黃繼義　鐘鴻斌　逯富華　朱茂述廈門市第五醫(yī)院腎內(nèi)科，福建廈門　361000

腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的作用及機(jī)制

黃繼義鐘鴻斌逯富華朱茂述
廈門市第五醫(yī)院腎內(nèi)科，福建廈門361000

目的探討腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制。方法2015年6～12月期間，于本地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心選取60只健康雄性大鼠，根據(jù)處理方法的不同將其分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)，對(duì)照組則僅接受左側(cè)輸尿管游離，14 d后對(duì)兩組大鼠的左側(cè)腎臟中線粒體相關(guān)基因的表達(dá)情況、腎臟功能等參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1（1.87±0.17）、PGC1a （1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2（2.45±0.27）的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（1.07±0.23、1.11±0.29、1.05±0.32、1.14±0.35、1.17±0.14），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后14 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的COX（2.61±0.27）明顯高于對(duì)照組的（1.07±0.19），SOD較對(duì)照組明顯降低（0.55±0.16 vs 1.07±0.18），其RIF指數(shù)（22.76±1.39）明顯高于對(duì)照組的（0.81±0.16），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論在腎間質(zhì)纖維化中腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷發(fā)揮著十分重要的作用，缺氧所造成的線粒體氧化損傷會(huì)造成腎小管功能受損，引起大量致纖維因子的產(chǎn)生，并從多途徑引起腎間質(zhì)纖維化。

腎間質(zhì)纖維化；腎小管上皮細(xì)胞；線粒體氧化損傷；腎小管功能

［Abstract］Objective To discuss the effect andmechanism ofmitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis.M ethods A total of 60 healthmale ratswere selected from a local animal experimental center from June to December 2015 and divided into study group and control group.Rats in the study group were given left ureteral obstruction，while those in the control group were only given left ureteralmobilization.Parameters including the expression of genes in mitochondria and renal function of the left kidney were detected and analyzed after 14 days.Results At 14 d after surgery，the expression levels ofmtDNA（1.49±0.12），regenerating gene（1.87±0.17），interrupted gene（1.76±0.21），and fusion gene（2.49±0.24，2.45±0.27）in the study group were all significantly higher than those（1.07±0.23，1.11±0.29，1.05±0.32，1.14±0.35，and 1.17±0.14）in the control group（P＜0.05）.The level of COX （2.61±0.27）in kidney tissues in the study group was significantly higher than that（1.07±0.19）in the control group，while the level of SOD was significantly lower than the control group（0.55±0.16 vs 1.07±0.18）.The RIF index（22.76± 1.39）in the study group was significantly higher than that（0.81±0.16）in the control group（P＜0.05）.Conclusion Mitochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells has a significant effect on renal interstitial fibrosis.Mitochondria oxidative damage caused by anoxia may lead to functional impairment of kidney tubules，inducing a large number of fibrosis factors and resulting in renal interstitial fibrosis from multiple pathways.

［Key words］Renal interstitial fibrosis；Renal tubular epithelial cell；Mitochondria oxidative damage；Renal tubular function

絕大部分慢性腎臟疾病均存在腎間質(zhì)纖維化表現(xiàn)，如間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)和小管基底膜成分出現(xiàn)定量及定性改變、肌纖維母細(xì)胞聚集、腎小管萎縮等［1］。目前大量研究均指出，在腎小管基膜破壞過程中，患者多存在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞現(xiàn)象，繼而引起間質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大量細(xì)胞外基質(zhì)（engine controlmodule，ECM）沉積，引發(fā)腎小管萎縮，最終造成間質(zhì)纖維化病損［2，3］。本次研究在2015年6～12月期間通過建立大鼠模型，旨在探討腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷在腎間質(zhì)纖維化中的作用機(jī)制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料

選取21日齡SD雄性成年大鼠60只，由本地動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK2015-0002。將其隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組大鼠30只，平均體重（221.9±12.4）g，對(duì)照組大鼠30只，平均體重（216.7±13.5）g，兩組大鼠的日齡、體重等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中對(duì)照組接受左側(cè)輸尿管游離，實(shí)驗(yàn)組大鼠接受左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。

