吳悠胡焱王瑤

齊墩果酸聯(lián)合二甲亞砜對生物膜中糞腸球菌抑菌作用研究*

吳悠①胡焱①王瑤②

目的：研究齊墩果酸聯(lián)合二甲亞砜對單一生物膜中糞腸球菌的抑菌效果。方法：（1）采用微量棋盤液體稀釋法測定齊墩果酸與二甲亞砜聯(lián)合抑菌濃度分?jǐn)?shù)指數(shù)（FICI）。（2）建立24 h糞腸球菌生物膜模型，隨機(jī)分為三組：1 mg/mL齊墩果酸+50%二甲亞砜（A組）、2%氯己定（B組）、去離子水（C組）。各組藥物分別作用30 min后熒光染色，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察染色情況及死、活菌數(shù)量變化。結(jié)果：（1）二甲亞砜和齊墩果酸對糞腸球菌的MIC分別20%和100 μg/mL。聯(lián)合時(shí)FICI=0.5125。（2）A組、B組生物膜中以死菌為主，僅見散在零星分布活菌，C組生物膜中以活菌為主，僅存在極少量死菌。結(jié)論：齊墩果酸與二甲亞砜聯(lián)合，對體外糞腸球菌的抗菌作用表現(xiàn)為相加作用，1 mg/mL齊墩果酸聯(lián)合50%二甲亞砜可有效抑制生物膜中糞腸球菌生長。

齊墩果酸； 二甲亞砜； 糞腸球菌； 激光共聚焦顯微鏡

First-author's address：Southwest Medical University，Luzhou 646000，China

糞腸球菌（Enterococcus faecalis，E.faecalis）具有超強(qiáng)的生存能力，在根管內(nèi)形成生物膜后，糞腸球菌可明顯增強(qiáng)抗力近1000倍，引起根管治療后再感染，或?qū)е码y治性根尖周炎的遷移不愈［1-4］。糞腸球菌耐藥性強(qiáng)，目前常用的根管消毒藥物對于抑制根管內(nèi)糞腸球菌生長的有效性、安全性尚不能達(dá)到較為理想的效果［5］。齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA）是五環(huán)三萜類化合物，普遍存在于多種天然植物中，毒性極低且具有良好的抑菌作用［6］。大量研究發(fā)現(xiàn)，OA能夠抑制多種口腔病原菌的生長，其中包括糞腸球菌。二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）是研究OA常用的賦形劑，其對生物膜的滲透作用好，且其本身也具有抗菌作用［7-10］。但以往在研究OA抑菌性能時(shí)并未考慮DMSO抗菌作用對其可能存在的影響。本研究將OA溶于DMSO，采用微量棋盤稀釋法、熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察研究兩種藥物聯(lián)合抑制浮游態(tài)糞腸球菌時(shí)的聯(lián)合藥敏效果，以彌補(bǔ)以往研究的不足之處；并研究其抑制單一生物膜中的糞腸球菌生長的有效性，探討其用于糞腸球菌感染根管治療的可能性。

1　材料與方法

1.1材料 糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATC29212（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室）；齊墩果酸（OA）分析純（綿陽東方源生物科技有限公司）；2%醋酸氯己定（Chlorhexidine，CHX）（上海麥克林生化科技有限公司）；二甲亞砜（DMSO）分析純（北京索萊寶科技有限公司）；吖啶橙（Acridine orange，AO）（Sigma，美國）；溴化乙錠（Ethidium bromide，EB）（Sigma，美國）；麥?zhǔn)媳葷醿x（Biomerieux SA，法國）；高壓蒸汽滅菌消毒器（松下健康醫(yī)療器械株式會社，日本）；YQX-II厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Confocal laser scanning microscope，CLSM）（Leica SP8，德國）。熒光染色液：避光條件下，AO、EB各1mg分別溶于10 mL蒸餾水中混勻，配制成為100 μg/ mL的儲備液，4 ℃避光儲存。使用時(shí)，1∶1混勻后1∶20稀釋，配制成工作液。

