柴　芳　卓業(yè)鴻　楊新光▲.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣仁醫(yī)院　陜西眼科醫(yī)療中心　西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安　70004；.中山大學(xué)中山眼科中心　眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州　50060

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78在小梁網(wǎng)細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義

柴芳1卓業(yè)鴻2楊新光1▲
1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬廣仁醫(yī)院陜西眼科醫(yī)療中心西安市第四醫(yī)院眼科，陜西西安710004；2.中山大學(xué)中山眼科中心眼科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510060

目的 檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）在體外培養(yǎng)的正常人小梁網(wǎng)細(xì)胞（NTM）及原發(fā)性開角型青光眼（POAG）患者小梁網(wǎng)細(xì)胞（GTM）中蛋白及mRNA表達(dá)差異及臨床意義。 方法 將體外培養(yǎng)的NTM及GTM細(xì)胞分為衣霉素（Tm）組、十字孢堿（STS）組及對照組，采用Real-time PCR、Western blot方法檢測藥物處理6、24 h后小梁網(wǎng)細(xì)胞中GRP78mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果原代培養(yǎng)的GTM細(xì)胞中GRP78表達(dá)水平明顯低于NTM細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Tm可增加NTM、GTM細(xì)胞中GRP78的表達(dá)，但后者的增高水平明顯低于前者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GTM細(xì)胞對STS的反應(yīng)大于NTM細(xì)胞。結(jié)論 POAG患者小梁網(wǎng)細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)能力低下，GRP78表達(dá)明顯下調(diào)，對損傷性刺激的敏感性增強(qiáng)，提示GRP78蛋白可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的小梁細(xì)胞凋亡中起保護(hù)作用。

青光眼；小梁網(wǎng)細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

青光眼為全球主要不可逆性致盲眼病，原發(fā)性開角型青光（primary open-angle glaucoma，POAG）是青光眼中的常見類型，其發(fā)病機(jī)制未明［1］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是近年新崛起的青光眼發(fā)病機(jī)制研究熱點(diǎn)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）作為ERS的關(guān)鍵伴侶蛋白，其高表達(dá)是細(xì)胞對病理應(yīng)激的重要防御機(jī)制之一［2-3］。近幾年國內(nèi)外廣泛開展針對GRP78的作用機(jī)制研究，提出2型糖尿病、腫瘤患者細(xì)胞內(nèi)GRP78呈高表達(dá)［4-6］。同時(shí)研究表明，GRP78對敏感神經(jīng)元、缺氧晚期心臟組織具有保護(hù)作用，可抑制肝細(xì)胞內(nèi)脂肪合成等［7-8］，其功能研究已引起生物學(xué)家們的廣泛重視。本研究通過體外培養(yǎng)正常人小梁網(wǎng)細(xì)胞（NTM）及POAG患者小梁網(wǎng)細(xì)胞（GTM），采用衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢堿（Staurosporine，STS）藥物處理細(xì)胞，運(yùn)用Real-time PCR、蛋白質(zhì)印跡（Western blot）等方法檢測GRP78mRNA及蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GTM細(xì)胞中GRP78表達(dá)下調(diào)，對ERS的反應(yīng)能力下降，對損傷性刺激的敏感性增強(qiáng)，最終導(dǎo)致功能異常和細(xì)胞凋亡。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基購于Gibco公司，胎牛血清購于杭州四季青公司，二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、衣霉素（Tunicamycin，Tm）、十字孢堿（Staurosporine，STS）購于美國Sigma公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司，Western blot檢測試劑盒購于Cell Signaling公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組

收集健康供體及青光眼患者小梁網(wǎng)組織進(jìn)行原代培養(yǎng)并進(jìn)行傳代［9］。將第3代小梁網(wǎng)細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶底，DMEM-F12培養(yǎng)液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%胎牛血清，60mg/L青霉素，100mg/L鏈霉索）培養(yǎng)。將NTM、GTM細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞完全融合后，分別加入含有1μmol/L Tm培養(yǎng)液、0.1μmol/L STS培養(yǎng)液和不含上述任何藥物的培養(yǎng)液，分為Tm組、STS組、對照組，每天換液，處理6～24 h。采用Realtime PCR、Western blot方法檢測藥物處理6、24 h后小梁網(wǎng)細(xì)胞中GRP78 mRNA及蛋白的表達(dá)。

