莊錫偉，黎志全（佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院，廣東528031）

精子DNA損傷與頂體酶活性及精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性分析*

莊錫偉，黎志全（佛山市禪城區(qū)中心醫(yī)院，廣東528031）

目的探討精子DNA損傷與頂體酶活性及精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性。方法收集2013年1月至2015年4月在該院就診的291例男性不育患者的精液，分析精子形態(tài)、密度、活動(dòng)率及精液常規(guī)。采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法檢測(cè)精子DNA損傷，分析其與頂體酶及精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果精子DNA碎片指數(shù)與患者年齡、精液體積及精液液化時(shí)間無關(guān)，而與頂體酶活性及A+B級(jí)精子百分率呈負(fù)相關(guān)［相關(guān)系數(shù)（r）=-0.352、-0.305，P＜0.01］，與精子頭部畸形及D級(jí)精子百分率呈正相關(guān)（r=0.157、0.284，P＜0.01）。結(jié)論精子質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)可以包括獨(dú)立的精子DNA損傷，也可以結(jié)合其他精子評(píng)價(jià)指標(biāo)，為男性不育的輔助生殖技術(shù)及診斷提供理論依據(jù)。

DNA；精液/化學(xué)；頂體蛋白酶；精子計(jì)數(shù)；精子能動(dòng)性；精子頭；不育，男（雄）性；精子DNA碎片指數(shù)

多種疾病或多種因素均會(huì)造成男性不育。世界衛(wèi)生組織將男性不育病因分為性交或射精障礙、輸精管梗阻、精索靜脈曲張、免疫性不育、內(nèi)分泌異常、生殖道感染、染色體異常等［1］。有報(bào)道稱，精子DNA損傷會(huì)引起體外受精中的精子受精能力和胚胎發(fā)育潛能下降，導(dǎo)致臨床妊娠率降低和流產(chǎn)率增高［2］。因此，精子DNA損傷被認(rèn)為是一項(xiàng)新的評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的檢測(cè)指標(biāo)［3］。有研究顯示，男性年齡［4］、吸煙［5-6］、精索靜脈曲張［7-9］、胰島素依賴型糖尿病及體質(zhì)量指數(shù)與精子DNA損傷呈正相關(guān)［10-11］。本研究擬采用精子染色質(zhì)擴(kuò)散法檢測(cè)精子DNA損傷，分析其與頂體酶及精液常規(guī)參數(shù)的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象選取2013年1月至2015年4月就診于本院的291例男性不育患者作為研究對(duì)象，平均年齡（34.2±6.5）歲。所有入選對(duì)象具有完整的按照世界衛(wèi)生組織精液分析手冊(cè)中精液分析項(xiàng)目（包括精子形態(tài)、活動(dòng)率、密度、活力等）檢測(cè)結(jié)果，精子DNA損傷采用第1次檢測(cè)結(jié)果。

1.2方法

1.2.1精液檢查患者禁欲3～7 d，手淫方法取精。采用嚴(yán)格形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精子形態(tài)分析。采用WLJY-9000型精子分析系統(tǒng)（北京偉力公司）檢測(cè)精子活動(dòng)率［A級(jí)精子曲線速率（curvilinearvelocity，VCL）≥35 μm/s，B級(jí)精子VCL 15～＜35 μm/s，C級(jí)精子VCL 10～＜15 μm/s，D級(jí)精子VCL＜10 μm/s］。按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第5版［1］進(jìn)行精液常規(guī)檢查，分別測(cè)定精子密度、pH值、精液體積等。

1.2.2精子DNA損傷檢測(cè)采用精子Halosperm試劑盒（西班牙Halotech公司）檢測(cè)精子DNA損傷，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。其原理是將精子懸液與低熔點(diǎn)瓊脂糖混合并鋪于載玻片上，經(jīng)過酸處理去除核蛋白，保留精子DNA部分，然后進(jìn)行瑞-吉染色。正常精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，DNA環(huán)附著于殘留的精子核，瑞-吉染色形成特征性暈環(huán)；DNA損傷的精子則不產(chǎn)生或產(chǎn)生很小的暈環(huán)。根據(jù)暈環(huán)有無及大小判斷精子DNA是否有碎片，評(píng)估精子DNA完整性，根據(jù)光暈與精子頭部橫徑比例，以精子頭直徑小于或等于1/4為小光暈作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算精子DNA碎片指數(shù)（DNA fragmentationindex，DFI），即小光暈和無光暈精子占計(jì)數(shù)精子總數(shù)的百分率。按DFI大小分為四組，即DFI＜10%、10%～20%、＞20%～30%、＞30%。