1.2藥敏實(shí)驗(yàn)

1.2.1菌株的復(fù)蘇活化 凍存管中糞腸球菌經(jīng)兩次傳代后，細(xì)菌進(jìn)入茁壯期。比濁儀調(diào)整菌液濃度至1.5×108CFU/mL，1∶100生理鹽水稀釋至1.5×106CFU/mL。

1.2.2測定DMSO、OA最小抑菌濃度值（MIC） 分別采用液體倍比稀釋法和瓊脂稀釋法測定DMSO 和OA的MIC值。最終DMSO濃度為80%、60%、40%、20%、10%、5%、2.5%，OA終濃度（μg/mL）為250、200、150、100、50、10。取100 μL菌懸液即刻接種搖勻，37 ℃厭氧條件下孵育培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)結(jié)束后肉眼觀察結(jié)果，無細(xì)菌生長或菌落生長被完全抑制的最低藥物濃度即為DMSO或OA的MIC。

1.2.3微量棋盤稀釋法 無菌96孔板中OA橫排加入，DMSO縱排加入。OA的終濃度（μg/mL）分別為 200、150、100、50、10、5、2.5、1.25，DMSO的終濃度分別為30%、25%、20%、15%、10%、5%。OA和DMSO按照濃度由高到低分別加入各孔100 μL。各孔加入菌懸液100 μL。第9列為陰性對照，A-F行每孔加入100 μL BHI培養(yǎng)基+100 μL菌懸液。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h后，觀察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4聯(lián)合用藥效果評價(jià) 根據(jù)聯(lián)合藥敏管與單獨(dú)藥敏管的抑菌情況，計(jì)算抑菌濃度分?jǐn)?shù)指數(shù)（FICI）。FICI=甲藥聯(lián)合時(shí)MIC/甲藥單獨(dú)時(shí)MIC+乙藥聯(lián)合時(shí)MIC/乙藥單獨(dú)時(shí)MIC。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)為協(xié)同作用，0.5＜FICI≤1時(shí)為相加作用，1＜FICI≤2時(shí)為無關(guān)作用，F(xiàn)ICI＞2時(shí)為拮抗作用。

1.3對糞腸球菌生物膜的作用

1.3.1糞腸球菌生物膜模型的建立 將20 mm×20 mm滅菌蓋玻片共12個放入6孔板，滴加500 μL菌懸液，37 ℃厭氧條件下靜置30 min，使細(xì)菌黏附于蓋玻片表面。30 min后，貼壁加入5mL BHI培養(yǎng)液，厭氧培養(yǎng)24 h，形成糞腸球菌生物膜。

1.3.2不同藥物處理糞腸球菌生物膜 吸凈培養(yǎng)液，用1 mL PBS緩沖液輕輕洗滌蓋玻片各3次，每次1 min，以除去蓋玻片表面浮游細(xì)菌。樣本隨機(jī)分為三組，每組4個：1 mg/mL OA+50%DMSO （A組）、2%CHX（B組）、去離子水（C組）。分別浸入預(yù)熱至37 ℃的各組藥液中，靜置30 min后吸凈藥液，再次用1 mL PBS輕輕洗滌蓋玻片3次，每次1 min。

1.3.3激光共聚焦顯微鏡觀察 避光條件下于生物膜表面滴加200 μL熒光染色液，暗室靜置孵育15 min，再用500 μL PBS緩沖液洗滌3次，每次1 min。觀察條件：AO最大激發(fā)波長405 nm，最大發(fā)射波長585 nm；EB最大激發(fā)波長488 nm，最大發(fā)射波長610 nm。各生物膜樣本由生物膜內(nèi)層向外層逐層掃描，步距2 μm。采集糞腸球菌生物膜中間層圖像。

2　結(jié)果

2.1聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 DMSO對糞腸球菌的MIC值為20%，OA對糞腸球菌的MIC值為100 μg/mL。采用微量棋盤稀釋法測得在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)MICDMSO=10%，MICOA=1.25 μg/mL。FICI=10/20+1.25/100=0.5125＞0.5，表明OA與DMSO聯(lián)合對糞腸球菌的聯(lián)合藥敏表現(xiàn)為相加作用。

