吳菲菲，徐永平，趙良忠，李淑英，李化強*

(1.邵陽學院生物與化學工程系，湖南邵陽 422000；2.大連理工大學生命科學與生物技術學院，遼寧大連 116024；3.大連賽姆生物工程技術有限公司博士后科研工作站，遼寧大連 116620)

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微切變-助劑互作技術制備鹿角盤微切助粉及其活性物質的檢測

吳菲菲1，2，3，徐永平2，3，趙良忠1，李淑英3，李化強1，2，3*

(1.邵陽學院生物與化學工程系，湖南邵陽 422000；2.大連理工大學生命科學與生物技術學院，遼寧大連 116024；3.大連賽姆生物工程技術有限公司博士后科研工作站，遼寧大連 116620)

[目的]檢測鹿角盤微切助粉中與骨質疏松癥有關的活性物質的含量。[方法]采用微切變-助劑互作技術制備鹿角盤微切助粉，通過與中藥粉碎技術相比，考察該技術對鹿角盤顆粒粒徑、形態(tài)的影響并檢測其中活性成分的含量。[結果]經(jīng)微切變-助劑互作技術處理后，鹿角盤粒徑在1～30 μm范圍內的顆粒數(shù)占82.73%，且細胞已被充分破碎，有效成分呈釋放的狀態(tài)。鹿角盤微切助粉中含有豐富的性激素(包括雌二醇、睪酮、孕酮)、類胰島素樣生長因子-1、檸檬酸鈣和鈣，且含量均高于其粗粉組，說明微切變-助劑互作技術有利于鹿角盤中活性成分的釋放，體現(xiàn)了該技術的優(yōu)越性。[結論]該研究可為合理開發(fā)利用鹿角盤提供一種新的粉碎技術，并為闡明鹿角盤防治骨質疏松癥提供理論依據(jù)。

鹿角盤；微切變-助劑互作技術；微切助粉；活性物質

據(jù)《神農本草經(jīng)》記載，鹿角盤味咸、微溫、無毒，具有溫補肝腎、強筋健骨、活血消腫、治陰癥瘡瘍、乳癰初起、瘀血腫痛等功效，我國民間常用于治療乳腺炎、惡瘡、癰腫等疾病[1]。現(xiàn)代研究證明，鹿角盤中含有豐富的氨基酸、多肽和蛋白質，還含有多糖、脂類以及鈣、磷等礦質元素[2]。然而，由于鹿角盤經(jīng)長時間的骨化，十分堅硬，不易粉碎，使得提取分離困難，在很大程度上直接影響其開發(fā)和利用[3]。

微切變-助劑互作技術是機械化學領域的一項新應用，是利用高強度研磨產生的機械化學效應[4]，將固體原材料與各種類型的化學助劑共同研磨，選用水提取有效成分的一項技術。它在植物提取中應用很廣泛[5-7]。Korolev等[8]采用AGO-2型高能行星磨，將西伯利亞冷杉松針與Na2CO3共研磨，用水提取三萜酸，提取率比常規(guī)法提高了35.9%；Lomovsky等[9]將偽泥胡菜與蔗糖共研磨，發(fā)現(xiàn)可顯著提高偽泥胡菜中植物蛻皮類固醇在水中的溶出率，比常規(guī)法提高了103.7%。有研究表明，高強度研磨在破碎植物細胞的同時還能促進暴露出的有效成分與助劑接觸、反應，改變活性成分的溶解性[5-6，10-11]。該研究采用微切變-助劑互作技術處理鹿角盤，制備鹿角盤微切助粉，通過與常規(guī)的中藥粉碎技術相比，考察該技術對鹿角盤顆粒粒徑、形態(tài)的影響并檢測其中活性成分的含量，包括性激素、胰島素樣生長因子-1、有機酸鈣和鈣等，以期為闡明鹿角盤防治骨質疏松癥提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。梅花鹿鹿角盤(CervusnipponTemminck)由吉林鹿業(yè)生物制品有限公司提供(長春，中國)。

