連曉鵬　馬　捷.山西醫(yī)科大學，山西太原　03000；.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原　03000

重組人促紅細胞生成素抑制細胞自噬減輕心肌微血管內(nèi)皮細胞氧化損傷

連曉鵬1馬捷2
1.山西醫(yī)科大學，山西太原030001；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原030001

目的 探討重組人促紅細胞生成素（recombinant human erythropoietin，rhEPO）對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞（cardica microvascular endothelial cells，CMECs）氧化損傷的保護作用和可能機制。方法 組織塊貼壁法培養(yǎng)CMECs，倒置顯微鏡形態(tài)學觀察，免疫熒光法鑒定。H2O2建立氧化損傷模型，取2～3代CMECs，隨機分為對照組、200 μmol/L H2O2組、200 μmol/L H2O2+5 U/mL rhEPO組、200 μmol/L H2O2+10 U/mL rhEPO組、200 μmol/L H2O2+ 20 U/mL rhEPO組。應用MTT法測定細胞存活率，化學比色法測定上清液中乳酸脫氫酶（LDH）含量，Western-blot檢測LC3、Beclin1和p-mTOR含量。結果 大鼠CMECs呈梭形、多角形等不規(guī)則形態(tài)，形成單層緊密鵝卵石樣排列，抗體陽性90%以上；與對照組比較，H2O2處理組存活率降低（P<0.05），LDH釋放量增加（P<0.05），rhEPO預處理后，與單純H2O2組比較，上述指標可逆轉（P<0.05）；與對照組比較，H2O2處理組LC3Ⅱ和Beclin1表達水平增高（P<0.05），rhEPO預處理后,LC3Ⅱ和Beclin1含量減低，與單純H2O2組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與對照組比較，單純H2O2組p-mTOR表達減少（P<0.05），余H2O2組p-mTOR表達增多（P<0.05），rhEPO預處理后，與單純H2O2組比較，誘導p-mTOR表達增高（P<0.05）。結論 rhEPO抑制氧化損傷CEMCs的過度自噬，提高細胞存活率，這種保護作用可能與rhEPO激活PI3K/AKT/mTOR通路有關。

重組人促紅細胞生成素；心肌微血管內(nèi)皮細胞；氧化損傷；自噬

[Abstract]Objective To explore the protective effect and mechanism of recombinant human erythropoietin on cardiac microvascular endothelial cells against oxidative damage.Methods The tissue block method was applied for CMECs. The cells were observed under inverted microscope and identified by immunofluorescence.To establish oxidative injury modle was by H2O2and CMECs at passage 2 to 3 were divided randomly into control group,200 μmol/L H2O2group, 200 μmol/L H2O2+5 U/mL rhEPOgroup,200 μmol/L H2O2+10 U/mL rhEPOgroup,200 μmol/L H2O2+20 U/mL rhEPO group.MTT assay was used to determine Cell viabilily.Chemical colorimetry were used to measure LDH of supernatant. Western-blot was used to evaluate protein expression of LC3,Beclin1 and p-mTOR.Results The cultured CMECs of rat showed fusiform shape or polygon,and the monolayer cultures displayed a typical cobblestone or paving-stone morphology and the positive rate was 90%or more.Compared with control group,the cell viabilily rate was reduced and LDH release quantity was increased(P<0.05)and after pretreated by rhEPO,compared with pure H2O2group,the above indexes were reversed(P<0.05);Compared with control group,protein expression of LC3Ⅱand Beclin1 were increased (P<0.05);after pretreated by rhEPO,compared with pure H2O2group,the protein expression were lowered(P<0.05);Compared with control group,p-mTOR of the pure H2O2group was reduced(P<0.05),but the other of H2O2group were increased(P<0.05),after pretreated by rhEPO compared with pure H2O2group,the protein expression were increased(P< 0.05).Conclusion RhEPO inhibits excessive autophagy of CMECs in oxidative damage and improves the cell viabilily rate.The protective effect may be related to activation of PI3K/AKT/mTOR signal away.

