李　靜　陳　軍　李秀玉　牛潞芳.海軍總醫(yī)院中醫(yī)科，北京　00048；.陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，陜西咸陽　7046

模擬微重力對骨髓間充質(zhì)干細胞全細胞瘤苗干預(yù)A549移植瘤增殖的研究

李靜1陳軍2李秀玉1牛潞芳1
1.海軍總醫(yī)院中醫(yī)科，北京100048；2.陜西中醫(yī)學(xué)院針灸推拿系，陜西咸陽712046

目的 比較骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）于不同重力環(huán)境下獲得全細胞抗原（WCAs）對于人肺腺癌細胞株A549荷瘤的影響。方法 全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)小鼠MSCs，采用2D回轉(zhuǎn)模式，以30 r/min水平回轉(zhuǎn)模擬微重力（MMG）培養(yǎng)條件，并以正常重力（NG）為對照培養(yǎng)MSCs；隨后以15 Gy的X線滅活MSCs獲取WCAs，將BALB/c小鼠隨機分成4組，實驗組（MMG組）皮下接種WCAs為（1次/3 d，共2周）；對照組分別為PBS組，NG組，A549組；各組均采用A549細胞系皮下移植荷瘤，觀察4組小鼠腫瘤生長情況；測量腫瘤直徑、計算腫瘤體積，并采用免疫組化法檢測增殖細胞核抗原（PCNA）表達。結(jié)果 肺腺癌A549細胞皮下移植使小鼠成功荷瘤，MMG可促進WCAs抑制移植瘤的生長。MMG組腫瘤體積顯著小于PBS組與NG組（P＜0.05）；NG組及MMG組的腫瘤至第6天方見生長，MMG組移植瘤體積顯著小于NG組（P＜0.05）。同時，A459組的抑制作用最強；PBS組腫瘤最大；12 d對各組移植瘤稱重，其中NG組為（458.7±21.6）g，MMG組為（315.6±18.5）g，MMG組的抑制作用顯著高于NG組（P＜0.05）。HRP標記染色提示MMG可增強WCAs的免疫刺激，使得PCNA表達下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論采用MSCs獲得WCAs進行免疫應(yīng)激可產(chǎn)生抑制腫瘤生長作用，MMG可加強其抑瘤作用，能顯著觀察到PCNA表達下調(diào)，其內(nèi)在的免疫分子機制有待深層次的探索。

骨髓間充質(zhì)干細胞；腫瘤；模擬微重力

有關(guān)腫瘤發(fā)生“胚胎”屬性的認識由來已久，“cancer”源于古希臘語，意味著“anaplasia（返祖）”，其內(nèi)涵就是“to from backwards（回到起點）”。去分化（dedifferentiation）屬性，指某種情況下，一些細胞失去它原本所在組織的結(jié)構(gòu)和功能，成為一個具有未分化細胞特征的細胞，而具備這種特性的細胞往往都是腫瘤細胞［1］。正是基于此設(shè)想，一百多年來，研究人員嘗試采用胚胎組織進行裂解獲得瘤苗抗原，評估其對移植瘤抑瘤效果并取得初步結(jié)論［2］，即干細胞或胚胎組織的粗抗原可產(chǎn)生類似腫瘤疫苗的作用。本研究組早前也初步摸索，發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）獲得全細胞抗原 （whole cell antigens，WCAs）可以產(chǎn)生抑瘤作用［3-4］。進一步評估發(fā)現(xiàn)，通常條件下MSCs瘤苗的抑瘤效率低，這可能將成為制約瓶頸有待突破。因此，探索可以提高全細胞瘤苗免疫原性的方法或策略顯得尤為迫切。本研究采用模擬微重力（MMG）干預(yù)MSCs全細胞抗原后進行免疫接種，評估比較不同重力模式下MSCs的WCAs的抑瘤作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料

