cè)量豬只周身9個(gè)典型部位的皮膚厚度，統(tǒng)計(jì)皮膚厚度在不同部位和不同性別間的差異性以及不同部位間的相關(guān)性。在巴馬香豬群體中進(jìn)行了皮膚厚度與7號(hào)染色體34.5—36.2 Mb候選區(qū)域46個(gè)SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，分析不同部位皮膚厚度與這個(gè)區(qū)域SNPs的關(guān)聯(lián)性，根據(jù)強(qiáng)關(guān)聯(lián)的SNPs及其物理位置上所在或臨近基因，結(jié)合基因的生物學(xué)功能，推測(cè)影響皮膚厚度變化的位置候選基因?！緮M解決的關(guān)鍵問題】全面地了解巴馬香豬周身皮膚厚度的變化情況，揭示其變化規(guī)律。同時(shí)在巴馬香豬群體中驗(yàn)證在SSC7影響皮膚厚度變化的主效QTL，探討影響豬皮膚厚度的遺傳控制機(jī)理，增強(qiáng)人們對(duì)豬皮膚的認(rèn)知。

1　材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)豬品種為巴馬香豬，2014年購自廣西巴馬自治縣巴馬香豬繁育基地，統(tǒng)一飼養(yǎng)于江西南昌蔣巷鎮(zhèn)國鴻生態(tài)園豬場(chǎng)，供豬只自由采食和飲水。購買時(shí)，巴馬香豬的日齡為40—50日齡，其中公豬于30—35日齡被閹割。所有豬只飼養(yǎng)至（300±5）日齡，運(yùn)至附近的國鴻生豬屠宰場(chǎng)，共屠宰了319頭巴馬香成年豬，其中閹割公豬160頭，母豬159頭，為43頭父本和61頭母本的后代。

1.2 方法

1.2.1 表型測(cè)定 巴馬香豬宰前禁水禁食 24h后進(jìn)行屠宰。在剔毛、去除內(nèi)臟后，隨機(jī)抽取50頭（公豬23頭，母豬27頭，為17頭父本和20頭母本的后代）進(jìn)行皮膚組織取樣。用手術(shù)刀和剪刀，分別在頭臉部、肩部、背部、肷部、臀部、胸部、下腹部、腋下和前管等9個(gè)部位（圖1）處，取約5 cm2大小的完整皮膚組織樣品。然后用手術(shù)刀垂直割取皮膚形成平整的切面，立刻用精度為0.01mm的電子游標(biāo)卡尺垂直卡在皮膚切割面上進(jìn)行測(cè)量，并讀取、記錄皮膚厚度的數(shù)據(jù)。

1.2.2 DNA提取及SNPs位點(diǎn)判型 采集0.5—1.0 g豬耳組織，按照標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿法提取 DNA。其A260/A280比值在1.8—2.0且瓊脂糖電泳檢測(cè)片段長(zhǎng)度大于10 kb的，視為合格DNA，儲(chǔ)存于-30℃冰箱待用。

使用Sequenom公司的MassARRAY?時(shí)間飛行質(zhì)譜分型技術(shù)，進(jìn)行7號(hào)染色體34.5—36.2 Mb內(nèi)的46個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因分型。即根據(jù)SNPs堿基分子量存在差異這一特性，通過PCR擴(kuò)增得到一定數(shù)量級(jí)的包含SNPs在內(nèi)的目的片段，再利用質(zhì)譜儀測(cè)定不同基因型目的片段的質(zhì)荷比，對(duì)比片段分子量差異，從而實(shí)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)基因分型。

圖1　巴馬香豬皮膚取樣的9個(gè)軀體部位Fig. 1 The 9 body sites where skin were sampled in Bamaxiang pig

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 巴馬香豬周身 9個(gè)部位皮膚厚度的描述性統(tǒng)計(jì)均使用R語言的相關(guān)統(tǒng)計(jì)函數(shù)進(jìn)行計(jì)算分析。用 boxplot繪制箱式分布圖，使用 shapiro.test進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，使用單因素方差分析aov檢驗(yàn)不同部位皮膚厚度的總差異性，使用t.test檢驗(yàn)兩兩不同部位間皮膚厚度的差異顯著性，使用cor.test進(jìn)行相關(guān)系數(shù)計(jì)算和顯著性分析。