1.1.3儀器。超純水儀(Synthesis A10，美國Millipore公司)，中藥粉碎機(WK-800A，上海新諾儀器有限公司)，高能振動研磨機[WZJ(BFM)-6J，山東濟南倍力粉技術工程有限公司]，低溫冷凍離心機(5804R，德國Eppendorf公司)，高壓蒸氣滅菌鍋(SS-325，日本TOMY公司)，原子吸收分光光度計(UNICAM 969，美國熱電公司)，離子濺射儀(E-1045型，日本日立高新技術有限公司)，聚焦光束反射分析儀(m600，美國Laser-Tech公司)，掃描電子顯微鏡(JEM-1200EX，日本電子株式會社)，激光粒度儀(LS100Q，美國Beckman Coulter公司)，HPLC高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國Agilent公司)，pH計(PB-10型，德國賽多利斯sartorious公司)，電子天平(FA1604s型，上海天平儀器廠)，標準網(wǎng)孔篩(2.360～0.037 mm，新鄉(xiāng)市康達新機械有限公司)。

1.2方法

1.2.1鹿角盤微切助粉的制備。將干燥的鹿角盤制成小塊投入到中藥粉碎機中，粉碎5 min，過0.25 mm標準網(wǎng)孔篩，獲得鹿角盤粗粉，備用。參照前人的研究[5-7]，使用可食用的糖類、無機鹽、小分子有機物和有機酸作為助劑進行篩選和優(yōu)化，最終確定復合助劑組成、比例及添加的劑量(助劑配方保密)。利用微切變-助劑互作技術將鹿角盤粗粉進一步加工成鹿角盤微切助粉。具體操作如下：將制備的鹿角盤粗粉與3.0%(w/w)復合助劑混合后添加到高能振動研磨機(容積為1.2 L，鋼棒長174 mm、直徑18 mm)中，在冷卻循環(huán)水溫20 ℃、頻率16 Hz、鋼棒加速度9 g(g=9.8 m/s2)和總消耗功率0.75 kW條件下研磨40 min，獲得鹿角盤微切助粉(D95≤44 μm)，備用。

1.2.2顆粒粒徑檢測。稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各3 g，分別加入裝有50%乙醇溶液的200 mL專用量杯中，置入聚焦光束反射分析儀(FBRM)探頭，以500 r/min攪拌速率攪拌，使樣品在溶液中均勻分散。FBRM配套軟件自動記錄粒徑分布，測量1～500 μm范圍內的顆粒粒徑總數(shù)及各粒徑區(qū)間的分布[12-15]。

1.2.3掃描電鏡觀察。稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各5 mg，分別加入1 mL 50%乙醇溶液中，超聲勻化成懸濁液。將潔凈的鋁箔片粘附在樣品臺上，將上述懸濁液滴于潔凈鋁箔片上，在紅外燈下烘干液體后，置于離子濺射儀的樣品艙中，在15 mA電流下噴金90 s。樣品取出后，裝入掃描電鏡(SEM)觀察室，進行鹿角盤粗粉和微切助粉的形態(tài)觀察。放大倍數(shù)為400倍，加速電壓均為10 kV[16-17]。

1.2.4性激素含量的測定。稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各5 g，分別加入100 mL 80%甲醇溶液，200 r/min震蕩混勻，回流提取3 h。之后在4 ℃、3 000 r/min條件下離心20 min，取上清液；45 ℃下減壓蒸餾濃縮至50 mL，得待測樣品。然后用放射免疫試劑盒分別檢測鹿角盤中雌二醇、孕酮和睪酮的含量，對數(shù)轉換法計算測定結果。

1.2.5類胰島素樣生長因子-1含量的測定。

1.2.5.1乙醇提取。稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各5 g，分別加入100 mL 65%乙醇溶液中浸泡震蕩3 h，旋轉攪拌；4 ℃、6 000 r/min條件下離心20 min，取上清；45 ℃下減壓蒸餾濃縮至50 mL，得待測樣品，用IGF-1 ELISA試劑盒檢測[18-19]。1.2.5.2堿溶液提取。稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各5 g，按質量比加入8～10倍的pH 8～10堿性溶液作提取劑，堿性溶液為0.2 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，提取溫度為20～25 ℃，浸泡振蕩3 h；4 ℃、6 000 r/min條件下離心15 min，取上清，得待測樣品，用IGF-1 ELISA試劑盒檢測[19-20]。