2.2CLSM觀察結(jié)果 通過CLSM觀察，可見糞腸球菌生物膜具有一定的厚度。不同狀態(tài)的細(xì)菌呈現(xiàn)熒光顏色有差異：圖中白色為活菌發(fā)出的熒光，灰色即死菌發(fā)出的熒光。A組、B組生物膜疊加圖像細(xì)菌以灰色為主，有少量零星分布的白色細(xì)菌（活菌），且B組白色略少于A組（圖1～6），說明A、B組中糞腸球菌生物膜絕大部分由死菌構(gòu)成，僅少量活菌散在存在。C組生物膜疊加圖像呈現(xiàn)白色，圖中菌體幾乎全部為白色，僅可見極少量灰色（圖7～9），說明空白對照組中糞腸球菌生物膜幾乎全由活菌構(gòu)成。

圖1　A組疊加

圖2　A組活菌

圖3　A組死菌

圖4　B組疊加

圖5 B組活菌

圖6　B組死菌

圖7　C組疊加

圖8　C組活菌

圖9　C組死菌

3　討論

目前用于根管消毒的藥物主要包括氫氧化鈣、氯已定、酚醛類等。氫氧化鈣是根管消毒常用和首選藥物［11］。其可通過解離出大量羥基離子發(fā)揮其抗菌作用，但對于感染根管中的糞腸球菌缺乏足夠的抗菌能力［12］。此外，氫氧化鈣還具有一定的毒副作用。氯已定對多數(shù)細(xì)菌均具有抑菌效果，對于感染根管中的糞腸球菌的抗菌作用明顯［13］。但同時(shí)氯己定對根尖周的組織修復(fù)也有一定的負(fù)面影響：能夠影響蛋白質(zhì)合成，降低細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和長期生存能力，對成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞等均有一定毒性［14］。甲醛甲酚、樟腦酚也曾用于根管消毒，但因其均具有一定的細(xì)胞毒性、刺激性和半抗原性，因此臨床應(yīng)用已逐漸將其淘汰［15］。由此，亟需尋找一種更加安全，且能夠更加有效地抑制根管內(nèi)糞腸球菌生長的藥物，以期提高根管治療、再治療的成功率。

齊墩果酸（Oleanolic Acid，OA）作為一種純天然藥物，能夠從1620多種植物分離出來［16］。在我國，OA主要用于減輕急慢性肝炎患者肝臟的損傷，是臨床上治療急性黃膽型肝炎和慢性病毒性肝炎較為理想的藥物。隨著其藥理作用研究的不斷深入，OA在口腔疾病治療方面應(yīng)用也逐步發(fā)現(xiàn)。Scalon等［10］從三萜烯酸及其衍生物的構(gòu)效關(guān)系分析，通過在OA不同位點(diǎn)上增加羥基、羧基基團(tuán)產(chǎn)生多種衍生物，溶于10%DMSO后測定其對多種口腔病原菌（包括糞腸球菌）的MIC值，證明了三萜酸結(jié)構(gòu)上C-3位點(diǎn)上的羥基和C-17位點(diǎn)上的羧基是OA針對口腔病原體具有抗菌活性的重要基團(tuán)。因此，本研究選擇OA作為潛在的理想根管消毒藥物，原因在于：（1）OA是純天然提取物，來源廣泛，易于獲得且對機(jī)體安全無毒；（2）既往研究表明，OA對多種口腔病原菌具有抑菌作用，因此可考慮將其用于根管消毒，特別是抑制造成根管內(nèi)頑固性感染的糞腸球菌的生長；（3）OA臨床上用于急慢性肝炎的輔助治療，因此其可能是針對肝炎患者更為適合的根管消毒藥物。