運(yùn)用R語言SNPassoc 軟件包中的association函數(shù)進(jìn)行不同部位皮膚厚度與46個(gè)位點(diǎn)候選基因型的相關(guān)性分析。建立的廣義混合線性模型如下：y=u+geno+ sex+batch+e。其中y為測(cè)定的皮膚厚度表型值，u表示皮膚厚度的平均數(shù)，geno表示SNPs的基因型，sex為性別效應(yīng)，batch為批次效應(yīng)，e為殘差。

2　結(jié)果

2.1 皮膚厚度的描述性統(tǒng)計(jì)分析

精確測(cè)量了50頭300日齡成年巴馬香豬的頭臉、肩、背、肷、臀、管、胸、下腹和腋下等9個(gè)典型部位的皮膚厚度（表1，圖2）。從厚到薄依次是肷、背、肩、頭臉、臀、管、胸、腋下和下腹，其中肷部和背部的皮膚厚度分別為（5.15±0.92）和（4.97±0.85） mm，下腹和腋下的皮膚厚度分別為（1.77±0.36）和（1.97±0.68）mm。背部的皮膚厚度變異度最小，為17.1%，腋下的最大，為34.8%。

表1　巴馬香豬周身9個(gè)部位皮膚厚度描述性統(tǒng)計(jì)量aTable 1 Descriptive statistics for skin thickness at 9 body sites in Bamaxiang pig

正態(tài)分布檢驗(yàn)表明，頭臉、肩、肷、胸、背和下腹皮厚的P值均大于0.05，符合正態(tài)分布；而腋下、管和臀的P值小于0.05，說明這個(gè)3個(gè)部位的皮膚厚度不符合正態(tài)分布。腋下的可能是由于不同性別間的皮膚厚度存在顯著性差異（P = 0.021）；管部皮膚厚度在母豬和閹割公豬間的差異接近顯著水平（P = 0.072），可能是造成管部正態(tài)檢驗(yàn)顯著的原因之一；臀部皮膚厚度可能是由于測(cè)量的個(gè)體數(shù)偏少，測(cè)量個(gè)體的隨機(jī)性造成的。

圖2　巴馬香豬不同軀體部位的皮膚厚度Fig. 2 skin thickness at different body sites in Bamaxiang pig

2.2 不同部位皮膚厚度的差異分析

巴馬香豬 9個(gè)部位皮膚厚度在整體上差異極顯著，P值為2.95×10-117，表2列出了它們兩兩之間相互比較的差異顯著性。由此可知，除了背部與肷部、頭臉部與臀部、胸部與腋下以及下腹與腋下的皮膚厚度差異不顯著（P＞0.05）以外，其余各個(gè)部位之間的皮膚厚度均存在極顯著差異（P＜0.01），其中以背部、肷部與下腹、腋下之間的皮膚厚度差異最為顯著。

性別可能是影響皮膚厚度的影響因素之一，因此本文以性別作為分類依據(jù)進(jìn)行皮膚厚度的顯著性檢驗(yàn)。檢驗(yàn)結(jié)果表明，閹割的公豬個(gè)體腋下皮膚厚度顯著小于母豬的皮膚厚度（P = 0.021），其它部位均不顯著，但管部皮膚和下腹皮膚在母豬和閹割公豬間的厚度差異接近顯著水平，P值分別為0.072和0.054（圖3）。

圖3　巴馬香豬不同軀體部位皮膚厚度在不同性別間的差異Fig. 3 Difference of skin thickness between two gander groups at 9 body sites in Bamaxiang pigs

表2　巴馬香豬9個(gè)部位皮膚厚度差異顯著性P值Table 2 P value of t-test for skin thickness at 9 body sites in Bamaxiang pigs

2.3 不同部位皮膚厚度的相關(guān)性分析

巴馬香豬9個(gè)部位之間的皮膚厚度除了下腹部與背部、肩部和頭臉部的不相關(guān)外，其余部位兩兩之間均呈正相關(guān)（P＜0.05，表3）。肩、背和肷三個(gè)部位的皮膚厚度兩兩之間都呈極顯著正相關(guān)，管與腋下也呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，它們之間的相關(guān)系數(shù)均大于0.6， P值均遠(yuǎn)小于0.01。其余部位兩兩之間的皮膚厚度相關(guān)性在0.28—0.6之間，P值也都小于0.05，均呈極顯著正相關(guān)或顯著正相關(guān)。

