陳春麗　王慧琴　劉新梅康曉靜　吳衛(wèi)東

51例新疆尋常型銀屑病患者皮損中FOXP1和hMSH2的表達

陳春麗1王慧琴2#劉新梅1康曉靜1吳衛(wèi)東2

目的： 檢測新疆尋常型銀屑?。≒V）患者皮損中FOXP1和hMSH2的表達。方法： EnVision免疫組化法分別檢測51例新疆PV患者皮損及29例正常人皮膚組織中FOXP1和hMSH2的表達。結(jié)果： FOXP1和hMSH2在PV皮損中的陽性表達率（92.16%，94.12%）均高于正常人皮膚組織（65.52%，55.17%），差異有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論： FOXP1和hMSH2可能與尋常型銀屑病的發(fā)病有關(guān)。

尋常型銀屑??； FOXP1； hMSH2

銀屑病是多基因遺傳背景下由異?；罨腡細胞介導(dǎo)的炎癥性過度增殖性自身免疫性疾病，主要和環(huán)境、細胞免疫、表觀遺傳等有關(guān)。越來越多的研究證明1MiRNA通過與靶蛋白信使RNA的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因的表達，從而參與銀屑病的發(fā)病過程［1］。本課題組前期研究證實MiR-34a和MiR-21在新疆尋常型銀屑?。≒V）皮損中的表達均高于正常皮膚組織，本實驗旨在研究其相應(yīng)的靶蛋白FOXP1和hMSH2在上述兩種組織中的表達。

1　對象和方法

1.1研究對象 51例病例均來自2013年1月至2015年1月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科就診的PV患者，其中男23例，女28例，年齡7～76歲，平均（32.98±15.58）歲。29例正常人皮膚組織來自泌尿外科和整形外科手術(shù)切除多余的皮膚組織，其中男14例，女15例，年齡5～43歲，平均（21.97±14.32）歲。

1.2實驗標本的選擇 所有患者均具有典型皮損，并經(jīng)組織病理確診。取材前3個月未系統(tǒng)使用過維A酸類、糖皮質(zhì)激素及免疫調(diào)節(jié)劑治療；停止光療及外用藥物治療至少1個月；不伴有其他免疫性及腫瘤性疾病；女性患者排除妊娠、哺乳及月經(jīng)期。對照組排除自身免疫性、遺傳性疾病，無銀屑病家族史。本研究獲新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.3主要試劑 兔抗人FOXP1單克隆抗體、鼠抗人hMSH2單克隆抗體、兔通用型二抗試劑盒（PV-6000）、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4實驗方法

1.4.1EnVision法染色 4 μL厚切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精濃度脫蠟至水，pH值9.0的EDTA抗原修復(fù)液中高壓修復(fù)，放涼后3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，滴加一抗（FOXP1稀釋濃度為1∶200，hMSH2稀釋濃度為1∶100），同時用已知表達陽性組織作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗為陰性對照，4℃冰箱過夜，復(fù)溫45 min后滴加DAB顯色液2～3 min（根據(jù)顯微鏡下觀察適時終止染色），蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、脫水、封片。

1.4.2陽性結(jié)果判定及標準 POXP1及hMSH2陽性顯色主要為表皮細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，單純胞漿著色為陰性細胞。由兩名副高級職稱病理醫(yī)師進行獨立雙盲評分。每張病理切片隨機選取5個光學(xué)顯微鏡高倍視野（×400），根據(jù)著色陽性細胞百分數(shù)和著色深度進行半定量分級，結(jié)果取平均值：著色陽性細胞占計數(shù)細胞數(shù)的百分數(shù)＜50%為0分、50%～75%為1分、＞75%為2分；未著色為0分，淺黃色為1分，棕色為2分，棕褐色為3分。兩者得分的乘積為總評分，評分≥2分者判為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，所得數(shù)據(jù)采用X2檢驗和Spearman相關(guān)分析，檢驗水準α=0.01。

圖1　1a：FOXP1在尋常型銀屑病中為表皮全層表達（EnVision法，×100）；1b：FOXP1在正常皮膚組織中主要為表皮基底層和棘層表達（EnVision法，×100）

2　結(jié)果

2.1FOXP1在PV患者皮損和正常皮膚組織中的表達情況 FOXP1在PV組陽性表達率為92.16%（47/ 51），主要在表皮全層中；正常皮膚組陽性表達率為65.52%（19/29），主要在表皮基底層和棘層中，兩組經(jīng)四格表檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（X2=9.087，P＜0.01）見圖1。

2.2hMSH2在PV患者皮損和正常皮膚組織中的表達情況 見圖2。hMSH2在PV組陽性表達率為94.12%（48/51），主要在表皮全層中；正常皮膚組陽性表達率為55.17% （16/29），主要在表皮基底層和棘層中，兩組經(jīng)四格表檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（X2= 17.525，P＜0.01）。