第二，藍墨云班課是一款由藍墨科技推出的移動教學App，主要由任課教師組織資源，實現(xiàn)混合教學，最大的缺陷是沒有標準的職業(yè)教育資源庫支持。

1.2.6有機酸鈣含量的測定。目前國內外普遍采用高效液相色譜(HPLC)法測定有機酸[21-22]。因此，該研究采用HPLC法測定鹿角盤中有機酸鈣(檸檬酸鈣和延胡索酸鈣)的含量。具體操作如下：稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各0.25 g，分別加入到2.5 mL HCl(1 mol/L)溶液中混勻，37 ℃放置30 min，冷卻、過濾，用流動相淋洗并定容至25 mL，用0.22 μm 濾膜過濾，得樣品溶液。然后根據(jù)有機酸標準溶液，使用高效液相色譜儀檢測樣品中有機酸鈣的含量。色譜條件：色譜柱Century SIL C18-Eps(5 μm，250 mm × 4.6 mm)，流速0.8 mL/min，進樣體積10 μL，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，流動相為10 mmol/L KH2PO4(用H3PO4將pH調至2.7)與CH3OH混合溶液(V/V=95∶5)。標準曲線和檢出限：以峰面積Y與質量濃度X(mg/L)求得線性回歸方程，檢出限以3倍信噪比(S/N)計算最小檢出限量(表1)。

表1　有機酸的回歸分析和檢出限

1.2.7鈣含量的測定?；鹧嬖游展庾V法是檢測鈣含量的常用方法，且具有靈敏度高、重復性好的特點[23-24]。該研究采用火焰原子吸收光譜法測定鹿角盤中鈣的含量。具體操作如下：稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各1 g，分別溶于1 000 mL超純水，37 ℃攪拌混勻，過濾，得樣品溶液；再稱取鹿角盤粗粉和微切助粉各1 g，分別溶于1 000 mL HCl溶液(pH 3和pH 1)中，37 ℃攪拌1 h，過濾，得樣品溶液。然后用不同濃度梯度的鈣標準溶液(l g/mL)繪制標準曲線。按如下檢測條件(燈電流15 mA，狹縫寬度0.5 nm，波長422.7 nm，測定方式為吸收法，火焰為Air-C2H2，氣流流速1.1 L/min，穩(wěn)定時間4.0 s，重復次數(shù)3)測定原子吸收光譜，計算直線回歸方程和相關系數(shù)分別為：超純水組，Y=0.025 30X-0.049(r=0.999 9)；pH 3的HCl組，Y=0.018 52X+0.047(r=0.996 8)；pH 1的HCl組，Y=0.027 67X-0.034(r=0.999 9)。

2　結果與分析

2.1鹿角盤粉末的顆粒粒徑分布從圖1可看出，鹿角盤粗粉和微切助粉的粒徑分布曲線均是單峰，弦長分布較為單一，說明鹿角盤顆粒多數(shù)是球型或近球型。根據(jù)FBRM測定粒徑的原理可知，由FBRM測定出的顆粒弦長分布在很大程度上體現(xiàn)出鹿角盤顆粒的粒徑分布，因此該研究中FBRM測出的弦長分布直接表述為粒徑分布。

圖1　不同處理技術制備的鹿角盤粗粉(a)和微切助粉(b)的粒徑分布Fig.1　Particle size distribution of deer antler base crude powder(a)and PAI powder(b)processed by different pretreatments