1.2.3頂體酶活性測(cè)定采用深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司頂體酶試劑盒，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。精子頂體酶包括約50多種水解酶，其中精氨酸酰胺酶活性可反映頂體酶全部活性，采用改良Kennedy法檢測(cè)。精子頂體酶活性的參考區(qū)間為48.2～218.7 μU/106精子。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，各組均數(shù)比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Dunnert法；采用兩變量相關(guān)性分析比較DFI與其他指標(biāo)的相關(guān)性，組間各指標(biāo)異常率比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1不同DFI組患者精子頂體酶活性比較291例患者中，精子DFI＜10%102例（35.1%），10%～20%95例（32.6%）、＞20%～30%51例（17.5%）、＞30%43例（14.8%），各組患者精子頂體酶活性［分別為（132.4±27.6）、（99.1±20.5）、（74.4±30.1）、（51.7±44.2）μU/106］比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著DFI的增加，精子頂體酶活性降低。

2.2不同DFI組患者精液常規(guī)參數(shù)比較不同DFI組患者年齡、精液體積及精液液化時(shí)間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但不同DFI組患者A+B級(jí)精子百分率、D級(jí)精子百分率及精子頭部畸形百分率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　不同精子DFI組患者精液常規(guī)參數(shù)比較（±s）

表1　不同精子DFI組患者精液常規(guī)參數(shù)比較（±s）

注：與DFI＜10%比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與DFI 10%～20%比較，cP＜0.05，dP＜0.01。

項(xiàng)目DFI ＜10%　10%～20%?。?0%～30%?。?0% （n=102）?。╪=95）　（n=51）?。╪=43）年齡（歲）精液體積（mL）精液液化時(shí)間（min）A+B級(jí)精子百分率（%）D級(jí)精子百分率（%）精子頭部畸形百分率（%）33.7±4.3 2.5±1.3 24.3±2.2 65.6±14.8 24.1±7.0 75.4±7.5 35.4±5.1 2.7±1.2 22.3±3.1 58.3±17.6 23.9±8.4 79.7±5.6 34.5±4.4 2.4±1.7 25.3±5.5 42.5±11.5ac45.4±13.7ac84.8±9.5a35.7±3.9 2.7±1.1 22.3±4.8 30.7±18.8bd59.8±18.5bd89.7±7.4ac

2.3DFI與頂體酶活性及精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性A+ B級(jí)精子百分率及頂體酶活性與DFI呈負(fù)相關(guān)［相關(guān)系數(shù)（r）=-0.305、-0.352，P＜0.01］；D級(jí)精子及精子頭部畸形百分率與DFI呈正相關(guān)（r=0.284、0.157，P＜0.01）。見表2。

表2　DFI與頂體酶活性及精液常規(guī)參數(shù)的相關(guān)性

3　討　論

男性因素引起的不育接近50%，導(dǎo)致男性不育的因素較多，其中因精液異常導(dǎo)致不孕較為常見，因而評(píng)估男性生育能力的重要標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)精液質(zhì)量進(jìn)行分析。但在臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢查方面，許多缺陷仍然存在。當(dāng)前主要是采用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)精子存活率、活動(dòng)力和形態(tài)、密度等評(píng)價(jià)精液質(zhì)量，這些精液常規(guī)檢查結(jié)果存在較大誤差，重復(fù)性、可靠性差，因此尚無法準(zhǔn)確、全面評(píng)估男性生育能力及精液質(zhì)量。

精子頂體酶為特化溶解酶，包括50多種水解酶，其活性高低與精子對(duì)卵細(xì)胞的穿透能力相關(guān)，因而目前將精子頂體酶活性測(cè)定作為精子質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。影響頂體酶活性的因素較多，有先天性因素，如先天性小頭精子等，而臨床上更多見的是后天因素，如精子密度、精子活力、精子畸形率、生殖道各種原因感染、精液酸堿度（pH）、精子活率、精液液化狀態(tài)、精液中白細(xì)胞數(shù)等均與精子頂體酶活性有關(guān)［12］。

本研究結(jié)果證實(shí)，精子頂體酶活性與DFI呈負(fù)相關(guān)，即精子頂體酶活性與精子DNA損傷程度呈反比。通常將精子頂體酶活性下降30%以上作為精子DNA損傷的正常臨界值。本研究結(jié)果顯示，精子DNA損傷大于30%時(shí)，精子頂體酶活性明顯下降，D級(jí)精子百分率明顯升高，而A+B級(jí)精子百分率明顯降低，同時(shí)精子頭部畸形百分率上升顯著。上述精子形態(tài)學(xué)及頂體酶活性與DFI相關(guān)的結(jié)果表明，精子質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)可以包括獨(dú)立的精子DNA損傷，也可以結(jié)合其他精子評(píng)價(jià)指標(biāo)，為男性不育的輔助生殖技術(shù)及診斷提供了理論依據(jù)。然而，精子DNA損傷對(duì)精子頂體酶活性產(chǎn)生影響的原因目前尚不清楚，有待于進(jìn)一步的研究揭示其調(diào)控通路及作用機(jī)制。

［1］世界衛(wèi)生組織.世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)［M］. 5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：5-20.

