王　訊，孫樹(shù)梅，歐陽(yáng)妮，張亞莉，芮勇宇

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州　510515)

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·論著·

秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥肺炎克雷伯菌感染模型的建立

王訊，孫樹(shù)梅，歐陽(yáng)妮，張亞莉，芮勇宇

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州510515)

目的建立泛耐藥肺炎克雷伯菌(XDRKP)感染秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型。方法在液體條件下，利用臨床分離的XDRKP菌株感染秀麗隱桿線蟲(chóng)，觀察線蟲(chóng)存活及體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量變化情況。結(jié)果線蟲(chóng)感染XDRKP后活動(dòng)明顯遲緩，不同濃度的XDRKP對(duì)線蟲(chóng)的致死情況不同。log-rank檢驗(yàn)顯示，1.5×106CFU/mL XDRKP組與E.coliOP50對(duì)照組的生存曲線差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.08，P>0.05)；1.5×107、1.5×108CFU/mL組與E.coliOP50對(duì)照組的生存曲線差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)(χ2值分別為229.37、275.98，均P<0.001)，1.5×108與1.5×107CFU/mL XDRKP組線蟲(chóng)的生存率低于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)獲得上清懸液，經(jīng)細(xì)菌純培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏測(cè)試，證實(shí)為XDRKP。XDRKP感染線蟲(chóng)4、6、12、24 h后，線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌總量分別為(0.28±0.02)×105、(0.50±0.38)×105、(1.73±0.56)×105、(2.62±0.53)×105CFU/mL，不同時(shí)間線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌總數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1 363.39，P<0.001)。結(jié)論成功建立了秀麗隱桿線蟲(chóng)-XDRKP感染模型。

秀麗隱桿線蟲(chóng)； 泛耐藥； 肺炎克雷伯菌； 感染； 模型

[Chin J Infect Control，2016，15(7)：457-460]

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，KP)屬腸桿菌科細(xì)菌，是引起醫(yī)院感染的常見(jiàn)條件致病菌。近年來(lái)，隨著碳青霉烯類(lèi)抗生素的長(zhǎng)期、大量、廣泛使用，導(dǎo)致耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)菌株的檢出率呈上升趨勢(shì)。2014年CHINET中國(guó)細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)腸桿菌科細(xì)菌中均存在CRE菌株，以克雷伯菌屬最多，該菌對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率均>10%[1]。由于CRE菌株往往呈泛耐藥(extensively drug resistance，XDR)或全耐藥(pandrug resistance，PDR)的特征，導(dǎo)致感染患者可能陷入無(wú)藥可用的困境[2]。

秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)是一種國(guó)際公認(rèn)、簡(jiǎn)單有效的模式生物，其具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、遺傳背景清晰、生命周期短等特點(diǎn)，在病原菌研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。目前，已證實(shí)約40種人類(lèi)致病菌(包括革蘭陽(yáng)性菌、革蘭陰性菌和真菌)會(huì)對(duì)線蟲(chóng)造成感染[3]，其致病機(jī)制與其在哺乳動(dòng)物中的表現(xiàn)極相似。鑒于國(guó)內(nèi)外關(guān)于KP感染秀麗隱桿線蟲(chóng)少有報(bào)道，本研究利用臨床上分離的泛耐藥肺炎克雷伯菌(extensively drug-resistantKlebsiellapneumoniae，XDRKP)，建立秀麗隱桿線蟲(chóng)-泛耐藥肺炎克雷伯菌感染模型，為研究病原菌致病機(jī)制及抗感染藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1線蟲(chóng)和細(xì)菌野生型秀麗隱桿線蟲(chóng)(WT Bristol N2)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)OP50由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；臨床分離的XDRKP由廣州市南方醫(yī)院臨床微生物室提供，采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的Phoenix-100型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏測(cè)試系統(tǒng),依據(jù)2015年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)M100-S25藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)判定[4]。

1.1.2培養(yǎng)基NGM(nematode growth media)培養(yǎng)基：胰蛋白胨25 g，瓊脂粉17 g，NaCl 3 g，加入蒸餾水975 mL，高溫高壓滅菌后冷卻至55℃，分別加入無(wú)菌膽固醇溶液(5 mg/mL，無(wú)水乙醇)1 mL，PBS液(pH=6.0)25 mL，1 mol/L MgSO41 mL，1 mol/L CaCl21mL，1 mol/L制霉菌素1 mL，分裝至直徑10 cm的培養(yǎng)皿中，備用；LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制。