[Key words]Recombinant human erythropoietin;Cardiac microvascular endothelial cells;Oxidative damage;Autophagy

先天性心臟病是小兒時期最常見的心臟病，目前外科治療是最有效的矯正手段。體外循環(huán)是手術中重要輔助手段，但這個過程伴有心臟的缺血再灌注損傷。其主要機制是氧自由基產(chǎn)生的氧化損傷[1]。氧化損傷不僅引起細胞凋亡、壞死，還能引起過度自噬[2]。自噬（autophagy）是利用細胞溶酶體降解回收利用受損、變性、衰老的蛋白質，實現(xiàn)蛋白和能量更新代謝，對細胞維持穩(wěn)態(tài)具有非常重要意義[3]。有研究表明，氧自由基刺激不同信號轉導的炎性因子誘導細胞自噬，損傷內(nèi)皮細胞等[4]，CMECs是氧自由基等最早作用的靶細胞[5]，其損傷也是心肌細胞損傷的始動環(huán)節(jié)。因而研究CMECs在氧化損傷中的自噬水平有著重要意義。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO）是一種刺激紅細胞生成的糖蛋白細胞因子，主要由腎臟產(chǎn)生，現(xiàn)在廣泛用于臨床治療貧血，有研究表明，EPO有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，被認為是一種細胞保護因子[6]。rhEPO是基于重組DNA技術生產(chǎn)的 EPO，其氨基酸序列和生物活件均與內(nèi)源性EPO相同。本實驗采用體外建立CMECs氧化損傷模型，以模擬在體心臟損傷，研究rhEPO對CMECs自噬的影響及可能機制。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

內(nèi)皮細胞特制培養(yǎng)體系（500 mL基礎培養(yǎng)基，25 mL FBS，5 mL內(nèi)皮細胞生長添加劑，5 mL青霉素/鏈霉素）購于Sciencell公司；兔抗鼠Ⅷ相關抗原、兔抗鼠β-actin、辣根酶標記羊抗兔二抗購于北京中杉金橋；FITC標記羊抗兔IgG購于北京博奧森；rhEPO購于上海克隆生物高技術有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒購于海碧云天生物技術有限公司；兔抗大鼠LC3B、Beclin1、p-mTOR一抗購于Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1心肌微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)和鑒定取100～150 g雄性SD大鼠，用0.1%戊巴比妥鈉（2 mL/100 g）腹腔注射麻醉。待大鼠完全麻醉后，放置于75%的乙醇缸中浸泡3~5 min后，移動至超凈臺。無菌操作開胸，剪下心臟，置于無菌D－h(huán)anks溶液中，洗凈血污。小心剪除心肌瓣膜、結締組織，心臟的心房和右心室等，保留左心室，到達滅活心臟內(nèi)外膜組織，用PBS液徹底清洗心室組織3次，吸去多余的PBS液，轉移至干燥平皿，并加入少量的FBS，用消毒后的眼科剪，仔細把心室肌剪成1 mm3大小的組織塊。將剪好的組織塊接種于的無菌培養(yǎng)瓶中，倒置放入37℃、5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)4 h，使組織塊貼壁牢固。輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，加入3 mL含20%FBS的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)12 h，小心換液，去除血細胞。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出組織塊并換液，再繼續(xù)培養(yǎng)2~3 d，待細胞融合成單層時傳代。取出3~4代培養(yǎng)的細胞進行實驗。用免疫熒光法鑒定?？贵w為兔抗鼠Ⅷ因子一抗和FITC羊抗兔二抗對細胞鑒定。

1.2.2大鼠微血管內(nèi)皮細胞氧化損傷模型的建立和實驗分組將培養(yǎng)的大鼠胸主動脈內(nèi)皮細胞均勻接種于96孔板中，加入終濃度為200 μmol/L的H2O2，刺激細胞2 h。選用第2～3代培養(yǎng)的心肌微血管內(nèi)皮細胞，隨機分5組：（1）正常對照組；（2）200 μmol/L H2O2組；（3）200 μmol/L H2O2+5 U/mL rhEPO組；（4）200 μmol/L H2O2+10 U/mL rhEPO組；（5）200 μmol/L H2O2+20 U/mL rhEPO組。

1.2.3細胞存活率的檢測將各組細胞孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后，吸去上清液，加入100μL的DMSO，搖床振蕩10min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光值（OD）。存活率=（實驗組OD490 nm值/對照組OD490 nm值）×100%表示。實驗重復3次，每組6個復孔。

1.2.4細胞LDH漏出量的檢測上述實驗完成后，取各組細胞的上清液，按照乳酸脫氫酶測試盒的方法，測定培養(yǎng)液中LDH漏出量。

1.2.5Western blot法檢測 LC3、Beclin1、pmTOR蛋白表達各組細胞棄去上清液，加入ripa充分裂解。高速離心30 min，取上清液。加入用5%濃縮膠和12%分離膠電泳，轉膜，封閉。分別加入兔抗鼠LC3B、Beclin1、p-mTOR抗體和兔抗鼠β-actin，4℃，慢搖過夜。二抗孵育90 min。ECL顯色，圖像分析系統(tǒng)測定結果。