BALB/c系小鼠（合格證號：軍KS-2012-0004，軍事醫(yī)學(xué)科院動物中心）；CO2恒溫培養(yǎng)箱 （Thermo 140型，美國HERA cell），普通離心機（HDL-40B型，成都科學(xué)儀器廠），2D回轉(zhuǎn)儀（中國科學(xué)院），臺式低溫高速離心機（Labofuge 400R型號，德國Heraeus），倒置顯微鏡（CKX31型，日本Olympus）；低糖DMEM（美國Hyclone），胎牛血清 （美國Hyclone），PCNA-鼠單抗（美國Abcom），辣根過氧化物酶（HRP）-二抗（北京中杉公司）。

1.2方法

1.2.1MSCs、A549培養(yǎng)與全細胞抗原的制備

1.2.1.1MSCs全骨髓貼壁法培養(yǎng)MSCs，6周齡小鼠的股骨和脛骨，10%FBS-低糖DMEM沖出骨髓，接種于培養(yǎng)瓶里，24～48 h后去懸浮，每3～4天換液，直至需要傳代。

1.2.1.2人肺腺癌A549細胞從液氮罐中取出A549細胞凍存管，放入37℃水浴鍋中解凍，1000 r/min離心5 min，PBS吹打、離心后，以10%FBS+5%RPMI-1640培養(yǎng)，2～3 d換液，直到需要傳代。

1.2.1.3MSCs全細胞抗原制備X線照射裂解法獲得抗原，調(diào)整3～5代A549細胞密度為1×106，于培養(yǎng)皿中行X線照射，強度為15 Gy，時間30 s；照射后的抗原4℃保存不超過6 h。

1.2.2CCK8細胞活力檢測

在96孔板中接種濃度為2×104個/孔的2種細胞（MMG與NG分別培養(yǎng)的MSCs）懸液，置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃，5%CO2）；接種細胞后分別于第3、6、9、12天加入10μLCCK8溶液；培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h；酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

1.2.3MMG干預(yù)

采用2D回轉(zhuǎn)模擬微重力培養(yǎng)條件［5-6］，MSCs細胞分為MMG組與正常重力（NG）對照組，MMG組細胞上回轉(zhuǎn)儀上模擬失重（經(jīng)計算以30 r/min為最佳效果），在此回轉(zhuǎn)條件下重力及切應(yīng)力對細胞產(chǎn)生的影響會降至最低［7］。MSCs長至融合后，消化細胞接種于蓋玻片上，隨后置于6孔培養(yǎng)板中，調(diào)整細胞密度為2×105個/孔；貼壁后上回轉(zhuǎn)倉，將爬片插入到特制的Fixing鐵架上，每個鐵架相應(yīng)放入4個玻片，置于小室，加入培養(yǎng)基（37℃，10%低糖DMEM）；擰緊蓋子安裝至回轉(zhuǎn)器上，整個回轉(zhuǎn)系統(tǒng)放置在 37℃恒溫培養(yǎng)箱，以30 r/min旋轉(zhuǎn)回轉(zhuǎn)48 h。NG對照組所有操作相同，即爬片后入小室，但小室不上回轉(zhuǎn)器。

1.2.4移植瘤荷瘤造模及實驗分組

選擇3～4周齡雄性小鼠，每組6只。依據(jù)免疫應(yīng)激抗原的不同分為4組：PBS組、A549組（A549裂解獲得WACs）、MMG組（MMG干預(yù)后MSCs裂解獲得WACs）、NG組（NG干預(yù)后MSCs裂解獲得WACs），實驗組為MMG組，余3組為對照。NG組與A549組小鼠每3天接受1次皮下注射瘤苗刺激（抗原液加PBS 共2mL），2周后（共5次）進行腫瘤荷瘤造模。PBS組每3天接受1次皮下注射2 mL的PBS，2周后荷瘤造模。整體實驗流程詳見圖1。

圖1　實驗流程圖

1.2.5A549皮下移植造模及腫瘤測量

1.2.5.1造模獲得復(fù)蘇后3～4代A549細胞，調(diào)整細胞密度為1×106接種小鼠上肢下方（腋窩下）皮膚。

1.2.5.2測量按皮下腫瘤體積及形狀進行動態(tài)觀察，接種后分別于3、6、9、12 d觀察腫瘤增長，測量最長徑與最短徑，計算腫瘤體積，公式為V=1/6πab2（a為長徑，b為短徑），單位為毫米（mm）。并在12 d處死小鼠，切下腫瘤，電子秤稱量腫瘤的重量，單位為克（g）。