1.3RNA提取和RT-PCR

樣品總RNA提?。号囵B(yǎng)瓶中加入Trizol，吹打后移入離心管，振蕩器混勻。加入氯仿，混勻、靜置分層后，離心轉(zhuǎn)上清于另一離心管中，加等體積異丙醇，離心后棄上清，加預(yù)冷的75%乙醇，再次離心后棄上清，ddH2O溶解沉淀。取RNA樣品，檢測RNA在230、260、280 nm處的吸光度，確定其質(zhì)量、濃度；再進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測RNA完整性；依Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將上述逆轉(zhuǎn)錄所得DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的片段，從而在mRNA水平檢測小梁網(wǎng)細(xì)胞GRP78的表達(dá)。采用DNA瓊脂糖凝膠電泳，用四星圖像分析系統(tǒng)對凝膠各泳道中的目的條帶和內(nèi)參條帶進(jìn)行光密度掃描，定量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4W estern blot檢測

根據(jù)Western blot檢測試劑盒說明提取細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，依次將Maker、各蛋白樣品加入梳孔內(nèi)，Maker上樣量為5μL，其余每孔上樣量為20μL（含總蛋白30μg），電壓為恒壓200 V，待溴酚蘭指示劑跑至分離膠下緣時(shí)，停止電泳，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗、二抗封閉后進(jìn)行曝光檢測，最后再入定影液10min，清水漂洗，晾干。用四星圖像分析系統(tǒng)對免疫印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析用Pearson檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GRP78mRNA在人眼小梁網(wǎng)細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)果顯示，GTM細(xì)胞GRP78mRNA表達(dá)水平較NTM細(xì)胞低，經(jīng)Tm、STS藥物處理后，表達(dá)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Tm處理后，NTM、GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78mRNA表達(dá)水平均上調(diào)，并且上調(diào)呈時(shí)間依賴性，最高表達(dá)量出現(xiàn)在Tm刺激24 h后；STS處理細(xì)胞后，NTM細(xì)胞內(nèi)GRP78mRNA表達(dá)水平在6、24 h均上調(diào)，而GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78 mRNA表達(dá)水平在6 h上調(diào)，24 h下調(diào)。Tm、STS藥物處理后，細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)變化量與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1　各組GRP78 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

表1　各組GRP78 mRNA相對表達(dá)量比較（±s）

注：與NTM比較，*P＜0.05，與對照組比較，#P＜0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢堿；NTM：正常人小梁網(wǎng)細(xì)胞；GTM：患者小梁網(wǎng)細(xì)胞

組別　NTM　GTM Tm組6 h 24 h STS組6 h 24 h對照組2.138±0.032#2.604±0.062#1.430±0.037*#1.732±0.049*#1.369±0.038#1.119±0.061#1.000±0.000 1.083±0.022*#0.583±0.035*#0.660±0.038*

2.2GRP78蛋白在人眼小梁細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)果顯示，各組小梁細(xì)胞均有GRP78蛋白表達(dá)，GTM較NTM細(xì)胞表達(dá)水平低，經(jīng)Tm、STS藥物作用24 h后GTM細(xì)胞GRP78蛋白的表達(dá)量明顯較NTM細(xì)胞低（P＜0.05）；Tm處理細(xì)胞后，NTM、GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78蛋白表達(dá)量均上調(diào)，并且呈時(shí)間依賴性，最高表達(dá)量出現(xiàn)在Tm刺激24 h；STS處理細(xì)胞后，NTM細(xì)胞內(nèi)GRP78蛋白在藥物處理6 h時(shí)上調(diào)，在藥物處理24 h時(shí)下調(diào)；而GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78蛋白表達(dá)量均下調(diào)，下調(diào)量在STS刺激細(xì)胞24 h時(shí)表達(dá)最明顯。Tm、STS藥物處理細(xì)胞后，GRP78蛋白表達(dá)變化量與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2～3。

圖1　各組GRP78 m RNA相對表達(dá)量（表達(dá)量/內(nèi)參表達(dá)量）

表2　各組GRP78蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

表2　各組GRP78蛋白相對表達(dá)量比較（±s）

注：與NTM比較，*P＜0.05，與對照組比較，#P＜0.05；Tm：衣霉素；STS：十字孢堿；NTM：正常人小梁網(wǎng)細(xì)胞；GTM：患者小梁網(wǎng)細(xì)胞

組別　NTM　GTM Tm組6 h 24 h STS組6 h 24 h對照組1.495±0.018#2.664±0.074#1.088±0.031*#1.906±0.058*#1.042±0.038#0.793±0.023#1.000±0.003 0.406±0.033*#0.356±0.019*#0.805±0.042*

3　討論

POAG占所有青光眼的85%～90%，小梁網(wǎng)部位房水外流阻力增大所造成的病理性眼壓升高是引起青光眼視神經(jīng)損害的重要原因。小梁網(wǎng)細(xì)胞的丟失勢必影響小梁網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響房水流出的效率，因而關(guān)于小梁網(wǎng)細(xì)胞凋亡的研究已成為探索開角型青光眼發(fā)病機(jī)制和治療手段的有效方法之一［10-12］。

