唐淑潔趙旭偉張佳琦劉洋王梓丞

RGD修飾的葫蘆素B納米脂質(zhì)載體對乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用*

唐淑潔①趙旭偉①張佳琦①劉洋①王梓丞①

目的：制備RGD修飾的葫蘆素B納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（RGD-CuB-NLC），觀察RGD-CUBNLC對乳腺癌細(xì)胞的體外抑制作用和對乳腺癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法：采用薄膜分散法制備得RGD-CuB-NLC，按照貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)方法，制成MCF-7乳腺癌單細(xì)胞混懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，建立RGD-CuB-NLC組，CuB-NLC、RGD-NLC為對照組，另設(shè)NLC空白組，計算不同條件的抑制率。建立裸小鼠移植瘤，將合格的30只移植瘤裸小鼠隨機(jī)分成五組，每組6只。分別尾靜脈注射CuB注射液，CuB-NLC，RGD-NLC，RGD-CuB-NLC和0.9%氯化鈉溶液，每間隔24 h給藥1次，共7次，記錄鼠重、瘤體質(zhì)量并計算抑瘤率。結(jié)果：RGD-CuB-NLC：形態(tài)為圓形，包封率＞80%，粒徑＜150 nm，平均為（115.6±2.1）nm，多分散系數(shù)為（0.217±0.033），電位為（-12.31±0.76）mV。不同脂質(zhì)體對乳腺癌細(xì)胞體外抑制率分別為：NLC組為0，CuB-NLC組為（46.3±2.21）%，RGD-NLC組為（55.7±3.22）%，RGD-CuB-NLC組為（75.6±5.67）%，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。0.9%氯化鈉溶液組、CuB組、CuB-NLC組、RGD-NLC組與RGD-CuB-NLC組抑瘤率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CuB組、CuB-NLC組、RGD-NLC組、RGD-CuB-NLC組與0.9%氯化鈉溶液組抑瘤率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：RGD修飾的葫蘆素B納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的增值和腫瘤的生長。

RGD肽； 葫蘆素B； 納米脂質(zhì)載體； 乳腺癌； 抑瘤

First-author's address：The First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College，Qiqihar 161041，China

RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，RGD與腫瘤細(xì)胞或腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的整合素受體具有特異性結(jié)合作用［1-3］。

納米脂質(zhì)載體（NLC）是20世紀(jì)90年代末出現(xiàn)的一種新型給藥系統(tǒng)。納米脂質(zhì)載體是由混合脂質(zhì)作為骨架材料制成的納米尺度的載藥系統(tǒng)，它們具有生理相容性、高熔點、生物可降解的特性［4-6］?；旌系墓羌懿牧闲纬闪撕欢{米隔室的脂質(zhì)骨架，納米粒固體內(nèi)核的特性不會由適當(dāng)比例的液體脂質(zhì)而改變，避免放置過程中藥物外排導(dǎo)致的包封率降低。NLC正成為一種發(fā)展?jié)摿薮蟮男滦图{米藥物載體而被廣泛應(yīng)用于藥劑學(xué)領(lǐng)域［7-10］。葫蘆素B（Cucurbitacins B，CuB）主要來源是葫蘆素科植物甜瓜瓜蒂，葫蘆素類藥物是屬于19-甲基出現(xiàn)在C-9位上的一類四環(huán)三萜化合物［11-12］。課題組前期將其制成納米脂質(zhì)載體（CuB-NLC），體外研究表明，CuB及CuB-NLC對乳腺癌MCF-7有明顯的抑制作用，且CuB-NLC的作用強(qiáng)于CuB的作用［13-14］。本研究在此基礎(chǔ)上將葫蘆素B納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（CuB-NLC）用RGD修飾，制備具有腫瘤靶向作用的RGD-CuB-NLC，將藥物選擇性地遞送至腫瘤細(xì)胞從而提高療效，現(xiàn)報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物 由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院動物中心提供實驗所需的標(biāo)準(zhǔn)動物：5周齡雌性裸鼠（購于成都達(dá)碩實驗動物公司，動物合格證號：2013001619132），體重22～25 g，共36只。