1.2.6HE染色及PCNA的表達

12 d獲取腫瘤組織，固定、脫水、包埋、切片。

1.2.6.1HE染色切片蒸餾水漂洗入蘇木精染色，酸水及氨水中分色；自來水沖洗過蒸餾水；分別入酒精中脫水，伊紅染色液染色；脫水、透明、封固。

1.2.6.2免疫組化 二甲苯脫蠟，入3%H2O2浸泡10min抗原修復(fù)，5%BSA封閉，加一抗，4°C過夜；PBS沖洗，加上HRP標記二抗，然后37°C孵育半小時；顯色、蘇木精復(fù)染、脫水、封片。

1.2.6.3結(jié)果觀察倒置顯微鏡下，伊紅淡染示細胞漿，胞核被藍色復(fù)染記一個完整細胞，在此基礎(chǔ)上記錄HRP標記（褐色沉淀）記錄陽性細胞數(shù)，于10倍下觀察，分別取3個視野后計數(shù)平均數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 14.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MMG干預(yù)MSCs的細胞形態(tài)和增殖情況

在NG組（正常對照），爬片1d即可見較多細胞貼壁，呈紡錘形和多角形，可見細胞核；而MMG組采用MMG干預(yù)后細胞出現(xiàn)“圓形”改變，細胞間距增大，排列稀疏。見圖2。本研究采用CCK8檢測細胞活力，于第3、6、9、12天分析OD值，具體見圖2；提示MMG可影響細胞增殖。

2.2MMG上調(diào)MSCs的WCAs抑瘤作用

本研究分別獲得NG及MMG條件下MSCs的WCAs，以WCAs刺激小鼠獲得免疫應(yīng)激模型，同時以A549細胞及PBS行實驗對照；其中陽性對照組的WCAs抑制最強。3 d時，4組均未觀察到明顯的腫瘤產(chǎn)生。6 d時，A549組未觀察到明顯的腫瘤產(chǎn)生，PBS組體積［（45.5±16.4）mm3］，MMG組［（19.03±6.5）mm3］，NG組［（26.4±9.2）mm3］，與NG組比較，PBS組增大（P＜0.05），MMG組減?。≒＜0.05）；與MMG組比較，PBS組與NG組均增大（P＜0.05）。9 d時，A549組未有腫瘤產(chǎn)生，PBS組體積［（83.5±12.6）mm3］，MMG組［（26.7±5.9）mm3］，NG組［（57.7±10.2）mm3］，與NG組比較，PBS組明顯增大 （P＜0.05），MMG組明顯減?。≒ ＜0.05）；與MMG組比較，PBS與NG組均增大 （P＜0.05）。12 d時，A549組腫瘤體積［（6.03±1.21）mm3］，PBS組體積［（138.7±9.4）mm3］，MMG組［（41.9±8.1）mm3］，NG組［（79.7±12.4）mm3］；與A549組比較，其余組別移植瘤均增大（P＜0.05）；與PBS組比較，各組體積均減?。≒＜0.05）；與 NG組比較，PBS組明顯增大（P＜0.05），MMG組與A549組明顯減小 （P＜0.05）；與MMG組比較，A549組較小 （P＜0.05），PBS組與NG組均增大（P＜0.05）。見表1。

圖2　MMG對細胞增殖的影響

12 d處死小鼠切下移植瘤進行稱重，PBS組［（892.3±10.6）g］，NG組［（458.7±21.6）g］，MMG組［（315.6± 18.5）g］，A549組［（114.2±16.7）g］，與A549組比較，其余組別移植瘤均增大（P＜0.05）；與PBS組比較，各組體積均減?。≒＜0.05）；與NG組比較，PBS組明顯增大（P＜0.05），MMG組與A549組明顯減?。≒＜0.05）；與MMG組比較，A549組較小 （P＜0.05），PBS組與NG組均增大（P＜0.05）。見圖3。