以往關(guān)于OA的抑菌實(shí)驗(yàn)均未考慮二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）對OA抑菌作用的影響，只是單純地將DMSO作為OA的賦形劑，將OA直接溶于DMSO后，測定OA的抑菌作用［10，17］。本實(shí)驗(yàn)首次分別研究了DMSO和OA的抑菌效果及聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果，彌補(bǔ)了以往實(shí)驗(yàn)的不足之處。藥敏研究證明，DMSO可以作為OA的賦形劑，增加其在根管內(nèi)的滲透作用，有效抑制根管內(nèi)糞腸球菌生長。有臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，50%的DMSO和2.5%的雙氯芬酸聯(lián)合可明顯減輕根尖周炎疼痛、減少根管滲出，且患者對其耐受性良好，無一例出現(xiàn)副作用［18］。近年來美國FDA已批準(zhǔn)將45.5%的DMSO作為雙氯芬酸的賦形劑，治療膝部骨關(guān)節(jié)炎［19］。選擇OA濃度時(shí)主要考慮能有效抑菌且溶于DMSO未達(dá)飽和的較高濃度。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將用50%的DMSO與1 mg/mL的OA聯(lián)用。

激光共聚焦顯微鏡是目前觀察細(xì)菌生物膜較為理想的手段。只有來自聚焦平面的激光可透過顯微鏡檢測器前的小孔成像，且計(jì)算機(jī)可以通過對光信號逐點(diǎn)掃描后進(jìn)行處理，因此顯微鏡的分辨率明顯提高［20］。它可通過對細(xì)胞進(jìn)行逐層“光學(xué)切片”，在不破壞細(xì)菌原有結(jié)構(gòu)、最大限度保存生物膜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，迅速、直觀地獲得光學(xué)橫斷面圖像，可以有效避免掃描電鏡觀察前對樣本進(jìn)行脫水、干燥、固定、包埋等給細(xì)胞造成的損傷及對生物膜的破壞。由于其獨(dú)特的成像原理，CLSM在細(xì)菌生物膜的研究中具有顯著的優(yōu)勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1 mg/mL OA+50%DMSO與2%CHX處理糞腸球菌生物膜30 min后，均可有效破壞生物膜中絕大部分糞腸球菌活性。

綜上所述，OA聯(lián)合DMSO對體外糞腸球菌有相加的抑菌作用，1 mg/mL OA聯(lián)合50%DMSO對生物膜中糞腸球菌的抑菌效果明顯，可考慮作為再治療根管、難治性根尖周炎根管的消毒藥物。但其抗菌機(jī)制尚不完全明確，值得進(jìn)一步研究。

［1］王小勤，程小剛，趙春苗，等.再治療根管內(nèi)糞腸球菌的分離鑒定及其相關(guān)特性研究［J］.牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2012，22（5）：260-265.

［2］張榮德，董瑞紅，段彥盛，等.根管沖洗液對糞腸球菌作用的研究進(jìn)展［J］.國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2012，39（4）：516-518.

［3］陳少華.難治性根尖周炎的治療體會［J］. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（31）：104-106.

［4］ Nair P N.On the causes of persistent apical periodontitis：a review［J］.Int Endod J，2006，39（4）：249-281.

［5］趙珊.本院230株腸球菌的鑒定及耐藥性分析［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2011，8（10）：81-82.

［6］吳悠，張秋，王瑤.齊墩果酸的藥理作用機(jī)制及其在齲病治療中的研究進(jìn)展［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37（5）：544-546.

［7］ Cai L，Wu C D.Compounds from Syzygium aromaticum possessing growth inhibitory activity against oral pathogens ［J］.J Nat Prod，1996，59（10）：987-990.

［8］ Kozai K， Suzuki J，Okada M， et al.Effect of oleanolic acidcyclodextrin inclusion compounds on dental caries by in vitro experiment and rat-caries model［J］.Microbios，1999，97（388）：179-188.

［9］ Gnoatto S C，Dalla V L，Lencina C L，et al.Synthesis and preliminary evaluation of new ursolic and oleanolic acids derivatives as antileishmanial agents［J］.J Enzyme Inhib Med Chem，2008，23（5）：604-610.

