陳惠蘭　張曉燕　陳磊　殷耀　丁濤　朱文君　黃娟　楊雯筌（江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心國(guó)家蜂產(chǎn)品基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，南京210001）

蜂蜜中泰樂(lè)菌素A的穩(wěn)定性研究

陳惠蘭張曉燕陳磊殷耀丁濤朱文君黃娟楊雯筌
（江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心國(guó)家蜂產(chǎn)品基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，南京210001）

泰樂(lè)菌素A對(duì)控制有土霉素抗性的美洲幼蟲(chóng)腐臭病很有效，且對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)毒性較小，但過(guò)度使用會(huì)在蜂產(chǎn)品中殘留。由于蜂蜜為弱酸性，泰樂(lè)菌素A在酸性條件下易降解。本文研究了不同溫度下蜂蜜中泰樂(lè)菌素A的穩(wěn)定性，并建立了蜂蜜中泰樂(lè)菌素A及其降解產(chǎn)物脫紅霉糖泰樂(lè)菌素的測(cè)定方法：以pH 6.0的磷酸鹽緩沖液為提取劑，經(jīng)HLB小柱凈化富集后，采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。該方法前處理簡(jiǎn)單，對(duì)泰樂(lè)菌素A和脫紅霉糖泰樂(lè)菌素的檢出限和定量限分別為1.0和2.0μg/kg，回收率范圍為70.75～89.28%，RSD為6.4～8.9%。方法回收率穩(wěn)定且重現(xiàn)性較好，能滿足日常檢測(cè)工作的需要。

蜂蜜；泰樂(lè)菌素A；脫紅霉糖泰樂(lè)菌素；穩(wěn)定性；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜

引言

泰樂(lè)菌素A是從弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的培養(yǎng)液中獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，早在1970年泰樂(lè)菌素首次被報(bào)道可作為治療美洲幼蟲(chóng)腐臭?。ˋFB）的候選藥物，2002年Elzen P等發(fā)現(xiàn)其對(duì)控制有土霉素抗性的AFB很有效，且對(duì)蜜蜂的生長(zhǎng)毒性較小[1]，所以美國(guó)FDA批準(zhǔn)其用于蜜蜂AFB的治療。然而抗生素過(guò)度使用不但會(huì)在蜂產(chǎn)品中殘留、影響蜂產(chǎn)品的品質(zhì)，還能破壞蜂群內(nèi)微生物平衡，給有害菌發(fā)展創(chuàng)造條件并誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐藥性，甚至?xí)斐森h(huán)境的污染。

目前的文獻(xiàn)多是關(guān)于蜂蜜中泰樂(lè)菌素殘留的檢測(cè)方法，涉及其在蜂蜜中穩(wěn)定性的研究比較少，由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在酸性條件下不穩(wěn)定，而蜂蜜呈弱酸性，所以研究蜂蜜中泰樂(lè)菌素A的穩(wěn)定性及其降解產(chǎn)物有助于確定養(yǎng)蜂過(guò)程中的休藥期，避免蜂蜜產(chǎn)品中抗生素殘留超標(biāo)。

泰樂(lè)菌素的檢測(cè)方法主要有ELISA法[2]、生物傳感器法[3-4]、膠體金法[5]、高效液相色譜法[6-8]以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]，由于ELISA法、表面等離子共振生物傳感器法、膠體金法、高效液相色譜法等存在靈敏度低、假陽(yáng)性等情況，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是最常用的檢測(cè)方法。本文主要采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法比較了不同溫度下蜂蜜中泰樂(lè)菌素A的降解情況，同時(shí)檢測(cè)降解產(chǎn)物脫紅霉糖泰樂(lè)菌素的含量。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

Thermo Finnigan Surveyor液相色譜系統(tǒng)和 TSQ Vantage串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）；N-EVAPTM111氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates公司）；超純水器（MILLIPORE公司）。

1.2試劑與溶液

泰樂(lè)菌素A（USP）、脫紅霉糖泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)品（Toronto Research Chemicals Inc.）。用甲醇溶解并配成0.5 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再逐級(jí)稀釋成0.5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線按照1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/L的濃度配成6點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)溶液。磷酸氫二鉀、鹽酸均為分析純，甲醇、甲酸均為色譜純。0.2mol/L磷酸二氫鉀緩沖液：稱取 22.8 g K2HPO4·3H2O，用300mL水溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，用水定容至500mL。

1.3樣品前處理

1.3.1樣品提取和凈化

稱取蜂蜜樣品5.00（±0.05）g于50 ml具塞聚丙烯離心管中，加入磷酸鹽緩沖液15 ml，渦旋混勻1min，上清液過(guò)濾于一干凈玻璃離心管中，過(guò)HLB小柱（預(yù)先用3 ml甲醇和3 ml水處理）凈化。上樣后用3 ml水淋洗，用5 ml甲醇洗脫。洗脫液于45℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?.0 ml甲醇-水（3∶7）溶解，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2分析測(cè)定條件

HPLC條件：Varian Polaris C-18色譜柱（100mm× 2.1 mm,5 μm）；流動(dòng)相：A，甲醇，B，0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～1 min 10%A，1.1～2 min 10～60%A，2.1～7min 60%A，7.1～8min 60～90%A，8.1～9min 90%A，9.1～11min 10%A；流速：0.25 ml/min；柱溫為室溫，進(jìn)樣體積為25 μl。

