祁　俊　韓曉珂　梁朝鋒安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖　241000

UV-分光光度計(jì)法和HPLC-ELSD法同時(shí)測定健脾止瀉膠囊中多糖含量

祁俊韓曉珂梁朝鋒
安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，安徽蕪湖241000

目的 建立健脾止瀉膠囊多糖的含量測定方法。方法 以無水葡萄糖為對照品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量；采用1.5mol/L硫酸溶液水解多糖，通過堿中和、乙醇沉淀的方法得到單糖，用HPLC-ELSD方法測定其含量；色譜條件：色譜柱為Xbridge Amide column（4.6 mm×150mm，3.5μm）；流動(dòng)相為乙腈∶0.1%三乙胺（75∶25）；柱溫：30℃；流速為1.0mL/min；ELSD漂移管溫度為95℃；氣體流速為3.0 L/min。結(jié)果 苯酚-硫酸法中，葡萄糖在6.8～68.0μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系（r2=0.9995），平均回收率為96.1%。HPLC-ELSD法中，無水葡萄糖在0.0507～0.8110mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r2=0.9998），平均回收率為97.1%，RSD為1.4%。兩種測定方法測定多糖的平均含量分別為22.3%、15.2%。結(jié)論 該方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，可以作為健脾止瀉膠囊多糖的含量測定方法。

健脾止瀉膠囊；無水葡萄糖；苯酚-硫酸法；HPLC-ELSD法

健脾止瀉膠囊為蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院即將申報(bào)的院內(nèi)制劑品種，為名老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，本方由茯苓、薏苡仁、白芍、山藥、黨參、白術(shù)等藥味組成，具有補(bǔ)益脾胃，兼以滲濕止瀉。茯苓既能健脾，又能滲濕，與黨參、白術(shù)、山藥等配伍，對于脾虛運(yùn)化失常所致泄瀉、帶下，有標(biāo)本兼顧之效。茯苓的主要化學(xué)成分為茯苓糖，含量約為84.2%，其中β-茯苓聚糖為主要成分，即茯苓多糖［2］。在多糖測定時(shí)，一般常用硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法作為多糖的含量測定方法［3］。另外多糖的定性和定量組成可通過酸催化水解多糖成單糖或寡糖后再進(jìn)行分析［4］。甲醇分解、乙酰分解作用、甲醛分解作用、酶水解等方法也可用于多糖降解。本研究運(yùn)用了苯酚-硫酸法測定了多糖的含量，由于文獻(xiàn)報(bào)道苯酚-硫酸法穩(wěn)定性均較差，重現(xiàn)性也不理想，故本研究同時(shí)采用硫酸水解，通過中和、沉淀等處理后，利用HPLC-ELSD色譜技術(shù)對其成分含量進(jìn)行了檢測。

1　儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜儀；Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì) （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；D-無水葡萄糖（中國藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：110833-200904）；XP205電子天平（瑞士梅特勒公司）；優(yōu)普醫(yī)療純水制造系統(tǒng)；GZX-9140MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；HHW-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠）；高純氮（安徽金鼎鍋爐股份有限公司，純度≥99.999%）；乙腈（HPLC/ Spectro，美國TEDIA公司）；硫酸、正丁醇、無水乙醇、甲醇、乙醚均為分析純。

2　UV-分光光度計(jì)法測定總糖含量

2.1對照品溶液的制備

取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每毫升含40μg的溶液，即得［5-12］。

2.25%苯酚溶液的制備

取苯酚100 g，加鋁粉0.1 g，碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾收集182℃餾分，稱取此餾分5 g，置100 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.3最大吸收波長的測定

精密量取葡萄糖對照品溶液2mL，精密加入5%苯酚水溶液1mL、濃硫酸7mL，混勻，于水浴中20min，取出，于冰浴中5 min。另以未加葡萄糖的溶液參比，分別于200～800 nm范圍內(nèi)掃描，最大吸收波長為490 nm。見圖1。

圖1　葡萄糖-苯酚硫酸法紫外掃描圖

2.4供試品溶液的制備

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，精密稱定，加入50mL無水乙醇加熱回流2 h，濾過，殘?jiān)鼡]至無醇味，將殘?jiān)蜑V紙置燒瓶中，加入50 mL水回流提取2次，每次2 h，趁熱過濾，殘?jiān)盁坑脽崴礈?，洗液與濾液合并，濃縮轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL至25 mL量瓶中，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