1.2實驗儀器 電鏡、共聚焦顯微鏡、多功能酶標(biāo)儀、超低溫冰箱、超純水制備系統(tǒng)、全自動顯微攝影儀、細(xì)胞粉碎儀、生物安全柜、CO2培養(yǎng)箱、超速離心機(jī)、沃特斯高壓液相色譜儀、均質(zhì)機(jī)、低溫?fù)u床等。

1.3實驗材料 葫蘆素B（寶雞市辰光生物科技有限公司，純度98%，批號：20130120）；單硬脂酸甘油酯（GMS，德國BASF公司）；注射用大豆油、卵磷脂（德國Lipoid公司）；聚乙二醇（PEG）40硬質(zhì)酸酯（美國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司）；RGD（上海吉爾生化公司；DSPE-PEG2000（美國Avanti Polar lipids）；胎牛血清（杭州四季青生物科技公司）；0.25%胰酶（Gibco公司），其它試劑為分析純。

1.4RGD-CuB-NLC的制備 參照文獻(xiàn)［15］合成CuBNLC：精密稱取適量GMS、注射用大豆油、卵磷脂和CUB置圓底燒瓶中，加入無水乙醇適量，置（70±5） ℃水浴中，完全溶解后得到CuB分散均勻的有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸出乙醇，得油相。取一定量的PEG40硬脂酸酯溶于水中，水浴加熱至相同溫度得水相。將圓底燒瓶迅速移至70 ℃水浴中，800 r/min攪拌下將水相緩慢勻速（0.5 mL/min）滴入油相中，繼續(xù)攪拌乳化20 min，將其倒入已預(yù)熱的小燒杯中，探頭超聲10 min后，迅速置冰浴中攪拌固化30 min，過0.22 μm濾膜，得CuB-NLC混懸液。參照文獻(xiàn)［16］合成DSPE-PEG2000-RGD：將DSPE-PEG2000-Mal用適量氯仿溶于茄形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑成膜，真空干燥過夜。加入適量PBS緩沖液（pH 7.4）水化1 h（37 ℃，200 r/min），水浴超聲5 min使形成均勻的DSPE-PEG2000-Mal膠束溶液。將RGD多肽溶于適量PBS緩沖液中，加入DSPE-PEG2000-Mal膠束溶液，N2保護(hù)下4 ℃攪拌反應(yīng)直至TLC薄層色譜（展開劑MeOH∶DCM=1∶10）鑒定DSPEPEG-Mal點基本消失，得DSPE-PEG2000-RGD。將其作為固態(tài)脂質(zhì)加入CuB-NLC處方中，以單硬脂酸甘油酯為固體脂質(zhì)，M812為液體脂質(zhì)，HS-15為乳化劑制備得RGD-CuB-NLC。用高校液相色譜法測定CuB的包封率和載藥量，用馬爾文納米粒度測定儀測定粒徑和電位，用透射電鏡觀察其形態(tài)。

1.5RGD-CuB-NLC對乳腺癌細(xì)胞的體外毒性作用

1.5.1乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng) 按照貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)基用DMEM，10%～15%的胎牛血清培養(yǎng)并傳代MCF-7乳腺癌細(xì)胞備用。

1.5.2RGD-CuB-NLC對乳腺癌細(xì)胞的毒性 取生長狀態(tài)良好、呈對數(shù)生長期增殖旺盛的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，使用0.25%胰蛋白酶消化，10%胎牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液制成單細(xì)胞混懸液，精密量取100 μL（細(xì)胞濃度5×104個/mL）接種于96孔培養(yǎng)板，5% CO2及飽和濕度，37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。建立CuB-NLC和RGD-NLC為對照組，NLC空白組，每種條件設(shè)5個復(fù)孔。加藥5% CO2及飽和濕度，37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，使用微量進(jìn)樣槍每孔精密加入10 μL CCK-8溶液，CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長為450 nm處吸光度（OD）值，計算不同條件的抑制率。細(xì)胞抑制率計算公式為：抑制率= （1-實驗組OD值/DMSO對照組OD值）×100%