此外，F(xiàn)BRM測量的一個特點是在等體積溶液中，弦長次數(shù)累計在一定程度上體現(xiàn)了顆粒濃度的大小[15]。由圖1可知，粒徑在1～30 μm范圍內，鹿角盤微切助粉的顆粒弦長次數(shù)為350～400，而鹿角盤粗粉則為250～300。鹿角盤粒徑分布比例結果(表2)也顯示，鹿角盤粗粉粒徑在1～30 μm范圍內的顆粒數(shù)占80.96%，經(jīng)過進一步的微切變-助劑互作技術處理后，鹿角盤微切助粉顆粒數(shù)占82.73%，說明微切變-助劑互作技術有助于提高鹿角盤粉末顆粒在1～30 μm粒徑范圍內的產率。由于動物細胞大小一般為25～35 μm，因此，經(jīng)微切變-助劑互作技術處理后，鹿角盤微切助粉中的細胞基本被破碎，這有利于鹿角盤中活性物質充分的釋放。

表2　不同處理技術制備的鹿角盤粉末的粒徑分布

2.2鹿角盤粉末的顆粒形態(tài)與普通光學顯微鏡相比，掃描電子顯微鏡具有更高的放大倍數(shù)和分辨率。為了清晰地展示不同處理技術制備的鹿角盤粉末在超微形貌上的特征，該研究針對鹿角盤粗粉和鹿角盤微切助粉2種鹿角盤粉末顆粒，給出了400倍放大倍數(shù)下的掃描電鏡照片。由圖2可見，在掃描電鏡下已觀察不到完整的細胞，該結果與鹿角盤顆粒粒徑分布的檢測結果(圖1和表2)相一致，再次證明經(jīng)過微切變-助劑互作技術處理后，鹿角盤微切助粉中的細胞基本被破碎，細胞內的有效成分被暴露出來，呈釋放的狀態(tài)，且增加了目標活性物質的溶出量。

2.3鹿角盤粉末中性激素含量由表3可知，鹿角盤中除了含有豐富的雌二醇外，還含有睪酮和孕酮，且鹿角盤微切助粉中雌二醇(P<0.01)、睪酮(P<0.05)和孕酮(P<0.01)的含量分別是其粗粉中雌二醇、睪酮和孕酮含量的130.34%、120.86%和159.20%。表明微切變-助劑互作技術有利于鹿角盤中性激素的釋放，提高了性激素的溶出量。

表3　不同處理技術制備的鹿角盤粉末中性激素的含量

注：*、**分別表示與鹿角盤粗粉組比，微切助粉組差異顯著(P<0.05)、差異極顯著(P<0.01)。

Note：* and ** indicated significant differences(P<0.05)and extremely significant differences(P<0.01)between deer antler base crude powder and PAI powder，respectively.

2.4鹿角盤粉末中類胰島素樣生長因子-1含量采用甲醇和堿性緩沖液2種方法提取鹿角盤中胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，結果表明，鹿角盤中含有大量的IGF-1，且堿性緩沖液比甲醇溶液更有利于IGF-1的溶出。由表4可知，無論是采用甲醇溶液還是堿性緩沖液提取，鹿角盤微切助粉中IGF-1的含量均明顯高于其粗粉中IGF-1的含量(P<0.01)，說明微切變-助劑互作技術提高了鹿角盤中IGF-1的溶出量。

2.5鹿角盤粉末中有機酸鈣和鈣含量通過與檸檬酸和延胡索酸的標準品對比可知，鹿角盤中含有大量的檸檬酸鈣，而沒有延胡索酸鈣(圖3)。由表5可知，鹿角盤微切助粉中檸檬酸鈣的含量和鈣的溶出量均大于其粗粉，表明微切變-助劑互作技術不僅有利于鹿角盤中檸檬酸鈣的溶出，還提高了總鈣的溶出量。用HCl溶液(pH 1和pH 3)制備的鹿角盤提取物中鈣的含量分別為(133.61 ± 3.55)和(17.26±1.34)mg/L，分別是其水提物(pH 7)中鈣含量的51.79和6.69倍，表明低pH條件可顯著提高鈣的溶出量，更利于鈣的釋放。

表4不同處理技術制備的鹿角盤粉末中IGF-1的含量

Table 4Contents of IGF-1 in deer antler base powder processed by different pretreatments

μg/g

注：**表示與鹿角盤粗粉組比，微切助粉組差異極顯著(P<0.01)。

Note： ** indicated extremely significant differences(P<0.01)between deer antler base crude powder and PAI powder.