ERS是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)定失衡、生理功能發(fā)生紊亂時(shí)，細(xì)胞為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而保持細(xì)胞生存啟動(dòng)的自我保護(hù)反應(yīng)機(jī)制［13-15］。ERS可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的加工處理，通過減少新生蛋白質(zhì)、降解未折疊蛋白及維持細(xì)胞內(nèi)鈣的平衡，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，保持細(xì)胞的正常功能和維持細(xì)胞存活。當(dāng)ERS過強(qiáng)過久時(shí)可啟動(dòng)凋亡通路引發(fā)細(xì)胞功能異常，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡；當(dāng)ERS能力低下時(shí)，有效的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制減少，細(xì)胞對損傷性刺激因素的敏感性增加而導(dǎo)致或加速細(xì)胞的死亡［16-17］。

圖2　藥物刺激下NTM、GTM GRP78蛋白表達(dá)條帶

圖3　各組GRP78蛋白相對表達(dá)量（表達(dá)量/內(nèi)參表達(dá)量）

GRP78位于真核生物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，與熱休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，被認(rèn)為是Hsp70家族的成員之一。GRP78的表達(dá)變化被認(rèn)為是ERS未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)的標(biāo)志；在低糖、低氧、低Ca2+等應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)時(shí)其基因的轉(zhuǎn)錄活性可提高10～25倍，表達(dá)量顯著增高，從而維持了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因此，近年來認(rèn)為細(xì)胞受刺激時(shí)GRP78呈高表達(dá)并合成GRP78的反應(yīng)，可能是細(xì)胞的一種重要防御機(jī)制，該機(jī)制對細(xì)胞有保護(hù)作用從而延長在各種不利因素刺激下的細(xì)胞生存期［18-20］。然而，本研究通過Real-time PCR、Western blot檢測在NTM細(xì)胞及GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78mRNA及蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示各組小梁網(wǎng)細(xì)胞均有GRP78表達(dá)，GRP78在GTM細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平較NTM細(xì)胞表達(dá)水平低。

Tm是細(xì)胞產(chǎn)生ERS的誘發(fā)因素。為了進(jìn)一步證實(shí)GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)下調(diào)是由于細(xì)胞對ERS反應(yīng)能力低下，本研究給予Tm藥物處理，結(jié)果顯示：NTM、GTM細(xì)胞經(jīng)Tm處理后，GRP78 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增加；GTM細(xì)胞GRP78表達(dá)水平的增加量明顯低于NTM。該結(jié)果表明NTM及GTM細(xì)胞在ERS刺激下均能產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)，然而，后者對ERS刺激的反應(yīng)能力明顯低于前者。

STS以0.1μmol/L的濃度培養(yǎng)細(xì)胞6～24 h，結(jié)果顯示：NTM、GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78蛋白表達(dá)量均下調(diào)；GTM細(xì)胞GRP78表達(dá)下調(diào)明顯大于NTM。以上結(jié)果提示，GTM細(xì)胞由于保護(hù)性GRP78蛋白下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)促生存因素下降，自身內(nèi)質(zhì)網(wǎng)防御功能被破壞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞對凋亡刺激敏感性增大。

目前的研究已經(jīng)明確了GRP78的生物學(xué)特性和細(xì)胞保護(hù)作用，GRP78的表達(dá)多少對決定應(yīng)激細(xì)胞的結(jié)局，如抵抗、適應(yīng)、損傷或凋亡等有重要作用，所以這方面的研究無論在科學(xué)理論還是在應(yīng)用前景上都具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GTM細(xì)胞內(nèi)GRP78表達(dá)下降且對ERS的反應(yīng)低下，表明其防御體系被破壞，增加了細(xì)胞對損傷性刺激的敏感性，可能加速或?qū)е滦×杭?xì)胞的死亡，為POAG的后期干預(yù)治療提供了有效靶點(diǎn)。

［1］Quigley HA，Broman AT.The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020［J］.Br J Ophthalmol，2006，90（3）：262-267.

［2］葛堅(jiān).我國近五年青光眼臨床和基礎(chǔ)研究進(jìn)展［J］.中華眼科雜志，2005，41（8）：710-715.

［3］Sano R，Reed JC.ER stress-induced cell death mechanisms［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1833（12）：3460-3470.

［4］林明楷，葛堅(jiān)，卓業(yè)鴻，等.青光眼病人小梁細(xì)胞體外培養(yǎng)、凍存與復(fù)蘇［J］.中國實(shí)用眼科雜志，2000，18（2）：77-79.

［5］Ozasa R，Okada T，Nadanaka S，et al.The antipsychotic olanzapine induces apoptosis in insulin-secreting pancreaticβcells by blocking PERK-mediated translational attenuation［J］.Cell Struct Funct，2013，38（2）：183-195.