1.1.3緩沖液及試劑M9緩沖液：6 g Na2HPO4，3 g KH2PO4，5 g NaCl，0.25 g MgSO4·7H2O，加入蒸餾水1 L，高壓滅菌后備用；線蟲(chóng)裂解液：4 mL蒸餾水，2 mL次氯酸鈉溶液，0.45 g NaOH，現(xiàn)用現(xiàn)配；疊氮化鈉(NaN3)、5-氟-2-脫氧尿嘧啶(FUDR)均購(gòu)置于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1線蟲(chóng)的培養(yǎng)線蟲(chóng)按照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)程序[5]進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2線蟲(chóng)同期化處理用M9緩沖液從NGM培養(yǎng)板上洗下蟲(chóng)體，收集、離心(3 500 r/min，3 min)、棄上清，剩余3.5 mL，加入1.5 mL線蟲(chóng)裂解液，劇烈震蕩約8 min，M9洗滌3次，即從妊娠的成體線蟲(chóng)中分離得到蟲(chóng)卵，后20℃振蕩過(guò)夜孵育，獲得L1期幼蟲(chóng)，將其置于新的NGM平板E.coliOP50菌苔上，20℃培養(yǎng)48 h，即得到同步化的L4期線蟲(chóng)。

1.2.3菌懸液的配制將凍存的菌株復(fù)蘇，劃線培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落，再接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，150 r/min 震蕩培養(yǎng)一定時(shí)間，備用。

1.2.4線蟲(chóng)感染致死實(shí)驗(yàn)用M9緩沖液從平板上洗下培養(yǎng)至L4期線蟲(chóng)，離心(3 500 r/min，3 min)，重復(fù)2～3次，懸浮后取10 μL在顯微鏡下觀察線蟲(chóng)懸液中線蟲(chóng)的數(shù)量，然后取含有20～30條線蟲(chóng)的懸液置于96孔板中，感染組分別加入終濃度為1.5×108、1.5×107、1.5×106CFU/mL的XDRKP，陰性對(duì)照組加入終濃度為 1×109CFU/mL的E.coliOP50，空白對(duì)照組加入20%LB溶液；每種菌液做5個(gè)平行，其中為防止N2線蟲(chóng)繁殖，滴加0.2 mmol/L的FUDR，96孔板放置于相對(duì)濕度80%～85%的培養(yǎng)箱，20℃培養(yǎng)，每天記錄線蟲(chóng)的存活數(shù)。所有組均重復(fù)3次。

1.2.5線蟲(chóng)腸道內(nèi)細(xì)菌計(jì)數(shù)選取1.5×108CFU/mL XDRKP感染線蟲(chóng)，每隔一定的時(shí)間，挑取10條經(jīng)細(xì)菌感染的線蟲(chóng)，用含有l(wèi) mmol/L NaN3(麻醉劑)的M9緩沖液清洗3遍，以清除線蟲(chóng)體表的細(xì)菌，然后轉(zhuǎn)移至裝有400 mg石英砂的小試管，加1 mL PBS緩沖液渦旋振蕩2～3 min，得到的上清懸浮液稀釋涂布、計(jì)數(shù)，以確定每條線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量。

1.2.6感染線蟲(chóng)腸道細(xì)菌鑒定經(jīng)上述1.2.5步驟得到的上清懸液，經(jīng)細(xì)菌純培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)菌重新鑒定及藥敏測(cè)試[4]。

1.3統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件，線蟲(chóng)生存時(shí)間采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，log-rank檢驗(yàn)法對(duì)組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。計(jì)量資料采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1XDRKP對(duì)線蟲(chóng)的感染致死判定XDRKP感染秀麗隱桿線蟲(chóng)，顯微鏡下觀察，活蟲(chóng)呈正弦曲線特征，咽部肌肉運(yùn)動(dòng)；而XDRKP感染的死亡線蟲(chóng)呈直線型，咽部無(wú)運(yùn)動(dòng)，見(jiàn)圖1。

虛線箭頭：線蟲(chóng)處于存活狀態(tài)；實(shí)線箭頭：線蟲(chóng)處于死亡狀態(tài)