2.4 皮膚厚度表型與候選SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

根據(jù)此前2014年AI等［17］的研究，在7號(hào)染色體的目標(biāo)QTL區(qū)域34.5—36.2 Mb內(nèi)選取和設(shè)計(jì)了46個(gè)SNPs位點(diǎn)，并進(jìn)行MassARRAY的質(zhì)譜基因分型，圖4顯示了這些SNPs在基因組中的物理位置。利用1.2.3方法中線性加性模型進(jìn)行這46個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因分型數(shù)據(jù)與9個(gè)部位皮膚厚度表型的關(guān)聯(lián)分析。這9個(gè)皮膚厚度表型均與這個(gè)區(qū)域的某些 SNPs存在極顯著的相關(guān)，與這個(gè)區(qū)域SNPs位點(diǎn)的相關(guān)性從強(qiáng)到弱依次是：肷部＞肩部＞背部＞腋下＞臀部＞胸部＞頭臉＞管部＞下腹（圖4）。

表3　巴馬香豬9個(gè)部位皮膚厚度的相關(guān)性Table 3 Correlation of skin thickness between pairwise different body sites in Bamaxiang pigs

肷部的皮膚厚度與SNP（chr7： 34856565）的相關(guān)顯著性最強(qiáng)（Pcor= 5.15×10-6），這個(gè)SNP同時(shí)也是肩部皮膚厚度最相關(guān)（Pcor=5.75×10-6）的位點(diǎn)；SNP（chr7： 35543837）是腋下（Pcor= 3.05×10-5）、臀部（Pcor= 0.010）、胸部（Pcor= 0.013）和頭臉部（Pcor= 0.025）皮膚厚度的最相關(guān)位點(diǎn)，也是肩部皮膚厚度的次最相關(guān)位點(diǎn)。SNP（chr7： 35573869）則是背部皮膚厚度的最相關(guān)位點(diǎn)（Pcor=1.17×10-5），SNPs（chr7： 35543837和chr7： 34856565）次之（表4）。這3個(gè)與皮膚厚度強(qiáng)關(guān)聯(lián)的SNPs分別位于GRM4，TAF11和ANKS1A等3個(gè)基因中（表4）。

圖4　巴馬香豬9個(gè)不同部位皮膚厚度與7號(hào)染色體候選區(qū)域46個(gè)SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析Fig. 4 Association assay between skin thickness at 9 body sites and 46 candidate SNPs on SSC7 in Bamaxiang pig

表4　關(guān)聯(lián)分析中P值最高SNPs位點(diǎn)的信息Table 4 Information of the most significant SNPs in association assay

3　討論

研究豬及其各類器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、生長(zhǎng)發(fā)育和病理變化等生命規(guī)律可為人類的相關(guān)研究提供重要借鑒。豬皮膚在形態(tài)結(jié)構(gòu)上跟人類皮膚相近，豬皮可作為人類皮膚替代物進(jìn)行藥物試驗(yàn)或模擬治療［18］，利用豬皮作為人類燒傷皮膚的異種植皮來源也得到深入研究［7］。為了更好地了解豬皮膚的形態(tài)構(gòu)造變化和生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律，本文以深入了解巴馬香豬皮膚厚度的變化規(guī)律和探究其分子遺傳控制機(jī)理為出發(fā)點(diǎn)，開展相關(guān)豬皮膚厚度的研究工作，即對(duì)中國地方小型豬種巴馬香豬進(jìn)行了 9個(gè)典型部位皮膚厚度的表型統(tǒng)計(jì)分析，及其與7號(hào)染色體影響皮膚厚度主效QTL區(qū)域46個(gè)SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析。