MS/MS條件：采用ESI源，正離子方式檢測(cè)；噴射電壓：2500 V；鞘氣（Sheath Gas）50，輔助氣（Auxiliary Gas）6。其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1　泰樂(lè)菌素A和脫紅霉糖泰樂(lè)菌素的母離子、子離子和碰撞能量

3　結(jié)果與討論

3.1前處理?xiàng)l件

大環(huán)內(nèi)酯類藥物在酸性條件（pH<4）下苷鍵易水解，而堿性條件（pH>9）可使內(nèi)酯環(huán)開(kāi)裂，所以對(duì)于蜂蜜中泰樂(lè)菌素的前處理選擇了pH4～10的磷酸鹽提取液進(jìn)行比較，不同pH值提取液的回收率見(jiàn)圖1。由圖1可知，提取液pH值為6時(shí)，泰樂(lè)菌素A的回收率最高，為76%，而脫紅霉糖泰樂(lè)菌素在pH值為5和6時(shí)相差不大，所以最終選擇了pH 6的提取液。

圖1　不同pH值提取液對(duì)泰樂(lè)菌素A和脫紅霉糖泰樂(lè)菌素的回收率

3.2不同溫度下成熟蜜和生蜜中泰樂(lè)菌素A的穩(wěn)定性

在成熟蜜（經(jīng)蜜蜂充分釀造、脫水的蜂蜜，含水量在20%以下）和生蜜（蜜蜂剛采回不久沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分釀造的蜂蜜，水分含量較高）中添加泰樂(lè)菌素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加量為20 μg/kg，攪勻后各分成兩份，分別放置于4℃冰箱和室溫，選擇不同時(shí)間檢測(cè)其中泰樂(lè)菌素A的含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，室溫放置時(shí)，成熟蜜和生蜜中泰樂(lè)菌素A含量均在下降，脫紅霉糖泰樂(lè)菌素含量在逐漸上升，且在生蜜中降解更快；4℃冰箱放置的蜂蜜中的泰樂(lè)菌素A含量較穩(wěn)定。蜂蜜中水分含量和蜂蜜放置溫度均對(duì)泰樂(lè)菌素A的穩(wěn)定性有影響。

圖2　不同溫度下成熟蜜和生蜜中泰樂(lè)菌素A及其代謝物

3.3方法的線性范圍、檢測(cè)限、添加回收實(shí)驗(yàn)和精密度

配制質(zhì)量濃度為2.0～100μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測(cè)物峰面積 (y)為縱坐標(biāo)，待測(cè)物的質(zhì)量濃度(x,μg/ kg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，均獲得良好的線性。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖3，在陰性蜂蜜樣品中添加待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，提取凈化后進(jìn)行測(cè)定，確定方法的檢出限和定量限分別為1.0和2.0μg/kg。在陰性蜂蜜中加入泰樂(lè)菌素A及脫紅霉糖泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液（添加水平為2.0、5.0和10.0μg/kg），每個(gè)水平做6個(gè)平行，回收率和精密度數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。采用本方法檢測(cè)了150個(gè)蜂蜜樣品，其中一個(gè)檢出泰樂(lè)菌素A，檢測(cè)結(jié)果為4.2 μg/kg。

圖3　泰樂(lè)菌素A及脫紅霉糖泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

4　結(jié)論

本文研究蜂蜜中泰樂(lè)菌素A的穩(wěn)定性，泰樂(lè)菌素A在蜂蜜中會(huì)發(fā)生降解，生成代謝物脫紅霉糖泰樂(lè)菌素；同時(shí)建立蜂蜜中泰樂(lè)菌素A和脫紅霉糖泰樂(lè)菌素的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，方法前處理簡(jiǎn)單，回收率穩(wěn)定且重現(xiàn)性較好，能滿足日常檢測(cè)工作的需要。

表2　回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

[1]張睿.蜂產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)指南[M].南京：南京大學(xué)出版社，2013：85.

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The stability of Tylosin A in honey

Cheng Huilan,Zhang Xiaoyan,Chen Lei,Yin Yao,Ding Tao,Zhu Wenjun,Huang Juan,Yang Wenquan
（National Honey Reference Laboratory,Animal,Plant and Food Inspection Center(APFIC)of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Nanjing 210001,China）

Tylosin A is effective to AFB which is resistant to the antibiotic oxytetracycline and is almost non-toxicity to honeybees.However,tylosin A will remain in honey products if it was overdosed.Honey is weak acidic and tylosin A will degrade in acidic conditions.Therefore,the degradation was studied in honey at different tempeture and the method for determination of tylosin A and the metabolite desmycosin was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry.The antibiotics was extracted by phosphate buffer(pH6.0)and cleaned-up by HLB.The limit of detection and the limit of quantitation were 1.0μg/kg and 2.0μg/kg,respectively.The recoveries ranged from 70.75%to 89.28%while the precision from 6.4%to 8.9%.The method was used in detection.

honey，tylosin A，desmycosin，stability，high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

陳惠蘭，女，高級(jí)工程師，主要研究獸藥殘留檢測(cè)。

張曉燕，女，高級(jí)工程師，主要研究獸藥殘留檢測(cè)，E-mail：zhangxy@jsciq.gov.cn。