周紀(jì)東,黃黃偉,朱城杰,魏曉玲(.浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系,杭州 3008; .浙江兩岸食品連鎖有限公司,杭州 3008)

一種測(cè)定原料肉中氨含量的分光光度法

周紀(jì)東1,黃黃偉2,朱城杰1,魏曉玲2
(1.浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物技術(shù)系,杭州 310018; 2.浙江兩岸食品連鎖有限公司,杭州 310018)

為判定原料肉的新鮮度,建立一種測(cè)定原料肉中氨含量的分光光度法.分光光度法以對(duì)羥基苯甲酸鈉(PHB)為顯色劑,研究原料肉中氨含量與吸光度的關(guān)系.結(jié)果表明,1.0mL肉浸液中加入3.0mL PHB溶液和1.5mL次氯酸鈉溶液,于37℃水浴加熱30min,在695nm處測(cè)定吸光度,在0.00～20.00μg/25mL范圍內(nèi)氨含量與吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系.分光光度法具有較高的準(zhǔn)確度、精確度和靈敏度,操作簡(jiǎn)單,對(duì)儀器、試劑要求不高,可作為測(cè)定原料肉新鮮度的備選方法,面向中小型肉類加工企業(yè)推廣與應(yīng)用.

原料肉;氨;新鮮度;分光光度法

0　引 言

肉類在貯存、運(yùn)輸與銷售等過(guò)程中,其新鮮度極易發(fā)生變化,甚至腐敗變質(zhì).因此,研究快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的肉類新鮮度檢驗(yàn)技術(shù),不僅是肉類生產(chǎn)加工企業(yè)和政府食品安全監(jiān)管部門的迫切需求,更直接關(guān)系到廣大消費(fèi)者的身體健康[1].

新鮮的肉中氨含量非常低,當(dāng)其腐敗變質(zhì)時(shí)才會(huì)產(chǎn)生大量氨及銨鹽(合稱為粗氨)等堿性含氮的特征產(chǎn)物,與腐敗程度具有一定的相關(guān)性[2].因此,肉中粗氨含量可作為判定其新鮮度的一項(xiàng)重要的衛(wèi)生指標(biāo).目前,肉中氨檢驗(yàn)采用納氏試劑進(jìn)行定性判斷[3],尚無(wú)準(zhǔn)確的定量方法,而且納氏試劑還存在成分具有毒性、配制步驟繁瑣和不易存放等問(wèn)題.本研究基于Berthelot反應(yīng),建立一種定量測(cè)定原料肉中氨含量的分光光度法,旨在為相關(guān)企業(yè)、監(jiān)管部門判定原料肉的新鮮度提供一種新方法.

1　材料與方法

1.1反應(yīng)原理

基于Berthelot反應(yīng)原理,粗氨在堿性溶液中可與次氯酸鹽生成氯胺,在硝普鈉(亞硝基鐵氰化鈉)的催化下,與酚類物質(zhì)反應(yīng)生成藍(lán)色的靛酚藍(lán)染料.該物質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定,而且其吸光度與樣液中氨含量在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,故可比色測(cè)定.

1.2儀器與試劑

試驗(yàn)樣品選用的原料肉為新鮮牛肉,取自浙江兩岸食品連鎖有限公司.試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,標(biāo)準(zhǔn)物氯化銨為優(yōu)級(jí)純.溶劑用水為無(wú)氨蒸餾水.溶液有氨標(biāo)準(zhǔn)貯備液和使用液、PHB溶液、次氯酸鈉溶液.氨標(biāo)準(zhǔn)貯備液:稱取1.571 0g于105～110℃干燥恒重的氯化銨,加適量水溶解后移入100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混勻待用.此溶液每毫升相當(dāng)于5 000μg的氨.氨標(biāo)準(zhǔn)使用液:臨用前,準(zhǔn)確吸取氨標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00mL,置于1 000mL容量瓶中,加水定容至刻度.此溶液每毫升相當(dāng)于5.0μg的氨.PHB溶液:稱取30.0g PHB、0.20g硝普鈉溶于300mL水后過(guò)濾,濾液中加入20.0g酒石酸鉀鈉,溶解后加水定容至500mL,4℃保存.次氯酸鈉溶液:稱取20.0g氫氧化鈉溶于100mL水,冷卻后加入安替福民溶液2.0mL,攪勻后加水定容至200mL,4℃保存.試驗(yàn)使用的主要設(shè)備有:UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司)、THZ-82B氣浴恒溫振蕩器(金壇國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司).