有研究表明，在哺乳動(dòng)物中皮膚厚度的變化因個(gè)體或部位而異，比如在人中一般為 0.5—4.0 mm［19］，在馬中為1.5—4.6 mm［20］。針對(duì)豬皮膚厚度變化規(guī)律的研究，有兩篇較為經(jīng)典的文獻(xiàn)報(bào)道。1993年陳德端和王瑞華研究了云南當(dāng)?shù)刎i和各雜交組合豬只的肩、背、臀和腹部4個(gè)部位皮膚厚度變化，發(fā)現(xiàn)豬皮膚厚度在軀體的變化通常為1.1—5.8 mm［15］。1994年王全杰比較全面地介紹了中國國產(chǎn)豬皮的厚度變化規(guī)律：整張豬皮以尾根部為底脊背為中線，呈現(xiàn)長(zhǎng)把梨狀三角形，厚度由底部沿著中垂線向頂角逐級(jí)遞減，直到其2/3處不再明顯下降，基本保持穩(wěn)定［16］。筆者經(jīng)過精確測(cè)量，發(fā)現(xiàn)巴馬香豬的皮膚厚度也因個(gè)體不同或部位不同而不一樣，變化范圍為 1.02—7.06 mm。巴馬香豬周身9個(gè)部位皮膚從薄到厚依次為：下腹＜腋下＜胸部＜管部＜臀部＜頭臉＜肩部＜背部＜肷部。由此可見，巴馬香豬軀體背側(cè)朝上的部位皮膚較厚，而軀體兩端和肢蹄端的皮膚厚度相對(duì)背側(cè)較薄，而軀體的腹側(cè)朝下或朝內(nèi)的部位皮膚最薄。

巴馬香豬軀體各部位的皮膚厚度變化的差異非常大，尤其是背側(cè)與腹側(cè)皮膚相比較；不同部位間的皮膚厚度呈現(xiàn)不同程度的正相關(guān)，同側(cè)皮膚厚度的相關(guān)性強(qiáng)或較強(qiáng)，不同側(cè)皮膚厚度相關(guān)性較弱或無相關(guān)，如背部皮膚厚度與肷部、肩部的呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，而背部皮膚與下腹皮膚不呈現(xiàn)顯著相關(guān)（P＞0.05）。性別可能是影響皮膚厚度的一個(gè)重要影響因素。DERRAIK等2014年研究發(fā)現(xiàn)成年男性大腿上的皮膚顯著地厚于女性的皮膚，但在腹部的皮膚男女性的差別不顯著［21］。本研究發(fā)現(xiàn)在大部分軀體部位的皮膚厚度在母豬和閹割公豬間沒有顯著差別，但腋下皮膚在兩者之間存在顯著差異，這也可能是造成腋下的皮膚厚度不呈正態(tài)分布的原因之一。

2014年AI等利用二花臉×白色杜洛克的F2代資源群體，使用194個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行了豬皮膚厚度性狀的連鎖分析，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)主效QTL位點(diǎn)，分別位于7號(hào)染色體的58 cM、15號(hào)的78 cM 和4號(hào)的107 cM上，其中7號(hào)染色體的QTL 解釋了23.9%遺傳變異。同時(shí)，新增蘇太豬群體，使用豬60K SNP芯片，進(jìn)行了兩個(gè)群體豬皮膚厚度性狀的全基因組水平關(guān)聯(lián)分析，將驗(yàn)證了這3個(gè)主效QTL位點(diǎn)。將7 號(hào)染色體主效QTL置信區(qū)域縮短到683kb，將15 號(hào)染色體主效QTL 區(qū)域也縮短到2.2 Mb［17］。本研究則利用中國南方地方小型豬巴馬香豬群體，進(jìn)行了軀體9個(gè)部位皮膚厚度與7號(hào)染色體34.5—36.2Mb候選區(qū)域46個(gè)SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析。首先驗(yàn)證了巴馬香豬群體也存在影響豬皮膚厚度的7號(hào)染色體主效QTL，為今后利用巴馬香豬群體進(jìn)行皮膚厚度的全基因組水平關(guān)聯(lián)分析奠定了基礎(chǔ)。其次，發(fā)現(xiàn)背側(cè)（如：背部、肷部和肩部）的皮膚厚度與候選SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性比軀體兩端或腹側(cè)（如：管部、胸部、臀部、下腹和頭臉部）的更高。這提示以下兩點(diǎn)：（1）在今后的皮膚厚度關(guān)聯(lián)分析研究中，肩、背和肷部的皮膚取樣部位可能會(huì)更為合適，在統(tǒng)計(jì)上造成的誤差更小；（2）腹側(cè)皮膚與背側(cè)皮膚的皮膚厚度有可能存在某些不同的內(nèi)在分子遺傳控制機(jī)理，這一點(diǎn)值得今后更深入的研究和探討。