表1　MMG對MSCs瘤苗抑瘤體積的影響（mm3，±s）

表1　MMG對MSCs瘤苗抑瘤體積的影響（mm3，±s）

注：與PBS組比較，#P＜0.05；與NG組比較，△P＜0.05；與MMG組比較，▲P＜0.05；與A549組比較，*P＜0.05

組別　3 d　6 d　9 d　12 d PBS組NG組MMG組A549組0000 45.5±16.4#26.4±9.2△19.0±6.5▲0 83.5±12.6#57.7±10.2△26.7±5.9▲0 138.7±9.4#79.7±12.4△41.9±8.1▲6.0±1.2*

圖3　MMG對MSC s瘤苗抑瘤1 2 d質(zhì)量的影響

2.3MMG抑制移植瘤區(qū)PCNA的表達

獲取12 d的腫瘤組織，石蠟包埋切片后行PCNA組化染色（圖4a），并HE染色，可以看到均勻分布的腺癌細胞，胞漿紅染（圖4c）；其表達均數(shù)為：PBS組為（122.3±0.1）個，A549組為（31.6±0.1）個，NG組為（77.5± 0.1）個，MMG組為（60.2±0.1）個。與PBS組比較，其他組PCNA細胞均降低（P＜0.05；與NG組比較，MMG組、A549組PCNA細胞降低（P＜0.05），PBS組升高（P ＜0.05）；與MMG比較，A549組PCNA表達稍低（P＜0.05），NG組與PBS組均升高（P＜0.05）；與A549組比較，其他組表達均升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4　瘤體PCNA表達情況

3　討論

腫瘤組織的異質(zhì)性與其去分化屬性高度相關(guān)，系指在某種情況下，一些細胞失去它所在組織的結(jié)構(gòu)和功能，呈現(xiàn)未分化特征，這些屬性其實就是胚胎屬性［9］。病理學(xué)家經(jīng)常通過評估比較靶細胞與本體組織的胚胎屬性標識該腫瘤的分化程度，腫瘤細胞越接近于胚胎屬性其惡性程度往往越高［10］。正是這種腫瘤起源的探索［12］，人們猜想采用胚胎組織或可實現(xiàn)腫瘤的預(yù)防接種，然而此類探索一直未得到有效突破，直到近年來干細胞理念和技術(shù)的進步，使得人們真正地論證了干細胞瘤苗的腫瘤預(yù)防接種作用。

2009年Li等［2］首次采用胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESs）作為免疫種子，發(fā)現(xiàn)其對結(jié)腸癌株CT26的移植瘤有明顯的抑制作用；隨后又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ESs對肺腺癌細胞的移植瘤也有明顯的抑制作用。進一步的研究表明，該抑制機制可能與T細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（cytotoxic T lymphocyte response，CTLs）上調(diào)高度相關(guān)［11］。由于倫理及培養(yǎng)條件的顯著ES地腫瘤全細胞疫苗的研究面臨許多挑戰(zhàn)。

近兩年，本項目組對成體干細胞——MSCs的免疫抑瘤作用進行了探索，發(fā)現(xiàn)其同樣具有抑瘤接種作用［3］。研究證實，MMG可使得細胞呈現(xiàn)巨大改變，那么是否可以改變其WACs特性呢？本文旨在分析MMG作用下，MSCs的WACs作用改變的情況。本項目之所以構(gòu)建A549組源瘤模型，是源于20世紀腫瘤WCAs“專職”免疫抑制的假說［10］，采用干細胞對其進行比較一方面可以間接比較MSCs的抑瘤作用；另對于腫瘤的預(yù)防可能更具有潛在的臨床意義。