1.3統(tǒng)計學分析

采用 SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩個均數(shù)間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，多重比較用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)學觀察

在倒置相差顯微鏡下觀察可見細胞貼壁牢固融合形成單層，立體感明顯，折光性強，密集處呈梭形鵝卵石鑲嵌狀排列，鋪路石樣外觀，見圖1A。細胞傳代后繼續(xù)培養(yǎng)3 d可見有血管腔樣結構形成，見圖1B。

2.2大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的免疫熒光鑒定

Ⅷ因子相關抗原免疫熒光染色后可見細胞成梭形、多角形，綠色熒光陽性表達的細胞達95%以上，非內(nèi)皮細胞無陽性表達，證實為內(nèi)皮細胞，可用于后續(xù)試驗。見圖2。

圖1　A大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)學（×100）

圖1　B大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞形態(tài)學（×100）

圖2　大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞的免疫熒光鑒定（×100）

2.3rhEPO可以明顯逆轉H2O2引起的內(nèi)皮細胞存活率下降

MTT測定各濃度rhEPO對細胞存活率的影響（n=3），各濃度rhEPO組細胞生長抑制率較200 μmol/L H2O2組明顯降低（P<0.05），見表1、圖3。

表1　心肌微血管內(nèi)皮細胞存活率比較

表1　心肌微血管內(nèi)皮細胞存活率比較

注：與200 μmol/L H2O2組比較，*P<0.05

組別存活率（%）200 μmol/L H2O2組200 μmol/L H2O2+5 U/mL rhEPO組200 μmol/L H2O2+10 U/mL rhEPO組200 μmol/L H2O2+20 U/mL rhEPO組55.92±3.34 65.80±2.49*71.47±2.66*79.41±3.39*

（*P<0.05 vs 200 μmol/L H2O2組）圖3　MTT法測定各組細胞存活率的結果

2.4各組內(nèi)皮細胞LDH比較

rhEPO能明顯抑制細胞LDH的漏出量，對心肌微血管內(nèi)皮細胞的氧化損傷有保護作用。見表2、圖4。

表2　各組內(nèi)皮細胞LDH比較

表2　各組內(nèi)皮細胞LDH比較

注：與對照組比較，t=36.597，*P<0.05；與200 μmol/LH2O2組比較，F(xiàn)= 47.275，△P<0.05

組別LDH對照組200 μmol/L H2O2組200 μmol/L H2O2+5 U/mL rhEPO組200 μmol/L H2O2+10 U/mL rhEPO組200 μmol/L H2O2+20 U/mL rhEPO組70.86±10.56 514.16±18.41*446.25±26.94△362.51±27.18△307.69±17.33△

（與對照組比較，*P<0.05；與200 μmol/L H2O2組比較，△P<0.05）圖4　化學比色法測定各組內(nèi)皮細胞LDH的釋放量的結果

2.5rhEPO能明顯抑制自噬蛋白LC3Ⅱ的表達。

與對照組（0.701±0.022）比較，單純H2O2組（1.225± 0.054）LC3Ⅱ的表達量明顯上升（P<0.05）；H2O2+rhEPO組用不同濃度rhEPO（5 U/mL、10 U/mL、20 U/mL）預處理，CMECs氧化損傷后，與單純H2O2組比較，LC3Ⅱ含量均顯著降低至（1.021±0.015）、（0.808±0.036）、（0.810±0.064），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；但20 U/mL rhEPO組與10 U/mL rhEPO組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖5。

2.6rhEPO能顯著抑制自噬蛋白Beclin1表達量，且有一定的濃度依賴性

與對照組（0.642±0.011）比較，單純H2O2組（1.491± 0.049）Beclin1的表達量顯著上升（P<0.05）；H2O2+ rhEPO組用不同濃度rhEPO（5 U/mL、10 U/mL、20 U/mL）預處理后，與單純H2O2組比較，Beclin1表達量均明顯降低至（1.163±0.040）、（0.862±0.027）、（0.775±0.023）（P<0.05），并且存在一定的濃度依賴性。見圖6。

2.7western-blot檢測各組細胞p-mTOR表達量

不同濃度rhEPO明顯能誘導mTOR蛋白磷酸化水平的提高，并且p-mTOR的表達量的升高與濃度有劑量依賴性與對照組（0.240±0.015）比較，單純H2O2組（0.110±0.004）p-mTOR的表達量顯著上升（P<0.05）；H2O2+rhEPO組用不同濃度rhEPO（5 U/mL、10 U/mL、20 U/mL）預處理后，與單純H2O2組比較，p-mTOR表達量均明顯降低，分別為（0.430±0.040）、（0.620±0.038）（0.790±0.073）（P<0.05），并且存在一定的濃度依賴性。見圖7。

