竇　霞，靳子明，甄小龍（1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省中藥炮制及質(zhì)控工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730020）

通痹化濕顆粒質(zhì)量標準研究

竇霞1，2，靳子明1，2，甄小龍2*
（1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省中藥炮制及質(zhì)控工程技術研究中心，甘肅 蘭州 730020）

目的 建立通痹化濕顆粒質(zhì)量標準。方法 采用薄層色譜法對制劑中青風藤、雞血藤、千年健及威靈仙進行定性鑒別；采用高效液相色譜法對處方中青風藤所含青藤堿的含量進行測定。Waters XTerra RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，以1%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0）（58∶42）作為流動相；檢測波長為262 nm。結(jié)果 建立了青風藤、雞血藤、千年健及威靈仙具有專屬性的定性鑒別方法；青藤堿含量測定加樣回收率為95.69%，RSD為0.79%。結(jié)論 本方法簡便可靠，重復性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

通痹化濕顆粒；質(zhì)量標準；定性鑒別；青藤堿；含量測定

通痹化濕顆粒是我院風濕科專家經(jīng)驗方，由青風藤、雞血藤、秦艽、絡石藤、千年健、威靈仙等8味藥組成，具有通經(jīng)活絡，蠲痹止痛，祛風化濕的功效。主要用于治療急性痛風性關節(jié)炎、類風濕關節(jié)炎及其他風濕性關節(jié)炎證屬肝腎不足、風濕阻絡證。本方經(jīng)醫(yī)院臨床多年使用，療效確切，故將其開發(fā)為院內(nèi)制劑。為了提高院內(nèi)制劑質(zhì)量的可控性，分別研究制定方中四味藥材的薄層鑒別和一個含量測定項，用以控制本品的質(zhì)量。現(xiàn)將其質(zhì)量標準研究方法報告如下。

1　儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀；MWD型紫外可見檢測器；Waters XTerra RP18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：0774-201206，供含量測定用）；甲醇：色譜純（美國天地公司）；其余試劑均為分析純；通痹化濕顆粒，甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院自制（批號：111010）。

2　方法與結(jié)果

2.1通痹化濕顆粒薄層色譜鑒別

2.1.1青風藤薄層色譜鑒別［1，2］取本品4 g，研細，加70%乙醇30 ml，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 ml溶解，作為供試品溶液。再取青風藤陰性對照樣品，同法制成陰性對照液。另取青藤堿對照品適量，加乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試品溶液及對照品溶液各5μl，分別點于同一含有2%氫氧化鈉的硅膠GF254薄層板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲醇-水（2∶4∶3∶1）10℃以下放置的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢識。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的熒光斑點。

2.1.2雞血藤薄層色譜鑒別［3］取本品1袋，研細，加乙醚30 ml冷浸30分鐘，時時振搖，傾出乙醚后，殘渣加85%乙醇50 ml超聲（250 w，40 kHz）處理20分鐘，濾過，濾液蒸干后加水20 ml溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用乙酸乙酯40 ml提取，回收乙酸乙酯，殘渣加乙醇0.5 ml使其溶解，作為供試品溶液。另取雞血藤對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（9∶4）為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外光燈（365 nm）下檢識。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.1.3千年健薄層色譜鑒別 取本品1袋，加水50 ml加熱回流提取30分鐘，放冷，過濾，濾液加乙醚30 ml萃取2次，每次30 ml，取乙醚液蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至1 ml，作為供試品溶液。另取千年健對照藥材1 g，加水30 ml，加熱回流提取1小時，濾過，取濾液10 ml，乙醚萃取3次，每次10 ml，蒸干乙醚，殘渣加甲醇溶解并定容至1 ml，作為對照藥材溶液。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，熱風吹至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。

2.1.4威靈仙薄層色譜鑒別［4］取本品1袋，加水20 ml超聲（250 w，40 kHz）處理30分鐘，過濾，加二氯甲烷萃取3次，每次30 ml，合并萃取液，濃縮至干，用二氯甲烷1 ml溶解殘渣，作為供試品溶液。另取威靈仙對照藥材1 g，加少量水潤濕30分鐘，加入正丁醇50 ml回流提取3次，每次3小時，過濾，濾液合并，回收正丁醇，加二氯甲烷1 ml溶解殘渣，制成對照藥材溶液。按薄層色譜法（中國藥典2005年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述供試品溶液、對照藥材溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-乙醚（7∶3）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢識。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.2通痹化濕顆粒中青藤堿含量測定［1，5，6］

2.2.1色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠作為填充劑；甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，以1%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0）（58∶42）作為流動相；檢測波長為262 nm。理論板數(shù)按青藤堿峰計算，應不低于5 000。

2.2.2溶液的制備（1）對照品溶液的制備：取青藤堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含136 μg的溶液，即得。

（2）供試品溶液的制備：取裝量差異項下本品，研細，取約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲（250 W，40 kHz）處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）陰性對照品溶液制備：取陰性樣品（缺青風藤），按供試品溶液制備方法制備陰性供試品溶液。