在重力消失的情況下，組織、細胞會產(chǎn)生與正常地球重力作用下迥異的結(jié)構(gòu)與功能，并且研究人員已經(jīng)利用這種差異推行在組織工程學(xué)中［16］，而其模擬方式，無論是一維、二維或三維，都是選擇合適的速度進行回轉(zhuǎn)來最大程度地減輕重力的影響［17-18］；本研究團隊長期進行細胞空間動力的研究，以二維回轉(zhuǎn)培養(yǎng)為主，反復(fù)驗證其結(jié)果可靠［6，8］。本次研究中，將MSCs采用MMG干預(yù)48 h后通過X線裂解獲得WCAs；較之正常對照組，MMG組的抑瘤作用提高。本研究顯示早期接種3 d的腫瘤增殖無明顯改變，但是隨著時間的延長至第6天時其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。有學(xué)者曾分析了ESs腫瘤增殖改變情況，發(fā)現(xiàn)疫苗接種后隨著時間延長，腫瘤抑制愈明顯；并深入分析不同腫瘤負荷程度下干細胞瘤苗抑瘤的差異，認為低負荷組腫瘤抑制效果更為顯著［15］。本研究切下移植瘤分析其重量和形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量的改變與體積的改變同步，提示腫瘤內(nèi)部尚未存在空洞或液化等干擾因素，但是需要進一步采用小動物影像攝像進一步證實［16］。PCNA在細胞增殖的啟動上起重要作用［17］，是反映細胞增殖狀態(tài)的敏感指標［18-20］，本研究發(fā)現(xiàn)，MMG 組PCNA的表達較NG對照組更低，提示腫瘤抑制率提高。本研究初步分析MMG可提高MSCs全細胞抗原的抑瘤能力并可直接抑制細胞增殖。

在獲得這些初步數(shù)據(jù)后，更多的疑問擺在面前，MSCs抑瘤的作用是否也與CTL作用有關(guān)？MMG是否也是通過該途徑的變化發(fā)揮其作用的？MMG是否有長效抑瘤的作用，是否能觸發(fā)機體長效的免疫“記憶”。因此，此后本項目組將針對這些突出問題開展進一步研究。

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Study of simulated microgravity affecting antitumor response of mesenchymal stem cells against A549 transplantation tumor

LI Jing1CHEN Jun2LI Xiuyu1NIU Lufang1
1.Department of Traditional Chinese Medicine，PLA Navy General Hospital，Beijing100048，China；2.Department of Acupuncture and Massage，Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi Province，Xianyang712046，China

Objective To estimate the whole cell antigens（WCAs）of mesenchymal stem cells（MSCs）cultured in different gravity can generate different immune response against cancer in mice which induced by lung cancer cell line A549.Methods The MSCs was isolated and cultured adherent cells from marrow and a 2-dimensional clinostat（2D clinostat）was used to keep cells in continuous 2D rotation at a speed of 30 r/min around the horizontal axis，to mimc the microgravity（MMG），and the normal gravity（NG）was used as control.And then MSCs was to irradiate to X-ray（15Gy）to get the WCAs.The experiment group （MMG group）was immunized with WACs（once/3 d，2 weeks）and then the mice were challenged with A549 cells；the control mice immunized subcutaneously with PBS control（PBS group），MSCs-NG control（NG group）and A549 control（A549 group），mice were monitored for their tumor growth by measure the diameter；then the weight and volume was plotted；the expression of PCNA was monitored by immunohistochemisty. Results A well-established lung cancer（A549）model was established，MMG could improve the immune responses against A549 lung carcinoma（P＜0.05）.The A549 group had strongest inhibit effect，while the PBS group had the biggst tumor，the tumor of MMG group and NG group were found beginning to grow until 6 d；and the size in MMG group was smaller than NG group（P＜0.05）；the weight of tumor were measured on 12 d，it showed that the weight of NG group was（458.7±21.6）g，while in MMG was（315.6±18.5）g；the resist effet in MMG group was bigger than NG group （P＜0.05）.HRP stain showed MMG could down-regulated the PCNA expression（P＜0.05）.Conclusion Immunization of with MSCs getting WCAs can suppress tumor growth，MMG can enhance this suppressing effect，it can be observed PCNA expression down，the further immune mechanism need more exploring.

Mesenchymal stem cells；Cancer；Modeled microgravity

R734.2

A

1673-7210（2016）01（c）-0008-05

2015-10-25本文編輯：蘇暢）

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（8110 2678）。

李靜（1981-），女，博士；研究方向：惡性腫瘤的中醫(yī)治療。