Figure 1Death / survival status ofC.elegansinfected with XDRKP

2.2秀麗隱桿線蟲(chóng)生存時(shí)間比較采用不同濃度XDRKP感染秀麗隱桿線蟲(chóng)，以線蟲(chóng)是否死亡為結(jié)局變量，記錄線蟲(chóng)的生存狀況以及作生存分析。結(jié)果顯示，其中7 d觀察線蟲(chóng)生存狀況，不同細(xì)菌濃度(1.5×108、1.5×107、1.5×106CFU/mL XDRKP，以及E.coliOP50對(duì)照組)的線蟲(chóng)平均存活率分別為0、25.31%、83.95%、100%。隨著細(xì)菌濃度降低，線蟲(chóng)的最長(zhǎng)存活時(shí)間與線蟲(chóng)半數(shù)致死時(shí)間(lethal time of 50%，LT50)有所延長(zhǎng)。見(jiàn)表1。采用log-rank檢驗(yàn)顯示，1.5×106CFU/mL XDRKP組與E.coliOP50對(duì)照組的生存曲線無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.08，P>0.05)；1.5×107、1.5×108CFU/mL組與E.coliOP50對(duì)照組的生存曲線差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)(χ2值分別為229.37、275.98，均P<0.001)，1.5×108與1.5×107CFU/mL XDRKP組的生存率低于對(duì)照組。

2.3線蟲(chóng)腸道內(nèi)細(xì)菌鑒定及計(jì)數(shù)選取1.5×108CFU/mL XDRKP感染線蟲(chóng)，觀察不同時(shí)間線蟲(chóng)存活數(shù)量和狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)得到的上清懸液，經(jīng)細(xì)菌純培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏測(cè)試，證實(shí)為XDRKP。感染XDRKP 4、6、12、24 h后，線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌總量分別為(0.28±0.02)×105、(0.50±0.38)×105、(1.73±0.56)×105、(2.62±0.53)×105CFU/mL。經(jīng)方差分析，不同時(shí)間線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌總數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1 363.39，P<0.001)；經(jīng)SNK檢驗(yàn)顯示，各時(shí)間點(diǎn)間體內(nèi)細(xì)菌總量均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，XDRKP感染線蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)菌總量逐漸增加。

表1不同濃度XDRKP感染的秀麗隱桿線蟲(chóng)生存時(shí)間

Table 1Survival time ofC.elegansinfected with different concentrations of XDRKP

細(xì)菌種類(lèi)細(xì)菌濃度(CFU/mL)線蟲(chóng)最長(zhǎng)存活時(shí)間(d)LT50(d)空白對(duì)照01812.00±0.70E.coliOP501092112.00±0.42XDRKP1.5×1061812.00±0.79XDRKP1.5×107106.00±0.20XDRKP1.5×10873.00±0.17

圖2 　不同濃度XDRKP感染的秀麗隱桿線蟲(chóng)生存曲線

Figure 2Survival curves ofC.elegansinfected with different concentrations of XDRKP

3　討論

秀麗隱桿線蟲(chóng)是一種以細(xì)菌為食的小型土壤線蟲(chóng)，因其全身透明易于觀察、生命周期短、操作方便簡(jiǎn)單、培養(yǎng)成本低廉、可操控性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，成為應(yīng)用廣泛的模式生物。但是，唯有病原菌對(duì)線蟲(chóng)致病，線蟲(chóng)才有可能作為研究病原菌致病性及抗感染藥物篩選的模型。研究表明，糞腸球菌可以在線蟲(chóng)腸內(nèi)繁殖為更高的滴度，導(dǎo)致持續(xù)的感染，不能被根除，但高滴度的屎腸球菌也可以在線蟲(chóng)的腸內(nèi)累積，但不會(huì)影響線蟲(chóng)的壽命[6]；國(guó)內(nèi)也有報(bào)道，單核細(xì)胞增生李斯特菌不能殺死秀麗隱桿線蟲(chóng)，對(duì)線蟲(chóng)無(wú)顯著致病性，不適合作為研究李斯特菌致病機(jī)制的模型[7]。本研究利用臨床分離的XDRKP菌株，在液體條件下感染線蟲(chóng)，通過(guò)觀察線蟲(chóng)的生存狀態(tài)及線蟲(chóng)腸道細(xì)菌數(shù)量變化情況，探討線蟲(chóng)是否可以作為KP感染的模型。

目前，國(guó)內(nèi)線蟲(chóng)感染模型多采用經(jīng)典的固體平板殺線蟲(chóng)方法[8]，其過(guò)程繁瑣。研究[9]報(bào)道，固體平板實(shí)驗(yàn)與液體實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本研究采用液體條件下XDRKP菌株感染線蟲(chóng)，不足之處是未與傳統(tǒng)的固體平板殺線蟲(chóng)方法作對(duì)照。感染菌不是線蟲(chóng)常規(guī)的食物，研究[10]表明，線蟲(chóng)能區(qū)分不同細(xì)菌的氣味，從而避開(kāi)對(duì)其有害的食物而拒食。避免線蟲(chóng)為避開(kāi)感染菌苔而聚集于空白區(qū)域而達(dá)不到感染目的，固體實(shí)驗(yàn)感染菌的菌苔涂布采用全板涂布，但是需排除被平皿壁阻擋而死亡的線蟲(chóng)。