分別精密量取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，置于10mL的量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，配成系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密量取2mL，精密加入5%苯酚水溶液1mL、濃硫酸7mL，混勻，水浴加熱20min，取出，冰浴5min。以蒸餾水為空白，在490 nm波長處測定吸收度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程A=0.0136X-0.0069（r2=0.9995）。

2.6精密度試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2mL”起依法操作，測定吸光度，連續(xù)測定6次，計(jì)算吸光度RSD為0.78%。表明精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2 mL”起依法操作，測定吸光度，分別于0、1、2、4、6、8、10、24 h測定，計(jì)算吸光度RSD為1.27%，說明在樣品顯色之后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)140301）約0.4 g，6份，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2mL”起依法操作，測定吸光度，計(jì)算其平均含量為22.3%，RSD為1.16%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)140301）約0.2 g，6份，精密稱定，加入50mL無水乙醇加熱回流2 h，濾過，殘?jiān)鼡]至無醇味，將殘?jiān)蜑V紙置燒瓶中，精密加入葡萄糖對照品適量，加50 mL水回流提取2次，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量取2 mL”起依法操作，測定吸光度，結(jié)果表明加樣回收率符合要求。見表1。

表1　加樣回收率試驗(yàn)

2.10樣品含量測定

取3批樣品各約0.4 g，精密稱定，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.5”項(xiàng)下自“精密量2 mL”起依法操作，測定吸光度，結(jié)果見表2。

表2　樣品含量測定

3　HPLC-ELSD法測定總糖含量

3.1色譜條件

色譜柱：Xbridge Amide column（4.6mm×150mm，3.5μm）；流動(dòng)相：乙腈∶0.1%三乙胺=75∶25；柱溫：30℃；流速：1.0mL/min；蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度：95℃；氣體流速：3.0 L/min；理論塔板數(shù)按D-葡萄糖峰計(jì)算應(yīng)不低于3000［13-18］。

3.2對照品溶液的制備

精密稱取D-無水葡萄糖2份，分別加水制成每毫升含0.30mg和0.80mg的溶液，即得。

3.3供試品溶液的制備

取樣品約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水飽和正丁醇25mL，超聲處理30min，放冷，4000 r/min離心10min，傾出上清液，沉淀加入配制好的1.5mol/L硫酸溶液25mL，沸水浴3 h，取出，冷卻至室溫，滴加30%KOH溶液中和至pH值6～7，加入無水乙醇使含醇量達(dá)到70%，靜置片刻，4000 r/min離心10 min，取上清液，減壓回收乙醇至適量，轉(zhuǎn)移至100mL量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，即得。分別精密吸取對照品液與供試品液各10μL，注入液相色譜儀，測定，即得。HPLC-ELSD色譜圖見圖2～3。

圖2　D-無水葡萄糖HP LC-EL SD色譜圖

圖3　樣品HPLC-ELSD色譜圖

3.4線性試驗(yàn)

取D-無水葡萄糖適量，精密稱定25.35 mg，置25 mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。從上述對照品溶液中分別精密移取適量，配成0.0507、0.1014、0.2028、0.4055、0.6083、0.8110 mg/mL的系列濃度對照品溶液，搖勻，進(jìn)樣量為10μL。以峰面積的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)樣濃度的對數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=0.5252X-3.9398 （r2=0.9998），結(jié)果表明D-無水葡萄糖在0.0507～0.8110mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.5精密度試驗(yàn)

取D-無水葡萄糖對照品（0.4055 mg/mL）溶液，精密吸取10μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值，計(jì)算RSD為0.65%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品約0.3 g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10μL，分別在第0、2、4、6、8、10小時(shí)進(jìn)樣一次，共進(jìn)樣6次，測得峰面積積分值，計(jì)算RSD為1.33%，說明該方法穩(wěn)定性良好。

3.7重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品約0.3 g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，6份，測定，結(jié)果D-無水葡萄糖的平均含量為15.2%。表明該方法重復(fù)性良好。

3.8加樣回收試驗(yàn)

取樣品約0.15 g，精密稱定，分別精密加入D-無水葡萄糖對照品適量，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定，結(jié)果表明加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果符合要求。見表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)

3.9樣品含量測定

取3批樣品各約0.3 g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，進(jìn)樣，測定，結(jié)果見表4。