在7號(hào)染色體34.5—36.2Mb的46個(gè)SNPs中，有3個(gè)與皮膚厚度關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的SNPs值得進(jìn)一步關(guān)注（表4），分別是SNP（Chr7： 34856565），SNP（Chr7： 35543837）和 SNP（Chr7： 35573869），它們分別位于GRM4，TAF11和ANKS1A基因中。GRM4基因編碼一種代謝性谷氨酸受體，參與抑制神經(jīng)系統(tǒng)中的cAMP級(jí)聯(lián)反應(yīng)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/ 2914）。TAF11基因編碼TF11D的小亞基，是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與 RNA聚合酶 II的轉(zhuǎn)錄起始過程（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6882）。ANKS1A基因編碼一種錨蛋白重復(fù)及 SAM 結(jié)構(gòu)域蛋白（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/23294），也稱作為奧丁（Odin）。PANDEY等2002年克隆了奧丁，發(fā)現(xiàn)奧丁是一種含有酪氨酸磷酸化結(jié)合域的蛋白，揭示出奧丁可能在生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路起著重要的負(fù)調(diào)控作用［22］。2013年TANG等進(jìn)一步證實(shí)奧丁在表皮生長(zhǎng)因子受體的循環(huán)利用上行使著效應(yīng)物功能，通過販運(yùn)作用回收或降解表皮生長(zhǎng)因子受體的方式來穩(wěn)定表皮生長(zhǎng)因子受體在細(xì)胞中的劑量［23］。從生物學(xué)功能上看，GRM4和TAF11這兩個(gè)基因似乎與皮膚生長(zhǎng)發(fā)育并不相關(guān)，而ANKS1A基因編碼的蛋白與表皮生長(zhǎng)因子受體有非常密切的相互作用，值得深入研究。7號(hào)染色體34.5—36.2Mb區(qū)域是一個(gè)基因富含的區(qū)間，包含有ITPR3，UQCC2，LEMD2，MLN，GRM4，HMGA1，RPS10，SPDEF，PACSIN1，C6orf106，SNRPC，UHRF1BP1，TAF11，ANKS1A，TCP11，SCUBE3，TEAD3，RPL10A，F(xiàn)ANCE和PPARD等20個(gè)基因（圖4）。這些基因均可能是影響皮膚厚度的因果基因，需要進(jìn)一步做相關(guān)的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。其中，HMGA1基因也值得關(guān)注。HMGA1基因編碼一種參與多個(gè)細(xì)胞過程的非組蛋白轉(zhuǎn)錄因子，常被乙?；嬖谟诩?xì)胞核內(nèi)，優(yōu)先結(jié)合在雙鏈 DNA的 AT富集區(qū)的小溝上（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ gene/3159）。有文獻(xiàn)報(bào)道，在哺乳動(dòng)物中HMGA1基因的突變影響著身高和體型的變化［24-25］。據(jù)此可初步推斷，ANKS1A和HMGA1基因?yàn)橛绊懓婉R香豬皮膚厚度變化的候選因果基因，但均需進(jìn)行生物學(xué)功能試驗(yàn)的深入研究，加以證實(shí)。

4　結(jié)論

首次較全面地測(cè)量了中國小型地方豬品種巴馬香豬周身皮膚厚度，揭示了巴馬香豬皮膚厚度在不同部位之間的變化規(guī)律。在巴馬香豬群體中驗(yàn)證了影響皮膚厚度的7號(hào)染色體主效QTL位點(diǎn)，肷部、背部和肩部皮膚厚度表型性狀與候選SNPs位點(diǎn)關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)，可能適合下一步大規(guī)模深入分析。ANKS1A和 HMGA1基因可能是影響皮膚厚度的候選因果基因，但需要進(jìn)一步生物學(xué)功能試驗(yàn)證明。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Measurement of Skin Thickness Along the Whole Body Sites and Association Study with Candidate SNPs on Sus Scrofa Chromosome 7 in Bamaxiang Pigs

HUANG Tao， HUANG Xiao-chang， QIU Heng-qing， YAN Guo-rong， HUANG Yi-zhong， ZHANG Yi-feng，JIANG Jia-cheng， ZHOU Li-sheng， REN Jun， MA Jun-wu， XIAO Shi-jun，HUANG Lu-sheng， YANG Bin， AI Hua-shui
（National Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology， Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045）