圖5　Western-blot檢測各組細胞LC3Ⅱ的蛋白的表達量

圖6　Western-blot檢測各組細胞Beclin1的蛋白的表達量

圖7　Western-blot檢測各組細胞p-mTOR表達量

3　討論

在先心病體外循環(huán)中，造成缺血再灌注損傷還會丟失部分紅細胞。EPO除了參與造血功能，本試驗結果顯示，rhEPO抗氧化損傷并且提高CMECs存活率，并且這種保護作用與rhEPO濃度正相關。EPO的保護作用與PI3K/AKT通路有關[7]。生理狀況下，細胞保持著低水平自噬，是內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)和存活的機制，但自噬水平提高會破壞這種平衡使細胞死亡，出現(xiàn)一種新的死亡機制[8]。微管相關蛋白1輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3/Atg8）是自噬膜上的標志蛋白，細胞中存在兩種形式的LC3蛋白：LC3Ⅰ和LC3Ⅱ。其中LC3Ⅰ僅參與自噬過程的某個階段，而LC3Ⅱ始終穩(wěn)定的保持在細胞中，并且LC3Ⅱ的表達水平一定程度上能反應自噬體的數(shù)量[9]所以經(jīng)常作為標記自噬體。Beclin1是Atg6/Vps30同源的自噬基因，在腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[10]，同時也是自噬的一個標志分子，作用是介導自噬蛋白定位，促進調(diào)節(jié)自噬體的形成和成熟，在這個過程中表達會升高。因此本實驗把LC3Ⅱ和Beclin1作為評價自噬水平的檢測指標。本試驗中，用H2O2處理后，LC3Ⅱ和Beclin1表達量與對照組比，明顯上升，表明H2O2造成的氧化損傷引起了細胞過度自噬，rhEPO預處理后LC3Ⅱ和Beclin1表達量顯著降低，提示rhEPO有抑制自噬的作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR）屬于磷脂酞肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）蛋白激酶類家族，因其活性可被雷帕霉素抑制而得名，有研究證實[11]極低濃度的H2O2可以通過激活mTOR誘導細胞自噬水平提高，清除多余的氧自由基，維持細胞的正常生理功能；氧自由基過量聚集可誘導細胞過度自噬直接導致細胞死亡[12]。2011年，Kang等[13]首次提出自噬與mTOR之間存在著反饋調(diào)控。PI3K/AKT/mTOR通路在細胞自噬中起到非常關鍵的調(diào)節(jié)作用，mTOR作為該通路關鍵效應因子，激活的p-mTOR可以抑制和破壞自噬體的形成[14]，從而調(diào)節(jié)細胞自噬水平。本試驗結果顯示，單純H2O2組與對照組比，p-mTOR明顯降低，提示H2O2誘導的CMECs產(chǎn)生了過度自噬，用rhEPO預處理后，與單純H2O2處理組比較，p-mTOR表達則明顯上升，調(diào)節(jié)細胞自噬水平下降，初步考慮可能與PI3K/ AKT/mTOR通路相關，并且可能有mTOR有負反饋調(diào)節(jié)的參與。mTOR有雷帕霉素敏感的mTOR復合體（mTORC1）和雷帕霉素不敏感的mTOR復合體2 （mTORC2）兩種多聚體的活性形式存在。兩種復合體對細胞自噬的調(diào)節(jié)機制不一樣，mTORC1的激活可抑制細胞自噬，而mTORC2的激活卻可以誘導細胞自噬[15]。本試驗初步考慮rhEPO主要誘導mTORC1的表達。

綜上所述，本研究顯示rhEPO可以減輕心肌微血管內(nèi)皮細胞氧化損傷，提高心肌微血管內(nèi)皮細胞存活率。0~10 U/mL rhEPO能明顯抑制H2O2誘導氧化損傷的心肌微血管內(nèi)皮細胞過度自噬，這種機制可能是rhEPO通過激活PI3K/AKT/mTOR通路，使得mTOR磷酸化，誘導p-mTOR表達上升，并且可能主要誘導mTORC1的形成，從而抑制細胞自噬，實現(xiàn)對自噬負反饋調(diào)節(jié)。

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Recombinant human erythropoietin relieves oxidative stress damage of cardiac microvascular endothelial cells by inhibiting autophagy

LIAN Xiaopeng1MA Jie2
1.Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.The Second Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China

R965

A

1673-9701（2016）12-0022-05

2016-02-05）