表4　3批樣品含量測定結(jié)果

4　討論

苯酚-硫酸法測定原理是根據(jù)多糖在硫酸的作用下先分解成單糖分子，并迅速脫水生成糠醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物測定［19-21］，此方法專屬性較差，但穩(wěn)定性較好，彌補(bǔ)了HPLC-ELSD法測定中由于對照品單一而使結(jié)果偏小的缺點(diǎn)；HPLC-ELSD法是通過將多糖完全水解，通過測定葡萄糖來反映多糖的含量，克服了多糖含量測定中專屬性不強(qiáng)的缺點(diǎn)，在以后的研究過程中，可以選用不同的單糖對照品來進(jìn)行測定，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)、可信，能更好地反映多糖的含量及各個(gè)單糖的比例。

在色譜條件的選擇上，考察了樣品在乙腈和水、乙腈和0.1%三乙胺、乙腈和0.2%三乙胺系統(tǒng)中的分離情況。結(jié)果乙腈和水比例在（81∶19）、（85∶15）、（89∶11）3個(gè)系統(tǒng)中，對照品葡萄糖均為兩個(gè)峰，而在乙腈和0.1%三乙胺系統(tǒng)中，對照品葡萄糖為單峰，說明三乙胺能加速葡萄糖兩個(gè)構(gòu)型之間的轉(zhuǎn)化。乙腈和0.2%三乙胺系統(tǒng)與乙腈和0.1%三乙胺系統(tǒng)沒有明顯差異，故選擇乙腈和0.1%三乙胺系統(tǒng)。

在前處理的過程中，考察了甲醇、無水乙醇、正丁醇、水飽和正丁醇、乙醚處理后樣品中葡萄糖的含量，結(jié)果乙醚前處理后得到的葡萄糖含量最高，但考慮到樣品中含有苷類成分，乙醚前處理不能有效地將其去除；甲醇、無水乙醇能有效地去除大量的苷類成分，但小分子的葡萄糖也有可能被除去。綜合考慮之下，又對正丁醇和水飽和正丁醇去除苷類能力進(jìn)行了進(jìn)一步的考察，結(jié)果水飽和正丁醇處理后樣品中芍藥苷的含量為0.05%（原2.8%），故選擇水飽和正丁醇作為前處理的試劑。

在樣品的處理過程中，對水解時(shí)間進(jìn)行了考察，選擇了1、2、3、4 h作為考察對象，結(jié)果在3 h時(shí)水解比較完全，所以選擇水解時(shí)間為3 h；對醇沉濃度進(jìn)行了考察，選擇了50%、60%、70%、80%作為考察對象，結(jié)果4個(gè)不同的醇沉濃度對結(jié)果影響不大，考慮到醇沉效果及盡量避免葡萄糖的損失，確定最終的醇沉濃度為70%。

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Determination of polysaccharide content in Jianpizhixie Capsules by UV-spectrophotometry and HPLC-ELSD method

QI JunHAN XiaokeLIANG Chaofeng
Preparation Room，Wuhu Hospital of TCM，Anhui Province，Wuhu241000，China

Objective To establish a determination method for polysaccharide in Jianpizhixie Capsules Methods Anhydrous glucose was used as

ubstance.Total sugar content was determined by phenol-sulfate acid method；1.5mol/L hydrolyzed polysaccharide sulfate solution was used，the method of alkali neutralization and ethanol precipitation was used to get simple sugars.The HPLC-ELSD method was used to determine its content.Chromatographic condition:chromatographic column was Xbridge Amide column（4.6mm×150mm，3.5μm）；Mobile phase was acetonitrile-0.1%triethylamine（75∶25），column temperature was 30℃，flow rate was 1.0 mL/min，temperature of ELSD was 95℃，gas flow rate was 3.0 L/min.Results Phenol-sulfate acid method of anhydrous glucose was linear in the ranges of 6.8-68.0μg/mL（r2=0.9995），the average recovery rate was 96.1%.HPLC-ELSD of anhydrous glucose was linear in the ranges of 0.0507-0.8110mg/mL（r2=0.9998），the average recovery was 97.1%，RSD=1.4%.The average contents of two kinds methods for determination of polysaccharide were 22.3%，15.2%.Conclusion The method is stable and feasible，has good repeatability and can be used as the polysaccharide content determination of Jianpizhixie Capsules.

Jianpizhixie Capsules；Anhydrous glucose；Phenol-sulfate acid method；HPLC-ELSD method

R927.2

A

1673-7210（2016）01（c）-0039-05

2015-09-30本文編輯：趙魯楓）

祁?。?966-），男，副主任中藥師，主要從事中藥制劑配制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究和制劑管理工作。

韓曉珂（1981-），女，碩士，主要從事中藥制劑配制、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。