注：1代表檸檬酸；2代表延胡索酸。Note：1 was citric acid; and 2 was fumaric acid.圖3　不同處理技術制備的鹿角盤粗粉(a)、微切助粉(b)及標準品(c)的色譜圖Fig.3　HPLC chromatogram of standards and deer antler base crude powder(a)and PAI powder(b)processed by different pretreatments

樣品Sample檸檬酸鈣CalciumcitrateCa超純水Ultrapurewater(pH7)HCl溶液HClsolution(pH3)HCl溶液HClsolution(pH1)鹿角盤粗粉Deerantlerbasecrudepowder103.85±0.482.10±0.3716.44±0.95126.95±2.03鹿角盤微切助粉DeerantlerbasePAIpow-der161.72±0.52*2.58±0.6517.26±1.34133.61±3.55

注：*表示與鹿角盤粗粉組比，微切助粉組差異顯著(P<0.05)。

Note：* indicated significant differences(P<0.05)between deer antler base crude powder and PAI powder.

3　結論

(1)粒徑分析及掃描電鏡觀察結果顯示，經(jīng)微切變-助劑互作技術處理后，鹿角盤微切助粉在粒徑1～30 μm范圍內的顆粒數(shù)占82.73%，且鹿角盤微切助粉中的細胞已被充分破碎，細胞內有效成分被暴露出來，呈釋放的狀態(tài)。

(2)多種活性成分含量分析結果顯示，鹿角盤微切助粉中含有(328.79±34.21)pmol/L雌二醇、(25.38±4.48)nmol/L睪酮、(17.56±3.45)nmol/L孕酮、(0.750±0.033)μg/g類胰島素樣生長因子-1、(161.72±0.52)mg/L檸檬酸鈣和(133.61±3.55)mg/L鈣，而不含有延胡索酸鈣。

(3)鹿角盤微切助粉中含有豐富的性激素、類胰島素生長因子-1、檸檬酸鈣和鈣，且這些活性物質的含量均高于其粗粉，說明微切變-助劑互作技術增加了目標活性物質的溶出量，有利于鹿角盤中活性成分的釋放，體現(xiàn)了該技術的優(yōu)越性。

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Detection of Active Ingredients in Deer Antler Base Powder Processed by Press-shear Assisted Interaction Technology

WU Fei-fei1,2,3, XU Yong-ping2,3, ZHAO Liang-zhong1, LI Hua-qiang1,2,3*et al

(1. Department of Biology and Chemistry Engineering, Shaoyang University, Shaoyang, Hunan 422000; 2. School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian, Liaoning 116024; 3. Postdoctoral Research Stations of Dalian SEM Bio-Engineering Technology Co., Ltd., Dalian, Liaoning 116620)

[Objective] To detect the active ingredients content which related to osteoporosis in deer antler base PAI powder processed by press-shear assisted interaction technology (PAI). [Method]We first used press-shear assisted interaction technology and traditional Chinese medicine grinding technology to process deer antler base. Effects on particle sizes, micrographs and active ingredients content by different pretreatments were also investigated. [Result] Particle number of deer antler base PAI powder ranged in 1-30 μm accounted for 82.73%. Cells were broken and the active ingredients were released. Deer antler base PAI powder contained many sex hormone (including estradiol, testosterone, progesterone), IGF-1, calcium citrate and calcium, and the content of several active ingredients in deer antler base PAI powder were superior to its coarse powder. Above results indicated that press-shear assisted interaction technology was beneficial to the release of the active ingredients. [Conclusion] This research could provide a new grinding technology to promote the rational development and utilization of deer antler base, and supply a scientific basis for deer antler base applied for prevention and treatment of osteoporosis.

Deer antler base; Press-shear assisted interaction technology (PAI); PAI powder; Active ingredients

國家科技部863計劃項目(2013AA102805-03)；湖南省科技廳重點項目(2015CK3031)。

吳菲菲(1982- )，女，遼寧錦州人，講師，博士，從事天然產物提取及藥理功能研究。*通訊作者，講師，博士，碩士生導師，從事食品生物技術研究。

2016-05-13

R 282.74

A

0517-6611(2016)20-138-05