1.3方法

1.3.1原料肉樣品處理.取適量原料肉按采樣和制樣要求[4]制備5份新鮮肉樣,每份10.0g.其中,1份肉樣立即制備肉樣浸提液(簡(jiǎn)稱肉浸液),編號(hào)為0,其余肉樣室溫放置,每隔24h取1份制備肉浸液,依次編號(hào)為1～4.10%肉浸液制備方法為1份肉樣置于盛有100mL水的碘量瓶中,蓋塞后不斷振蕩使肉樣均勻分散,浸提30min后過(guò)濾,濾液置于4℃保存.

上述0～4號(hào)肉浸液按照GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[5](以下簡(jiǎn)稱國(guó)標(biāo)法)測(cè)定總揮發(fā)性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen, TVB-N)含量,TVB-N值分別為7.19、16.53、40.60、85.37、180.96(mg/100g).依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中TVB-N≤15mg/100g可判定為新鮮肉[6],故選擇0號(hào)和1號(hào)肉浸液分別作為新鮮肉和變質(zhì)肉浸液.

1.3.2分光光度法測(cè)定條件的優(yōu)化.

(1)測(cè)定波長(zhǎng)的確定.取2支25mL具塞比色管,分別準(zhǔn)確加入1.0mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液和1號(hào)肉浸液,然后2支管均依次加入2.0mL溶液、1.0mL次氯酸鈉溶液,搖勻,置于35℃恒溫水浴中加熱20min,取出后冷卻至室溫,加水定容,用1cm比色皿于300～800nm區(qū)域分別掃描吸收曲線.以1.0mL蒸餾水作空白對(duì)照.

(2)反應(yīng)條件的確定.準(zhǔn)確吸取1.0mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液置于25mL具塞比色管中,參照(1)中步驟及在其所確定的測(cè)定波長(zhǎng)下,分別考察P HB溶液用量、次氯酸鈉溶液用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等單因素對(duì)吸光度的影響,據(jù)此確定最佳反應(yīng)條件.

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立.準(zhǔn)確吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60、2.00、3.00、4.00(mL)氨標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0、20.0(μg)氨),分別置于10支25mL具塞比色管中,按照(2)中確定的最佳測(cè)定條件測(cè)定10支管的吸光度,以氨濃度(μg/25mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)作圖繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2　結(jié)果與分析

2.1測(cè)定條件的優(yōu)化

2.1.1吸收光譜與測(cè)定波長(zhǎng)的確定.氨標(biāo)準(zhǔn)使用液和肉浸液的吸收曲線非常相似,其顯色反應(yīng)產(chǎn)物均呈現(xiàn)出兩個(gè)明顯的吸收峰,即第一個(gè)吸收峰在400nm處,根據(jù)Berthelot反應(yīng)原理,推測(cè)該吸收峰是由過(guò)量的硝普鈉產(chǎn)生的[7];第二個(gè)吸收峰在695nm處,是由顯色反應(yīng)產(chǎn)物靛酚藍(lán)染料產(chǎn)生的,如圖1所示.本試驗(yàn)選擇695nm作為分光光度法的測(cè)定波長(zhǎng).

圖1 顯色反應(yīng)產(chǎn)物的吸收曲線

2.1.2反應(yīng)條件的確定.

(1)PHB溶液用量對(duì)吸光度的影響.取7支25mL具塞比色管,分別準(zhǔn)確加入1.0mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液,按照1.3.2(1)中步驟操作,其中改變7支管加入PHB溶液用量,測(cè)定波長(zhǎng)為695nm,其余步驟條件不變,結(jié)果如圖2所示.

圖2　PHB溶液用量的影響

由圖2可知,試劑用量在3.0～4.0mL范圍內(nèi),其顯色效果穩(wěn)定且吸光度較大,故PHB溶液用量可取3.0mL.

(2)次氯酸鈉溶液用量對(duì)吸光度的影響.取6支25mL具塞比色管,分別準(zhǔn)確加入1.0mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液,按照1.3.2(2)中步驟操作,其中改變6支管加入次氯酸鈉溶液用量,測(cè)定波長(zhǎng)為695nm,其余步驟條件不變,結(jié)果如圖3所示.

圖3　次氯酸鈉溶液用量的影響

由圖3可知,隨著試劑用量遞增,吸光度變化呈現(xiàn)出前期平穩(wěn)上升,至用量為1.5mL時(shí)達(dá)到最大,其后顯著下降,故次氯酸鈉溶液用量可取1.5mL.

(3)反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響.取8支25mL具塞比色管,分別準(zhǔn)確加入1.0mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液,按照1.3.2(1)中步驟操作,其中改變8支管的反應(yīng)溫度,測(cè)定波長(zhǎng)為695 nm,其余步驟條件不變,結(jié)果如圖4所示.