1.2方法

1.2.1模型制備方法 實(shí)驗(yàn)組：取10%水合氯醛（0.03 mL/kg）對(duì)大鼠行腹腔注射麻醉，在手術(shù)臺(tái)上對(duì)其行右側(cè)臥位固定，剪除體毛后對(duì)手術(shù)區(qū)進(jìn)行消毒，取左側(cè)腹切口，將皮膚、肌肉和腹壁各層逐層切開，使左側(cè)輸尿管暴露并對(duì)其進(jìn)行分離，使用5-0絲線對(duì)其進(jìn)行結(jié)扎并離斷輸尿管，逐層縫合完成手術(shù)。對(duì)照組大鼠僅對(duì)左側(cè)輸尿管進(jìn)行游離，但不進(jìn)行結(jié)扎和離斷。

1.2.2檢測(cè)方法術(shù)后14 d摘取兩組大鼠左側(cè)腎臟，并對(duì)其進(jìn)行處理，對(duì)下述指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)：①線粒體基因表達(dá)水平：采用Real-time PCR技術(shù)度兩組大鼠腎小管上皮細(xì)胞線粒體NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2和mtDNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)記錄；②超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、環(huán)氧酶（cyclo-oxygenase，COX）水平：采用Real-time PCR技術(shù)對(duì)兩組大鼠腎臟組織中的SOD和COX水平進(jìn)行檢測(cè)；③腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）指數(shù)：對(duì)大鼠腎臟組織進(jìn)行Masson染色，其中膠原纖維呈綠色，對(duì)其中綠色數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；④對(duì)兩組大鼠的腎組織羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量進(jìn)行比較。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間結(jié)果比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組大鼠線粒體基因表達(dá)水平比較

實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后14 d mtDNA（1.49±0.12）、NRF1 （1.87±0.17）、PGC1a（1.76±0.21）、Drp1（2.49±0.24）、Mfn2 （2.45±0.27）的表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的線粒體具有較高活性。見表1。

2.2兩組大鼠術(shù)后14 d腎臟指標(biāo)比較

術(shù)后14 d，實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟組織中的COX明顯高于對(duì)照組，SOD較對(duì)照組明顯降低，其RIF指數(shù)明顯高于對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組大鼠腎體比、腎臟Hyp含量均明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表1　兩組大鼠線粒體基因表達(dá)水平比較（±s）

表1　兩組大鼠線粒體基因表達(dá)水平比較（±s）

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表2　兩組大鼠術(shù)后14 d腎臟指標(biāo)比較（±s）

表2　兩組大鼠術(shù)后14 d腎臟指標(biāo)比較（±s）

COX　SOD　RIF指數(shù)　Hyp （μg/g）腎體比（mg/g）組別　n實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t值P值30 30 2.61±0.27 1.07±0.19 25.549 0.000 0.55±0.16 1.07±0.18 -11.826 0.000 22.76±1.39 0.81±0.16 80.227 0.000 481.79±25.40 411.54±31.75 9.463 0.000 10.71±0.37 7.49±0.42 31.509 0.000

3　討論

慢性腎臟疾病已成為嚴(yán)重威脅公眾健康的常見慢性疾病，此種患者多以腎纖維化作為病理基礎(chǔ)。Huising MO等［4］研究證實(shí)，在腎纖維化早期可采取有效措施促進(jìn)其逆轉(zhuǎn)，特別是對(duì)于腎間質(zhì)和腎小管而言，其具有自我修復(fù)功能，在一定程度上可促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化的逆轉(zhuǎn)。