一個(gè)優(yōu)秀篩選模型的建立，必須具備良好的可操作性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，感染病原菌濃度的選擇十分重要，是決定線蟲(chóng)感染程度的重要條件之一。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)病原菌自身生長(zhǎng)特點(diǎn)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的菌液感染線蟲(chóng)被XDRKP感染的線蟲(chóng)活動(dòng)明顯遲緩，效果明顯。感染線蟲(chóng)的XDRKP濃度為1.5×107與1.5×108CFU/mL時(shí)，線蟲(chóng)的存活率低于對(duì)照組，線蟲(chóng)的最長(zhǎng)生存時(shí)間為7、10 d；XDRKP濃度為1.5×106CFU/mL時(shí)，線蟲(chóng)的存活率與對(duì)照組一致，說(shuō)明在1.5×107、1.5×108CFU/mL濃度范圍內(nèi)XDRKP對(duì)線蟲(chóng)有感染致死效果，初步建立泛耐藥肺炎克雷伯菌感染秀麗隱桿線蟲(chóng)感染模型。

本研究證實(shí)了線蟲(chóng)的死亡與腸道內(nèi)XDRKP感染有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，線蟲(chóng)腸道細(xì)菌計(jì)數(shù)得到的上清懸液，經(jīng)細(xì)菌純培養(yǎng)，采用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏結(jié)果證實(shí)為XDRKP，說(shuō)明XDRKP進(jìn)入到線蟲(chóng)體內(nèi)，感染了秀麗隱桿線蟲(chóng)。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，線蟲(chóng)腸道體內(nèi)細(xì)菌數(shù)不斷定植和繁殖，造成線蟲(chóng)的永久性感染直至死亡。

綜上所述，本研究利用臨床分離的XDRKP，在液體條件下成功建立了XDRKP感染線蟲(chóng)的模型，并證實(shí)了XDRKP在線蟲(chóng)體內(nèi)定植，不斷繁殖導(dǎo)致其死亡，該研究為下一步研究其致病機(jī)理以及藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯：左雙燕)

Establishment of an infection model usingCaenorhabditiselegans-extensively drug-resistantKlebsiellapneumoniae

WANGXun,SUNShu-mei,OUYANGNi,ZHANGYa-li,RUIYong-yu

(NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China)

ObjectiveTo establish an infection model usingCaenorhabditiselegans(C.elegans)-extensively drug-resistantKlebsiellapneumoniae(XDRKP)system.MethodsClinically isolated XDRKP strains were used to infectC.elegansin the liquid killing assay, the nematode survival and the number of bacteria inC.elegansdigestive tract was observed.ResultsC.eleganswas significantly retarded after being infected by XDRKP, different concentrations of XDRKP led to different patterns of the worm death. Log-rank test showed that survival curves ofC.elegansinfected with 1.5×106CFU/mL of XDRKP andE.coliOP50(control) were not significantly different (χ2=0.08，P>0.05); survival curves ofC.elegansinfected with 1.5×107CFU/mL, 1.5×108CFU/mL of XDRKP andE.coliOP50were significantly different(χ2=229.37, 275.98，respectively, bothP<0.001). The survival rates of 1.5×108and 1.5×107CFU/mL XDRKP groups were both lower than that of the control group. Supernatant suspension obtained from test was performed bacterial culture, identification and antimicrobial susceptibility testing, XDRKP was determined. After being infected with XDRKP 4, 6, 12, and 24 hours, the total number of bacteria inC.eleganswere(0.28±0.02)×105CFU/mL,(0.50±0.38)×105CFU/mL,(1.73±0.56)×105CFU/mL, and (2.62±0.53)×105CFU/mL，respectively, the number of bacteria inC.elegansdigestive tract was significantly different at different time points (F=1 363.39，P<0.001).ConclusionThe infection model ofC.elegans-XDRKP is established successfully.

Caenorhabditiselegans； extensively drug resistance；Klebsiellapneumoniae； infection； model

2016-03-08

2010年度院長(zhǎng)基金(2010C001)

王訊(1989-)，女(漢族)，河北省定州市人，碩士研究生，主要從事兒科感染性疾病研究。

孫樹(shù)梅E-mail:sunshumei99@126.com

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.07.004

R383.1

A

1671-9638(2016)07-0457-04