［6］Joel M，Lisa C，Anna N.Stress and the inflammatory process：a major cause of pancreatic cell death in type 2 diabetes［J］.Diabetes Metab Syndr Obes，2014，7：25-34.

［7］Zhou Y，Shu F，Liang X，et al.Ampelopsin Induces Cell Growth Inhibition and Apoptosis in Breast Cancer Cells through ROS Generation and Endoplasmic Reticulum Stress Pathway［J］.PLoSOne，2014，9（2）：e89021.

［8］Suyama K，Watanabe M，Sakabe K，et al.GRP78 suppresses lipid peroxidation and promotes cellular antioxidant levels in glial cells following hydrogen peroxide exposure［J］. PLoSOne，2014，9（1）：e86951.

［9］Osada N，Kosuge Y，Ishige K.Characterization of neuronal and astroglial responses to ER sress in the hippocampal CAIarea inmice following transient forebrain ischemia［J］. Neurochem Int，2010，57（1）：1-7.

［10］安琳，季健.原發(fā)性開角型青光眼房水外流通路改變的研究進(jìn)展［J］.中華眼科雜志，2011，47（10）：953-956.

［11］Luna C，Li G，Liton PB，et al.Resveratrol prevents the expression of glaucoma markers induced by chronic oxidative stress in trabecular meshwork cells［J］.Food Chem Toxicol，2009，47（1）：198-204.

［12］張亞琴，徐亮，李建軍，等.正常眼壓性青光眼的研究現(xiàn)狀［J］.國際眼科縱覽，2011，35（1）：9-13.

［13］Qian Y，Tiffany-Castiglioni E.Lead-induced endoplasmic reticulum （ER）stress responses in the nervous system［J］.Neurochem Res，2003，28（1）：153-162.

［14］關(guān)麗英，許彩民，潘華珍.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2007，34（11）：1136-1141.

［15］錢錦，孫曉東.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與眼科疾?。跩］.眼科新進(jìn)展，2007，11（27）：861-864.

［16］王淑雅，華寧，李筱榮.PERK通路介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與眼科疾病研究進(jìn)展［J］.中華眼科雜志，2012，48（8）：759-762.

［17］Li G，Luna C，Qiu J，et al.Role of miR-204 in the regulation of apoptosis，endoplasmic reticulum stress response，and inflammation in human trabecular meshwork cells［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52（6）：2999-3007.

［18］Pi L，Li X，Song Q，et al.Knockdown of glucose-regulated protein 78 abrogates chemoresistance of hypopharyngeal carcinoma cells to cisplatin induced by unfolded protein in response to severe hypoxia［J］.Oncol Lett，2014，7（3）：685-692.

［19］張欣，王玉明，段勇.GRP78研究新進(jìn)展［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，（6）：5-8.

［20］韓真，王大博.葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白在急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)及其意義［J］.眼科研究，2012，30（5）：424-427.

Expression and clinical significance of GRP78 in human trabecular meshwork cells

CHAI Fang1ZHUO Yehong2YANG Xinguang1▲
1.Department of Ophthalmology，Xi'an No.4 Hospital Ophthalmic Medical Center of Shaanxi Province Guangren Hospital Affiliated to School of Medicine，Xi'an Jiaotong University，Shaanxi Province，Xi'an710004，China；2.Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat-Sen University State Key Laboratory of Ophthalmology，Guangdong Province，Guangzhou 510060，China

Objective To detect protein and mRNA expression differences of GRP78 in human trabecular meshwork cells of normal eyes（NTM）and POAG patients（GTM）in vitro.M ethods Human trabecular meshwork cells from NTM and GTM in vitro were divided into 3 groups:Tunicamycin（Tm）group，Staurosporine（STS）group and control group. Real-time RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of mRNA and protein of GRP78 in trabecular meshwork cells after 6，24 h treatment.Results The expression of GRP78 in primary culture GTM cells was significantly lower than that in NTM cells，with statistically significant difference（P＜0.05）.Tm could increase the expression of GRP78 in NTM and GTM cells，the expression in GTM cells was lower than that in NTM cells，with statistically significant difference（P＜0.05）.The response of GTM cells for STS was bigger than NTM cells.Conclusion GTMs showed insensitivity reactions when stimulated with inducer of endoplasmic reticulum stress，reduce the expression of GRP78，lead to the increased sensitivity of GTMs to damage stimulus.GRP78may play a cytoprotective role in the apoptosis in trabecular meshwork cells caused by endoplasmic reticulum stress.

Glaucoma；Trabecular meshwork cells；Endoplasmic reticulum stress

R775

A

1673-7210（2016）01（c）-0114-04

2015-10-20本文編輯：程銘）

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81273902）；陜西省西安市重點(diǎn)學(xué)科優(yōu)勢?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目（［2015］228號(hào)-7）。