2.2.3系統(tǒng)適用性研究 在上述條件下，分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各5μl，注入高效液相色譜儀，結(jié)果表明，陰性供試品對青藤堿峰無干擾（見圖1）。青藤堿峰理論塔板數(shù)大于5 000，分離度大于1.5，已達到基線分離，拖尾因子符合要求。為確保定量分析的準確性，在系統(tǒng)實驗中青藤堿的理論板數(shù)不得低于5 000。

A.對照品溶液　B.供試品溶液　C.陰性供試品溶液圖1　各溶液高效液相色譜圖

2.2.4線性關系考察 精密稱取青藤堿對照品13.70 mg，置20 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為685 μg/ml的標準品儲備液。分別精密吸取上述溶液0.5 ml，1.0 ml，2.0 ml，4.0 ml，10 ml置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。分別進樣5 μl，以進樣濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。結(jié)果表明青藤堿在34.25 μg/ml～685 μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關系，回歸方程為Y=4.859 2X+4.449 1，r=1.000 0。

2.2.5精密度試驗 精密吸取對照品（137μg/ml）溶液5 μl，重復進樣6次，測得峰面積積分值，計算RSD=0.80%。

2.2.6穩(wěn)定性試驗 取本品按正文含量測定項下的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液5μl，分別于第0、1、2、4、8、12小時進樣一次，共進樣6次，測得峰面積積分值，計算RSD=0.38%。結(jié)果表明青藤堿峰面積在12小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復性試驗 取本品研細，取6份，每份取約2 g，精密稱定，按正文含量測定項下的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 μl進行測定，計算含量。結(jié)果表明該法測定青藤堿含量重復性良好，青藤堿平均含量為1.70 mg/g，RSD=0.48%。

2.2.8加樣回收率試驗 取本品研細，分6份，每份約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶內(nèi)，精密加入851 μg/ml的青藤堿對照品溶液2 ml，揮干溶劑后，再精密加入甲醇25 ml，以下按正文含量測定項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進行含量測定，并計算回收率。結(jié)果表明回收率符合要求（95%～105%），該方法回收率良好（結(jié)果見表1）。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.9樣品含量測定 取本品3批（批號141010、141101、150103）制劑樣品，按正文含量測定項下供試品溶液制備方法制備供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各5 μl，注入高效液相色譜儀，測定，計算，結(jié)果見表2。

3　討論

（1）方中青風藤為君藥，故對青風藤中的主要有效成分青藤堿做了含量測定，參考藥典方法［1］，對色譜條件做了系統(tǒng)考察，結(jié)果表明甲醇-磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L的磷酸二氫鈉溶液，以1%三乙胺調(diào)節(jié)pH值至9.0）（58∶42）系統(tǒng)作為流動相可使供試品色譜中青藤堿峰與其他峰能夠達到很好的分離，且陰性樣品無干擾。又對供試品提取溶劑、提取時間及溶劑用量做了考察。通過對提取效率、供試品溶液的顏色、色譜圖的雜質(zhì)及操作過程是否方便等因素的全面考察，確定了供試品溶液的制備方法。

（2）本質(zhì)量標準制定中，參考藥典方法對制劑中所有藥材進行薄層鑒別研究，但因藥味較多，部分藥材鑒別有陰性干擾，藥典方法多不適用，在此基礎上通過多次試驗摸索，最終確定了青風藤、雞血藤、千年健及威靈仙的最佳薄層鑒別方法，均無陰性干擾，專屬性較強，故列入本品質(zhì)量標準。

（3）本項目研究中，對常規(guī)檢查項目按照藥典標準一一做了研究并制定標準。重點研究處方中各藥的定性鑒別和有效成分的含量測定，對處方中一半的藥物做了定性質(zhì)量控制，并引入高效液相色譜法控制制劑的含量，這在院內(nèi)制劑研發(fā)中，其質(zhì)量標準屬于領先水平。

表2　樣品中青藤堿的含量測定結(jié)果

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

［2］陳勇，鄧家剛，王勤，等.抗痛風顆粒中青風藤TLC鑒別與青藤堿的含量測定［J］.中國實驗方劑學雜志，2007，13（6）：11-13.

［3］韋娟.雞血藤薄層鑒別方法改進［J］.中國現(xiàn)代藥物應用，2009，3（7）：170.

［4］鐘保恒.威靈仙藥材薄層色譜鑒別方法的改進［J］.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2009，12（9）：30-31.

［5］李道中.青藤堿凝膠的制備及凝膠中青藤堿的含量測定［J］.安徽醫(yī)藥，2010（7）：766-767.

［6］張紅，侯敏，段勇民，等.HPLC法測定秦息痛片中青藤堿的含量［J］.西北藥學雜志，2011（2）：106-107.

（*通訊作者：甄小龍）

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1671-1246（2016）15-0099-03