［2］ Komiya A，Watanabe A，Kawauchi Y，et al.Sperm with large nuclear vacuoles and semen quality in the evaluation of male infertility［J］.Syst Biol Reprod Med，2013，59（1）：13-20.

［3］Pons I，Cercas R，Villas C，et al.One abstinence day decreases sperm DNA fragmentation in 90%of selected patients［J］.J Assist Reprod Genet，2013，30（9）：1211-1218.

［4］Wyrobek AJ，Eskenazi B，Young S，et al.Advancing age has differential effects on DNA damage，chromatin integrity，gene mutations，and aneuploidies in sperm［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（25）：9601-9606.

［5］Maettner R，Sterzik K，Isachenko V，et al.Quality of human spermatozoa：relationship between high-magnification sperm morphology and DNA in tegrity［J］.Andrologia，2014，46（5）：547-555.

［6］Viloria T，Garrido N，F(xiàn)ernández JL，et al.Sperm selection by swim-up in terms of deoxyribonucleic acid fragmentation as measured by the spermchromatin dispersion test is altered in heavy smokers［J］.Fertil Steril，2007，88（2）：523-525.

［7］Saleh RA，Agarwal A，Sharma RK，et al.Evaluation of nuclear DNA damage in spermaozoa from infertile men with varicocele［J］.Fertil Steril，2003，80（6）：1431-1436.

［8］Chen CH，Lee SS，Chen DC，et al.Apoptosis and kinematics of ejaculated spermatozoa in patients with varicocele［J］.J Androl，2004，25（3）：348-353.

［9］Enciso M，Muriel L，F(xiàn)ernández JL，et al.Infertile men with varicocele show a high relative proportion of sperm cells withintense nuclear damage level，evidenced by the sperm chromatin dispersion test［J］.J Androl，2006，27（1）：106-111.

［10］Agbaje IM，Rogers DA，McVicar CM，et al.Insulin dependant diabetes mellitus：implications for male reproductive function［J］.Hum Reprod，2007，22（7）：1871-1877.

［11］Kort HI，Massey JB，Elsner CW，et al.Impact of body mass index values on sperm quantity and quality［J］.J Androl，2006，27（3）：450-452.

［12］陳可，包華瓊，丁杰，等.精子頂體酶活性與精液常規(guī)檢查參數(shù)關(guān)系分析［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（14）：8-10.

Analysis of correlation between sperm DNA damage with acrosin activity and semen parameters*

Zhuang Xiwei，Li Zhiquan（Chancheng District Central Hospital，F(xiàn)oshan，Guangdong 528031，China）

ObjectiveTo investigate the correlation between DNA damage in sperm with acrosin activity and routine semen parameters.MethodsSemen was collected from 291 male infertility patients in our hospital from January 2013 to April 2015.Semen morphology，density，vitality and semen routine were analyzed.Sperm DNA damage was detected by using sperm chromatin dispersion（SCD）method.The correlation between DNA damage with acrosin activity and semen routine parameters was analyzed.ResultsThe sperm DNA fragmentation index（DFI）had no relation with the age，semen volume and semen liquefaction time，while had a negative correlation with the crosin activity and the percentage of level A plus level B sperm（r=-0.352，-0.305，P＜0.01），and a positive correlation with sperm head deformity and the percentage of level D sperm（r=0.157，0.284，P＜0.01）.ConclusionSperm DNA damage can include the independent sperm DNA damage and also can combining with other semen evaluation indicators，which provides the theoretical basis for diagnosis of male infertility and assisted reproductive technology（ART）.

DNA；Semen/chemistry；Acrosin；Sperm count；Sperm motility；Sperm head；Infertility，male；Sperm DNA fragmentation index

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.01.005

A

1009-5519（2016）01-0014-02

廣東省佛山市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研課題（2014183）。

莊錫偉（1983-），主管技師，主要從事臨床檢驗(yàn)工作。

（2015-11-19）