由圖4可知,吸光度隨著反應(yīng)溫度遞增而發(fā)生顯著變化,至37℃時(shí)達(dá)到最大值,其后逐步下降,故反應(yīng)溫度可設(shè)為37℃.

(4)反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響.取6支25mL具塞比色管,分別準(zhǔn)確加入1.0mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液,按照1.3.2(1)中步驟操作,其中改變6支管的反應(yīng)時(shí)間,測(cè)定波長(zhǎng)為695 nm,其余步驟條件不變,結(jié)果如圖5所示.

圖4　反應(yīng)溫度的影響

圖5　反應(yīng)時(shí)間的影響

由圖5可知,顯色反應(yīng)30min內(nèi),反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度顯著影響,至30min時(shí)吸光度達(dá)到較大值,其后在30～60min內(nèi)顯色效果保持穩(wěn)定,60min后吸光度趨于下降,至90min時(shí)下降顯著.這表明顯色反應(yīng)產(chǎn)物在1h內(nèi)穩(wěn)定,考慮到測(cè)定工作效率,反應(yīng)時(shí)間應(yīng)選擇30min為宜,并在1h內(nèi)完成吸光度測(cè)定工作.

分光光度法的最佳測(cè)定條件為:25mL具塞比色管中加入1.0mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液,依次加入3.0mL PHB溶液和1.5mL次氯酸鈉溶液,充分混勻,37℃水浴加熱30min,冷卻至室溫,在695nm處測(cè)定吸光度.

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在測(cè)定波長(zhǎng)695nm處,氨濃度在0.00～20.00 μg/25mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(見(jiàn)圖6),線性方程為y=0.0477x+0.0118(R=0.9996,n=9).肉樣中氨含量C的計(jì)算公式為:

其中,C為肉樣中氨含量(μg/g),A為測(cè)試液的吸光度.

由此得出,分光光度法檢測(cè)肉樣中氨含量的有效范圍為0.00～200.00μg/g,最低檢測(cè)限為1.72μg/g.

2.3精密度試驗(yàn)

圖6　吸光度對(duì)氨濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6支25mL具塞比色管,分別準(zhǔn)確加入1.0mL 1號(hào)肉浸液,按照2.1.2中確定的最佳測(cè)定條件操作,測(cè)定6支管的吸光度,結(jié)果見(jiàn)表1.

由表1可知,該組數(shù)據(jù)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差R S D小于1%,表明分光光度法精密度高且可靠性好.

表1　精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.4回收率試驗(yàn)

取5支25mL具塞比色管,分別準(zhǔn)確加入1.0mL 1號(hào)肉浸液,編號(hào)0～4,5支管分別加入0.00、0.10、0.20、0.30、0.40mL氨標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0.00、0.50、1.00、1.50、2.00(μg)氨),按照2.1.2中確定的最佳測(cè)定條件操作,測(cè)定5支管的吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出相應(yīng)的氨濃度,結(jié)果見(jiàn)表2.

表2　回收率試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知,樣品加標(biāo)回收率在97.30%～106.00%之間,回收率均值接近100%,且其RSD小于5%,表明分光光度法準(zhǔn)確度較高,測(cè)定結(jié)果可信.

2.5肉浸液放置時(shí)間的影響

將制備好的1號(hào)肉浸液常溫放置,之后每隔1 h準(zhǔn)確吸取1.0～25mL肉浸液置于具塞比色管中,按照2.1.2中步驟操作完成顯色反應(yīng),測(cè)定1次吸光度,測(cè)定波長(zhǎng)為695nm,如圖7所示.

由圖7可知,常溫下放置超過(guò)3h,肉浸液中氨濃度開(kāi)始顯著增加,故制備好的肉浸液應(yīng)及時(shí)開(kāi)展和完成測(cè)定工作,若需延時(shí)測(cè)定,則肉浸液必須低溫保存.