1.6RGD-CuB-NLC對乳腺癌荷瘤裸鼠抑瘤作用的研究

1.6.1裸小鼠移植瘤的建立 裸小鼠移植瘤由人乳腺癌MCF-7細(xì)胞細(xì)胞株接種于裸小鼠皮下建立，每只裸鼠腋下接種0.1 mL MCF-7細(xì)胞懸濁液，10 d左右腋下長出腫塊，裸小鼠移植瘤用游標(biāo)卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100～300 mm3后將動物隨機(jī)分組。

1.6.2乳腺癌荷瘤裸鼠抑瘤率的測定 將合格的30只移植瘤裸鼠隨機(jī)分成五組，每組6只，每組鼠重?zé)o明顯差異。分別尾靜脈注射CuB注射液、CuBNLC、RGD-NLC、RGD-CuB-NLC和0.9%氯化鈉溶液，每間隔24 h給藥1次，共7次，每隔2天測量1次腫瘤長短，計算移植瘤體積：先測量腫瘤的最大徑a（mm），再測量與最大徑線垂直的最長徑線b （mm），腫瘤體積VT=1/2×a×b2。稱取鼠重，記錄瘤體質(zhì)量并計算抑瘤率。抑瘤率=（1-處理組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（）表示，比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用 χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1一般情況 RGD-CuB-NLC包封率＞80%，形態(tài)為圓形。經(jīng)納米粒度儀測定，粒徑＜150 nm，平均（115.6±2.1）nm，多分散系數(shù)（0.217±0.033），電位（-12.31±0.76）mV，電鏡圖片見圖1。

圖1　RGD-CuB-NLC電鏡圖

2.2不同脂質(zhì)體干預(yù)對乳腺癌細(xì)胞抑制率比較 NLC組抑制率為0，CuB-NLC組為（46.3±2.21）%，RGD-NLC組 為（55.7±3.22）%，RGD-CuB-NLC組為（75.6±5.67）%，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3不同藥物干預(yù)對乳腺癌荷瘤裸鼠抑瘤率比較 0.9%氯化鈉溶液組、CuB組、CuB-NLC組、RGD-NLC組與RGD-CuB-NLC組抑瘤率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CuB組、CuB-NLC組、RGD-NLC組、RGD-CuB-NLC組與0.9%氯化鈉溶液組抑瘤率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　不同藥物干預(yù)對乳腺癌荷瘤裸鼠抑瘤率比較

3　討論

體外研究表明，CuB、CuB-NLC、RGD-NLC對乳腺癌MCF-7有明顯的抑制作用，且CuB-NLC的作用強(qiáng)于CuB的作用，RGD-NLC的作用強(qiáng)于CuBNLC的作用。RGD-CUB-NLC與不同脂質(zhì)體干預(yù)對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用相比最強(qiáng)。體內(nèi)研究表明不同藥物干預(yù)對乳腺癌荷瘤裸鼠的抑制作用RGDCUB-NLC組較其他組對瘤體的生長具有較強(qiáng)的抑制作用，同時對鼠重的影響最小。

納米技術(shù)是21世紀(jì)發(fā)展起來的新興學(xué)科，納米材料作為藥物的載體，可以運送低溶解度的抗癌藥物，通過包裹方式運載藥物使其免于體內(nèi)酶等物質(zhì)的溶解，提高藥物穩(wěn)定性。普通納米粒進(jìn)入體內(nèi)后，被機(jī)體視為異物，易被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）識別并吞噬，在靜脈給藥時只能作用于吞噬細(xì)胞比較豐富的器官，如肝臟、脾等。但若病灶部位不在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，該類制劑則會增加藥物對網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的毒性。長循環(huán)納米粒也稱為空間立體穩(wěn)定納米?；螂[形納米粒，是以聚乙二醇（PEG）對納米粒表面進(jìn)行修飾，PEG鏈與水分子的相互作用可在納米粒表面形成一層固定水化層，由于血漿蛋白不能與親水表面結(jié)合，因此，固定水化層的形成可以防止調(diào)理素及蛋白的吸附，避免RES吞噬，延長納米粒在體內(nèi)的循環(huán)時間［4］。

RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，是整合素（Int）與其配體蛋白相互作用的識別位點。在一些腫瘤細(xì)胞或者腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞常特異性地高表達(dá)某些整合素受體，如αvβ3，而正常組織血管中含量很少。RGD肽能與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的整合素結(jié)合，與血小板整合素及普遍存在的細(xì)胞受體無交叉反應(yīng)。因此，這類受體可以作為腫瘤靶向治療的靶點，利用外源RGD肽競爭結(jié)合整合素受體，抑制腫瘤遷移和腫瘤新血管生成，同時還可以靶向標(biāo)記定位腫瘤和靶向輸送抗腫瘤藥物。

綜上所述，通過RGD肽對藥物和納米載體進(jìn)行修飾，可以實現(xiàn)藥物或其遞藥系統(tǒng)的腫瘤新生血管靶向性，達(dá)到更有效、精確和安全治療的目的［17-18］。同時因為RGD與整合素配體競爭整合素受體，通過抑制相應(yīng)的信號傳導(dǎo)起到輔助治療作用，最大限度地提高殺滅乳腺癌細(xì)胞的作用［19-20］。

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Inhibitory Effect of RGD Modified B Nano Lipid Carrier on Breast Cancer Bearing Nude Mice

TANG Shu-jie，ZHAO Xu-wei，ZHANG Jia-qi，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（14）：029-032

Objective：To prepare RGD conjugated cucurbitacin B loaded liposome（RGD-CuB-NLC）and observe RGD-CuB-NLC's anti-cancer effect on the treatment with the cells of breast cancer in vitro and RGDCuB-NLC's anti-cancer effect on nude mice of human breast cancer.Method：The liposomes were prepared by thin film hydration method，a single cell suspension liquid of the MCF-7 cells of breast cancer was made according to the cultivation of the adherent cell method，then it was inoculated into 96 hole cell culture plate，the group of RGD-CuB-NLC was designed，the control groups were CuB-NLC，RGD-NLC and the blank group of NLC were designed，the rate of suppression in different condition were calculated.Nude mouse transplantation tumor were established，30 qualified nude mice models of human breast cancer xenograft were randomly divided into 5 groups，each group was 6，the mice of 5 groups were respectively treated by CuB，CuB-NLC，RGD-NLC，RGD-CuBNLC and 0.9% sodium chloride solution every 24 hours per time，7 times in total.The body weight of nude mice and the weight of the transplanted tumor growth were recorded，and the inhibition rate of tumor growth were calculated. Result：For RGD-CuB-NLC group，the form was the circular，the encapsulation rate＞80%，partical size was less than 150 nm，the average particle size was （115.6±2.1）nm，polydispersity index was （0.217±0.033），the electric potential was（-12.31±0.76）mV.The inhibition ratio of different liposome on breast cancer cells in the group of NLC was 0，the group of CuB-NLC was （46.3±2.21）%，the group of RGD-NLC was （55.7±3.22）%，the group of RGD-CuB-NLC was （75.6±5.67）%，the differences were statistically significant（P＜0.05）. In the inhibition rate of tumor growth，there were statistically significant in 0.9% sodium chloride solution group，CuB group，CuB-NLC group and RGD-NLC group compared with RGD-CuB-NLC group（P＜0.05）.There were statistically significant in CuB group，CuB-NLC group，RGD-NLC group and RGD-CuB-NLC group compared with 0.9% sodium chloride solution group in the inhibition rate of tumor growth（P＜0.05）.Conclusion：RGD conjugated cucurbitacin B loaded liposome can restrain the proliferation of breast cancer cells and the growth of tumor.

RGD peptide； Cucurbitacin B； Nanostructured lipid carriers； Cancer of breast；Antitumor

齊齊哈爾市科技局科學(xué)技術(shù)計劃項目（SFGG-201408）

①齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 黑龍江 齊齊哈爾161041

唐淑潔

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.007

2016-01-27） （本文編輯：李穎）