彭 雷，趙 艷，馬銀花

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

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基于巢式PCR的重疊延伸PCR優(yōu)化

彭 雷1，趙 艷2，馬銀花2

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001；2.武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430072)

[目的]結(jié)合巢式PCR對重疊延伸PCR進行優(yōu)化。[方法]以褐飛虱Actin1基因啟動子區(qū)與EGFP表達盒區(qū)基因融合為例，通過巢式PCR對重疊延伸PCR進行優(yōu)化。[結(jié)果]成功獲得融合片段，經(jīng)過巢式PCR優(yōu)化后大大簡化試驗流程，縮短試驗時間，并增強PCR特異性與檢出率。[結(jié)論]優(yōu)化了重疊延伸PCR，可更快速高效融合基因片段。

重疊延伸PCR；巢式PCR；褐飛虱；Actin1啟動子

重疊延伸PCR(splicing by overlap extensionPCR，SOE-PCR)由Horton 等[1-2]于1989 年創(chuàng)立。重疊延伸PCR是一種通過基因間重疊的部分互相搭橋，通過PCR延伸來擴增出融合基因，被廣泛應(yīng)用于基因定點突變、基因融合等領(lǐng)域[3-4]。巢式PCR(nested PCR)是一種在普通PCR技術(shù)上發(fā)展而來的技術(shù)，其原理為設(shè)計兩對引物，其中一對引物在另一對引物擴增產(chǎn)物的片段上，通過二次PCR反應(yīng)對某個基因進行檢測[5]。巢式PCR可大大降低假陽性，同時可使檢測的下限下降幾個數(shù)量級。筆者以褐飛虱Actin1基因啟動子區(qū)與增強綠色熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)融合為例，結(jié)合巢式PCR對重疊延伸PCR進行優(yōu)化，優(yōu)化后重疊延伸PCR可更快速高效融合基因片段。

1　材料與方法

1.1材料供試褐飛虱飼養(yǎng)在溫室，飼養(yǎng)溫度為(22～28)℃，光照時間 14 h/d。

1.2試劑pEGFP-N1載體、Top 10感受態(tài)細胞為武漢大學(xué)雜交水稻重點實驗室保存。高保真聚合酶KOD Plus購自Toyobo；PMD18-T Simple Vector、DNA solution I為TaKaRa產(chǎn)品。PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自O(shè)mega。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3褐飛虱DNA提取褐飛虱基因組 DNA 提取皆為單頭蟲提取，所用方法為 CTAB 法，參照文獻[6-7]并略做改動。將采集的單頭褐飛虱放入裝有400 μL 2%CTAB的1.5 mL離心管中，用勻漿小棒搗碎勻漿；將勻漿液放入60 ℃水浴鍋水浴60 min裂解；在裂解完畢后的勻漿液中加入200 μL氯仿/異戊醇(24∶1)抽提2次；加入2倍體積無水乙醇-20 ℃沉淀；最后DNA風(fēng)干后溶于50 μL TE，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4PCR擴增以褐飛虱基因組為模板，引物A1-1與A1down擴增褐飛虱Actin1基因啟動子區(qū)，A1-1序列：5′-CCTATAAAATGATCATCTATTG-3′；A1down序列：5′-CTTGCTCACCATGTTGATATCCTTTCTTGTTTAGTTAA-3′。A1-1位于Actin1距ATG上游1 031 bp的位置，A1down為下游嵌合引物，位于Actin1 ATG前端側(cè)翼起始位置。以pEGFP-N1載體作為模板，引物EGFPoverlapF與EGFP1擴增EGFP ORF框序列。EGFPoverlapF序列：5′-AGGATATCAACATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；EGFP1序列：5′-TTAAGATACATTGATGAGTTTGG-3′。EGFPoverlapF為上游嵌合引物，從載體679位的EGFP ATG開始，下游EGFP1引物為載體的1 643位開始。50 μL PCR體系：10×buffer 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，10 μmol/L引物 1.5 μL，KOD Plus 1 μL。兩次PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)。

取上2次PCR產(chǎn)物各1 μL作為模板并加入巢式引物，PCR反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)。巢式引物：A1-2 5′-TTGAAAAGTGCATCAATTTATAA-3′位于ATG上游1 007 bp位置；EGFP2 5′-TTTGGACAAACCACAACTAGAA-3′位于載體1 625 bp的位置。

1.5重疊片段測序鑒定先將擴增到的重疊片段純化后加入A尾，加A尾為普通PCR體系：10×PCR buffer 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，10 μL普通Taq酶，1 μg PCR產(chǎn)物，加dH2O至50 μL。反應(yīng)條件：72 ℃延伸30 min。加尾后的重疊片段和PMD18-T載體按3∶1混合，加入等體積DNA solution I，16 ℃連接5 h。將連接片段轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細胞，涂布氨芐LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落。以載體通用測序引物M13-47和RV-M 進行菌落PCR擴增，1%瓊脂糖電泳檢測插入片段大小，將陽性克隆的菌液送出測序。

2　結(jié)果與分析

利用褐飛虱基因組為模板擴增Actin1啟動子區(qū)序列，擴增出1 031 bp長片段(圖1)。以pEGFP-N1載體作為模板擴增EGFP完整表達盒序列，擴增到964 bp片段 (圖1)。各取2個基因PCR產(chǎn)物1 μL作為模板，加入巢式引物擴增得到1 953 bp片段(圖1)。連接PMD18-T載體，T-A克隆測序后證實成功通過重疊延伸PCR將兩基因融合(圖2)。