2.6實(shí)際樣品測(cè)定與比較試驗(yàn)

圖7 肉浸液放置時(shí)間的影響

準(zhǔn)備5份新鮮肉樣,每份10.0g,按照1.3.1中步驟操作,每隔24h取1份肉浸液,編號(hào)為0～4號(hào).每種肉浸液均按照國(guó)標(biāo)法[5]測(cè)定TVB-N含量,同時(shí)準(zhǔn)確吸取1.0mL肉浸液置于25mL具塞比色管中,按照分光光度法測(cè)定氨含量,每次測(cè)定均做3個(gè)平行試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 分光光度法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定的結(jié)果比較

由表3可知,肉樣放置時(shí)間與分光光度法測(cè)得的氨含量和國(guó)標(biāo)法測(cè)得的TVB-N含量均呈正相關(guān),表明分光光度法測(cè)得的氨含量可用于定量表征肉樣腐敗變質(zhì)的變化過(guò)程.其中,肉樣放置0～48h,測(cè)得氨含量小于200.00μg/g,處于分光光度法的有效測(cè)定范圍內(nèi);肉樣放置4 8h以上,則難以保證測(cè)定的準(zhǔn)確度與精密度.分光光度法在準(zhǔn)確度上可與國(guó)標(biāo)法達(dá)到一致,在精密度上能超過(guò)國(guó)標(biāo)法,加之相比于國(guó)標(biāo)法,其操作更為簡(jiǎn)便省時(shí),大大提高了批量檢測(cè)的工作效率,故非常適用于原料肉新鮮度的快速檢測(cè),可作為國(guó)標(biāo)法之外的一種備選方法.

3　結(jié) 論

本文構(gòu)建的分光光度法應(yīng)用于肉樣中微量氨測(cè)定,可在有效測(cè)定范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度,所測(cè)結(jié)果可有效判斷原料肉的新鮮度.加之其對(duì)儀器、試劑要求不高,操作簡(jiǎn)單,可面向中小型肉類加工企業(yè)推廣與應(yīng)用,具有一定的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值.

[1]張應(yīng)龍,王立東,戰(zhàn)偉偉,等.肉品新鮮度快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].肉類研究,2011(8):42-46.

[2]周光宏.肉品加工學(xué)[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社,2009:142.

[3]李汝春,鞠雷,葛愛(ài)民.肉新鮮度的理化學(xué)檢驗(yàn)方法[J].肉類工業(yè),2015(11):45-47.

[4]食品分析[M].大連輕工業(yè)學(xué)院,華南理工大學(xué),鄭州輕工業(yè)學(xué)院,等編.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2007:99-103.

[5]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.GB/T 5009.44-2003 肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2003.

[6]胡亞云,李志成,梁娜,等.比色法測(cè)定原料肉新鮮度方法的建立[J].食品工業(yè)科技,2014(18):59-62,66.

[7]陶輝,王玲,李星,等.飲用水氯胺法消毒過(guò)程中一氯胺的水楊酸分光光度法測(cè)定[J].環(huán)境化學(xué),2009(1):126-131.

[責(zé)任編輯:吳春琴]

A Spectrophotometry to Test Ammonia Content in Meat Used as Raw Materials

ZHOU Jidong1, HUANG Wei2, ZHU Chengjie1, WEI Xiaoling2
(1.Biotechnology Department, Zhejiang Yuying Vocational Technology College, Hangzhou, 310018, China; 2.Zhejiang Cross-straits Food Chain Co. Ltd., Hangzhou, 310018, China)

One new spectrophotometry is set up to test ammonia content in meat used as raw materials with the purpose of evaluating the freshness of the meat. By using P-hydroxybenzoic acid monosodium salt (PHB) as chromogenic agent, the relation between ammonia content and absorbance in the meat has been studied. Results show that to heat for 30minutes in water bath at 37℃, the 1.0mL of meat extract bouillon added with 3.0mL of PHB solution and 1.5mL of sodium hypochlorite solution will turn out fine linear relation between ammonia content and absorbance within 0.00～20.00μ g/25mL when absorbance is measured 695 nm away. Characterized with its high precision and accuracy, sensitiveness, being easy to operate, and low demand for instruments and reagent, the spectrophotometry can be used as an alternative for testing freshness of meat and can be introduced to small and medium meat processing enterprises and used there.

Meat used as raw materials; Ammonia; Freshness; Spectrophotometry

O657.3;TS251.7

A

1671-4326(2016)02-0060-04

10.13669/j.cnki.33-1276/z.2016.040

2016-03-28

2015年度浙江省高等學(xué)校國(guó)內(nèi)訪問(wèn)工程師校企合作項(xiàng)目(137);浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃(新苗人才計(jì)劃)項(xiàng)目20(2016R453001);浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級(jí)課題(YYFW1501)

周紀(jì)東(1976-),男,浙江杭州人,浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系講師,碩士;黃偉(1976-),男,浙江金華人,浙江兩岸食品連鎖有限公司高級(jí)工程師,碩士;朱城杰(1993-),男,浙江蕭山人,浙江育英職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)系畢業(yè)生;魏曉玲(1995-),女,浙江海寧人,浙江兩岸食品連鎖有限公司食品檢驗(yàn)工.