【Objective】Skin thickness at 9 typical sites of the whole pig body were measured in Bamaxiang pig breed， one of the Chinese local miniature pig breeds. There are 46 candidate SNPs located in a major QTL affecting skin thickness on sus scrofa chromosome 7 （SSC7） were genotyped in the Bamaxiang pig population. One aim of this study is to make clear variation rule of skin thickness at different body sites in Bamaxiang pigs. The other aim is to verify the major QTL affecting skin thickness on SSC7 in Bamaxiang pig population by association study in a specific genomic region. Result of this study will contribute to further revealing the genetic mechanism of swine skin thickness in a larger pig population at whole genome level， and increase our understanding about pig skin. 【Method】A totle of 50 Bamaxiang pigs， including 27 females and 23 castrated males， were randomly selected from a Bamaxiang pig population consisting of 319 adult pigs， which were slaughtered at 300 days. The skin with 5 cm2area were cut from 9 body sites of cheek， shoulder， back， loin， rump， chest， belly， armpit and trotter. Skin thickness at these 9 different body sites were accurately measured using digital caliper. The difference of skin thickness between pairwise body sites and the difference between females and castrated males were tested using the basic statistic package of R language. Pairwise Pearson's correlation coefficients were calculated between skin thickness at different body sites， meanwhile their significant tests were done. A total of 46 SNPs located in the region from 34.5 to 36.2 Mb on SSC7 were selected and designed for genotyping on a SEQUENOM MassARRAY SNP Genotyping platform. Combined with the above phenotypes of skin thickness， association studies on the target candidate region were performed by a general mixed linear model using SNPasscoc package of R language. Based on the association results and biological function of genes， positional candidate genes were determined. 【Result】One-way analysis of variance showed that an extreme significant difference with a 2.95×10-117probability existed among skin thickness at 9 body sites in Bamaxiang pigs. The thickest body sites were loin and back with skin thickness of （5.15 ± 0.92） and （4.97 ± 0.85） mm， respectively， while the thinnest sites were belly and armpit with skin thickness of （1.77 ± 0.36） and （1.97 ± 0.68） mm， respectively. The body sites with skin thickness from thick to thin in turn were loin， back， shoulder， cheek， rump， trotter， chest， armpit and belly. Skin thickness of castrated male pig at armpit was significantly thinner than female pig with a 0.021 probability. When compared between other pairwise body sites， skin thickness had no significant differences. There was no significant correlation between skin thickness at belly and back，between belly and shoulder， and between belly and cheek. Other pairwise combinations had a significant positive correlation. Association analysis between skin thickness at 9 different body sites and the above candidate SNPs suggested that the major QTL on SSC7 affecting skin thickness was also identified in Bamaxiang pig population. Three most promising SNPs were worthy of being further focused on. SNP （chr7：34856565） showed most significant association with skin thickness at loin （Pcor= 5.15×10-6）， which was also the most significant site associated with skin thickness at shoulder （Pcor= 5.75×10-6）. SNP （chr7：35543837） was the most significant site associated with skin thickness at armpit （Pcor= 3.05×10-5）， at rump （Pcor= 0.010）， at chest （Pcor= 0.013） and cheek（Pcor= 0.025）， also was the second most significant site with shoulder. SNP （chr7：35573869） was the top significant site associated with back skin thickness （Pcor= 1.17×10-5）， and followed by SNPs （chr7：35543837 and chr7： 34856565）. Based on nearest genes of top SNPs and their biological function， ANKS1A and HMGA1 were preliminarily suggested to be positional candidate genes possibly affecting skin thickness in pigs.【Conclusion】It was the first time to measure skin thickness at 9 different body sites and report the variation rule of skin thickness along the whole body in Bamaxiang pig breed， one of the Chinese local miniature pig breed. Meanwhile the major QTL affecting skin thickness on SSC7 was verified in Bamaxiang pig population， it provided an important clue and base to reveal the genetic mechanism of pig skin thickness in future. ANKS1A and HMGA1 might be positional causal genes affecting skin thickness in pigs， and it needs further verification of biological functional test.

Bamaxiang pigs； skin thickness； candidate SNP sites； association study

2015-08-19；接受日期：2016-07-05

國家自然科學(xué)基金（31460283）

聯(lián)系方式：黃濤，Tel：0791-83813080；E-mail：taohuang@live.cn。通信作者楊斌，Tel：0791-83813080；E-mail：binyang@live.cn。通信作者艾華水，Tel：0791-83813080；E-mail：aihsh@hotmail.com