3　討論

對于2個基因融合的重疊延伸PCR的一般步驟：先設(shè)計4條引物A1、A2、B1、B2，其中，A2和B2為嵌合引物。A1和A2擴增A基因，B1和B2擴增B基因，將兩基因片段電泳切膠回收作為模板，加入A1與A2引物擴增，在A、B基因3′端的A2、B2引物嵌合序列搭橋?qū)、B融合，再用A1與A2引物以融合基因作為模板進行擴增。對于三段基因融合，同樣也擴增出三段基因，其中一段基因與另兩段基因搭橋[8]。重疊延伸PCR需要注意：重疊延伸PCR由于是多重PCR，擴增易產(chǎn)生堿基錯配，因此，重疊延伸PCR一般用高保真酶且控制循環(huán)數(shù)來最大限度地減低錯配幾率[9]。該研究以褐飛虱Actin1基因啟動子區(qū)和EGFP基因融合為例，結(jié)合巢式PCR對重疊延伸PCR進行優(yōu)化。只需多設(shè)計一對巢式引物，并在重疊延伸反應(yīng)中用巢式引物進行擴增，這樣可大大加快重疊延伸PCR過程，并增強特異性。傳統(tǒng)重疊延伸PCR首先擴增基因后需要切膠純化后才能進行下一步重疊，這樣才能保證擴增特異性，減少雜帶。且由于需純化，對前2個基因擴增產(chǎn)物有一定要求才能保證回收效果，而引入巢式PCR后可省去切膠回收過程，且對前2次PCR產(chǎn)物要求也降低。用巢式PCR對重疊延伸PCR優(yōu)化后使整個過程大大簡化，同時極大提高PCR檢出率，降低PCR擴增條件。

注：M.DNA Marker III；1和3.重疊延伸PCR產(chǎn)物；2.褐飛虱Actin 1基因啟動子區(qū)擴增產(chǎn)物；4.EGFP 表達盒擴增產(chǎn)物。Note：M：DNA Marker III；Lanes 1 and 3 were SOE-PCR products；Lane 1 was amplification products of Actin 1 promoter；Lane 4 was amplification products of EGFP expression cassette圖1　目的基因擴增與重疊延伸PCR擴增產(chǎn)物Fig.1　Amplification products of SOE-PCR and target gene amplification

注：方框為嵌合引物EGFPoverlapF序列，灰色背景序列為EGFP序列，灰色背景前序列為Actin 1啟動子區(qū)序列。Note：Box was the EGFPoverlapF sequence of chimeric primer；sequence of gray background was EGFP sequence；antecedent？ sequence of gray background was the sequence of Actin 1 promoter.圖2　重疊延伸PCR融合基因測序部分結(jié)果Fig.2　Sequencing results of fusion gene by SOE-PCR

[1] HO S N，HUNT H D，HORTON R M，et al.Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction[J].Gene，1989，77(1)：51-59.

[2] HORTON R M，HUNT H D，HO S N，et al.Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes：Gene splicing by overlap extension[J].Gene，1989，77(1)：61-68.

[3] 魏薇，李凡，陳海如.利用重疊延伸 PCR 技術(shù)擴增長片段 DNA[J].云南大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2008(S1)：86-88.

[4] 徐芳，姚泉洪，熊愛生，等.重疊延伸 PCR 技術(shù)及其在基因工程上的應(yīng)用[J].分子植物育種，2006，4(5)：747-750.

[5] 黃昆侖，羅云波.用巢式和半巢式 PCR 檢測轉(zhuǎn)基因大豆 Roundup Ready 及其深加工食品[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2003，11(5)：461-466.

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[8] THORNTON J A.Splicing by overlap extension PCR to obtain hybrid DNA products[J].Methods Mol Biol，2015，1373：43-49.

[9] 楊宇，吳元華，鄭雅楠.利用重疊延伸 PCR 技術(shù)進行 DNA 的人工合成[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(9)：1810-1811.

Optimization of Splicing by Overlap Extension PCR Using Nested PCR

PENG Lei1, ZHAO Yan2, MAYin-hua2

( 1. College of Life Sciences, Guizhou Normal University, Guiyang, Guizhou 550001; 2. College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, Hubei 430072)

[Objective] To optimize the Splicing by overlap extension PCR using nested PCR. [Method] Nested PCR was used to optimize SOE-PCR (splicing by overlap extension PCR) for combining brown planthopper (BPH)Actin1 promoter and EGFP expression cassette. [Result] Nested PCR could greatly optimize SOE-PCR. After optimization of nested PCR, the test process was simplified, and the detection time was shortened. The PCR specificity and detection rate were enhanced. [Conclusion] The optimized SOE-PCR can rapidly and effectively fuse the gene segment.

SOE-PCR; Nested PCR; Brown planthopper;Actin1 promoter

國家自然科學(xué)基金項目“水稻抗褐飛虱基因多樣性持續(xù)控制褐飛虱的分子機理”(31230060)。

彭雷(1980- )，男，四川南充人，實驗師，博士，從事水稻與褐飛虱互作研究。

2016-07-06

Q 78

A

0517-6611(2016)20-126-02