腎間質(zhì)纖維化作為多種慢性腎臟疾病的終末期病例特點(diǎn)，在腎臟結(jié)構(gòu)破壞過程中具有十分重要的作用，會(huì)造成間質(zhì)毛細(xì)血管破壞、腎小管萎縮、成纖細(xì)胞增生和腎間質(zhì)中細(xì)胞外基質(zhì)的積聚［5-7］。相關(guān)資料顯示，腎間質(zhì)纖維化主要從以下四個(gè)方面實(shí)現(xiàn)：細(xì)胞損傷及活化、促炎因子和致纖維化因子產(chǎn)生、纖維化形成、腎臟結(jié)構(gòu)和功能喪失，在此過程中，腎小管上皮細(xì)胞損傷和功能不全占據(jù)著十分關(guān)鍵的位置［8，9］。臨床研究證實(shí)，缺氧性損傷會(huì)造成腎小管上皮細(xì)胞損傷，主要由于腎小管上皮細(xì)胞具有高溶轉(zhuǎn)運(yùn)活性特征，對(duì)于線粒體能量供給具有較高要求，缺氧會(huì)造成線粒體氧自由基產(chǎn)生增多，與線粒體膜結(jié)合造成其通透性改變［10-13］。從而引起細(xì)胞色素C由線粒體進(jìn)入細(xì)胞漿，引發(fā)細(xì)胞損傷途徑。左側(cè)輸尿管結(jié)扎會(huì)造成腎臟組織出現(xiàn)血流動(dòng)力學(xué)改變，引起組織發(fā)生缺氧缺血性損傷，從而導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生［14］。

在本研究中，通過對(duì)大鼠左側(cè)輸尿管進(jìn)行結(jié)扎以模擬腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷，通過對(duì)兩組小鼠腎臟組織中線粒體的基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠的mtDNA、NRF1、PGC1a、Drp1、Mfn2表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），提示在實(shí)驗(yàn)組大鼠中存在顯著的腎臟線粒體活性增強(qiáng)表現(xiàn)，表明模型建立成功。

腎間質(zhì)纖維化的形成機(jī)制較為復(fù)雜，以ECM積聚和腎間質(zhì)纖維細(xì)胞增生為主要病理特征。SOD、COX作為表征腎小管上皮細(xì)胞活性的主要指標(biāo)，在發(fā)生腎小管損傷時(shí)，COX和SOD水平會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)變化。在本研究中，術(shù)后14 d實(shí)驗(yàn)組大鼠的SOD水平明顯低于對(duì)照組，COX則明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），表明實(shí)驗(yàn)組大鼠存在十分顯著的腎小管上皮細(xì)胞損傷，結(jié)合線粒體基因表達(dá)情況，提示缺氧所造成的線粒體氧化損傷同腎小管上皮細(xì)胞損傷之間存在密切聯(lián)系。其中，氧化損傷所引起的腎小管上皮細(xì)胞損傷會(huì)造成大量致纖維因子的產(chǎn)生，引起ECM產(chǎn)生和降解失衡，從而在腎間質(zhì)中出現(xiàn)大量ECM沉積，造成患者腎小管萎縮和腎功能減退。在眾多致纖維化因子中，以TGF-β1作用最為顯著。Jelakovic B等［15］研究指出，腎間質(zhì)中的TGF-β1因子主要來源于肌纖維母細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，在本次研究中，腎臟組織Masson染色試驗(yàn)證實(shí)，在實(shí)驗(yàn)組大鼠中存在明顯腎間質(zhì)纖維化表現(xiàn)，再次證實(shí)缺氧損傷會(huì)誘發(fā)腎間質(zhì)纖維化。同時(shí)對(duì)兩組大鼠的腎臟發(fā)育情況進(jìn)行分析顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠的腎體比、腎臟Hyp含量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），與相關(guān)報(bào)道中的結(jié)論基本一致。

綜上所述，本次研究從腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷研究入手，對(duì)腎小管解離在腎間質(zhì)纖維化中的作用進(jìn)行分析，創(chuàng)新性從線粒體動(dòng)力平衡、功能等方面對(duì)線粒體損傷同TGF-β1致纖維因子之間的關(guān)系進(jìn)行探討。在腎間質(zhì)纖維化中腎小管上皮細(xì)胞線粒體氧化損傷發(fā)揮著十分重要的作用，缺氧所造成的線粒體氧化損傷會(huì)造成腎小管功能受損，引起大量致纖維因子的產(chǎn)生，并從多途徑引起腎間質(zhì)的纖維化。

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Effect and mechanism of m itochondria oxidative damage in renal tubular epithelial cells on renal interstitial fibrosis

HUANG Jiyi ZHONG HongbinLU Fuhua ZHU Maoshu
Department of Nephrology，Xiamen Fifth Hospital，Xiamen361000，China

R692

A

1673-9701（2016）20-0032-03

福建省廈門市科技惠民項(xiàng)目（3502Z20144068）

2016-05-06）