［10］ Scalon Cunha L C，Andrade e Silva M L，Cardoso Furtado N A，et al.Antibacterial activity of triterpene acids and semi-synthetic derivatives against oral pathogens ［J］.Z Naturforsch C，2007，62 （9-10）：668-672.

［11］王俊.氫氧化鈣用于根管消毒的療效觀察［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7（25）：73-74.

［12］ Kim D，Kim E.Antimicrobial effect of calcium hydroxide as an intracanal medicament in root canal treatment：a literature review-Part I.In vitro studies［J］.Restor Dent Endod，2014，39 （4）：241-252.

［13］楊柳青，楊小軍，吳補(bǔ)領(lǐng)，等.不同根管沖洗液殘余藥量抑制糞腸球菌生物膜形成的研究［J］.口腔頜面修復(fù)學(xué)雜志，2012，13（6）：321-324.

［14］ Tsourounakis I，Palaiologou-Gallis A A，Stoute D，et al.Effect of essential oil and chlorhexidine mouthwashes on gingival fibroblast survival and migration［J］.J Periodontol，2013，84 （8）：1211-1220.

［15］李正猛.氫氧化鈣糊劑與傳統(tǒng)根管消毒劑用于根管消毒的臨床效果對比研究［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（34）：149-151.

［16］ Fukushima E O，Seki H，Ohyama K，et al.CYP716A subfamily members are multifunctional oxidases in triterpenoid biosynthesis［J］. Plant Cell Physiol，2011，52（12）：2050-2061.

［17］曾范利，于錄，葛發(fā)，等.MABA法與二倍稀釋法測定齊墩果酸體外抗結(jié)核菌活性［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（7）：22-25.

［18］王昆潤.二甲亞砜和雙氯芬酸并用治療根尖周炎［J］.國外醫(yī)學(xué)口腔醫(yī)分冊，1999，26（6）：365.

［19］ Marren K.Dimethyl sulfoxide：an effective penetration enhancer for topical administration of NSAIDs［J］.Phys Sportsmed，2011，39（3）：75-82.

［20］楊潔，牛際銘，杜敏，等.共焦顯微鏡下真菌菌絲形態(tài)的觀察分析［J］.中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2015，12（36）：44-47.

Study of Antibacterial Effect of Oleanolic Acid Combinating with Dimethyl Sulfoxide Against Enterococcus Faecalis in Biofilm

WU You，HU Yan，WANG Yao.//Medical Innovation of China，2016，13（14）：011-014

Objective：To evaluate the antibacterial effect of oleanolic acid（OA） and dimethyl sulfoxide （DMSO） against enterococcus faecalis （E.faecalis） in biofilm in vitro.Method：（1）The microscale checkerboard technique was applied to calculate the FICI value of OA combinating with DMSO.（2）E.faecalis biofilm models were formed after 24h. Samples were randomly divided into three groups：1 mg/mL OA+50% DMSO（group A），2% chlorhexidine（group B）， deionized water（group C）.Medicating in each groups for 30 min respectively. After fluorescent staining， samples were observed by CLSM.Result：（1）The MICs of DMSO and OA against E.faecalis were 20% and 100 μg/mL.FICI=0.5125 when they were combined.（2）The biofilms of group A and B were mainly composed of dead bacteria， only scattered living bacteria could be found.The biofilm of group C was mainly composed of living bacteria，only tiny dead bacteria could be detected. Conclusion：Additive joint action was existed between OA and DMSO against E.faecalis.1 mg/mL OA combinating with 50% DMSO can effectively remove the bacteria in biofilms.

Oleanolic acid； Dimethyl sulfoxide； Enterococcus faecalis； Confocal laser scanning microscope

2015年四川省教育廳科研計(jì)劃項(xiàng)目（15ZA0170）；四川省科技廳-瀘州市科技局-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合項(xiàng)目（LZLY-53）

①西南醫(yī)科大學(xué) 四川 瀘州 646000

②西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院

王瑤

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.14.003

2016-01-18） （本文編輯：蔡元元）