圖2　2a：hMSH2在尋常型銀屑病中為表皮全層表達（EnVision法，×100）；2b：hMSH2在正常皮膚組織中主要為表皮基底層和棘層表達（EnVision法，×100）

2.3FOXP1和hMSH2在PV患者皮損中表達的關(guān)系

FOXP1表達陽性的47例PV患者中，hMSH2表達陽性44例（93.62%）；FOXP1表達陰性的4例PV患者hMSH2表達全部陽性；FOXP1和hMSH2的一致表達率為86.27%。兩者經(jīng)Spearman相關(guān)分析，F(xiàn)OXP1 和hMSH2在PV中的表達無相關(guān)性（r=-0.073，P= 0.611）。

3　討論

叉頭框蛋白（Forkhead box，F(xiàn)OX）是一類以具有叉頭螺旋結(jié)構(gòu)為特征、進化保守的轉(zhuǎn)錄因子家族，具有細胞周期調(diào)控、機體老化和免疫調(diào)節(jié)等作用［2］。目前將FOX蛋白分為17類，分別命名為FOXA～Q。FOXP1對免疫系統(tǒng)的細胞發(fā)育和功能具有重要調(diào)控作用，在免疫系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用［3］。FOXP1與調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）的發(fā)育及生物學(xué)功能發(fā)揮具有密切關(guān)系，F(xiàn)OXP1缺失的Treg細胞可抑制CD4+T細胞產(chǎn)生 IFN-γ［4］，而在銀屑病皮損中CD4+CD25+Treg細胞的數(shù)量較自身未受累皮膚及正常皮膚顯著增多，且與疾病的嚴重程度呈正相關(guān)［5］。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的另一轉(zhuǎn)錄因子FOXP3受MiR-210的靶向調(diào)節(jié)可以誘發(fā)免疫功能紊亂，從而參與尋常型銀屑病的發(fā)生發(fā)展［6］，而分子生物學(xué)研究表明FOXP3可與FOXP1通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域相互作用，兩者在疾病的發(fā)生中可能起協(xié)同作用。此外，F(xiàn)OXP1在皮膚基底細胞癌中的陽性表達率顯著高于癌旁正常皮膚組織［7］，而銀屑病皮損中的角質(zhì)形成細胞細胞周期比正常細胞縮短，這與腫瘤的發(fā)生有著異曲同工之處。黃莉?qū)幍龋?］通過Western blot法檢測出FOXO1的磷酸化水平在尋常型銀屑病皮損中增高，導(dǎo)致下游效應(yīng)分子的表達異常，使得角質(zhì)形成細胞出現(xiàn)過度增殖。由以上證據(jù)推測，F(xiàn)OXP1也可能參與了尋常型銀屑病的發(fā)病機制。

DNA錯配修復(fù)基因（mismatch repair gene，MMR）的功能主要是消除DNA復(fù)制過程中由于DNA聚合酶滑動而引起的插入-缺失環(huán)的形成和堿基-堿基錯配，從而對DNA復(fù)制、重組過程中發(fā)生的錯誤進行監(jiān)測、校正和修復(fù)。人mut S同種組蛋白2（human mut S homolog 2，hMSH2）是第一個被分離的人類MMR基因，它在DNA錯配修復(fù)過程中起主要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在多種皮膚腫瘤中如皮膚惡性黑素瘤、Bowen病等均存在錯配修復(fù)系統(tǒng)的異常［9，10］，啟動子甲基化是導(dǎo)致hMSH2錯配修復(fù)功能缺陷的原因之一［11，12］。在急性淋巴細胞白血病患者的細胞系中，hMSH2過表達可以抑制細胞生長和誘導(dǎo)細胞凋亡［12］。Seifert等利用小干擾RNA技術(shù)證明在人類黑素細胞中，hMSH2參與調(diào)控由UVB輻射誘導(dǎo)的細胞周期調(diào)控和細胞凋亡［13］。還有學(xué)者證明只有不成熟的復(fù)制活躍的細胞，才需要hMSH2的不斷糾錯，并且這種作用貫穿于整個細胞周期［14］。本實驗中hMSH2在銀屑病中過表達，可能是由于銀屑病皮損中角質(zhì)形成細胞過度增生和異常分化，導(dǎo)致堿基錯配不斷增加，細胞修復(fù)系統(tǒng)被激活，出現(xiàn)hMSH2代償性增高。

越來越多的研究證實miRNA的異常表達在銀屑病的發(fā)病機制中起重要作用。課題組前期通過實時熒光定量PCR實驗證實MiR-34a和MiR-21在新疆尋常型銀屑病皮損中的表達均高于正常皮膚組織，又通過miRwalk靶基因預(yù)測軟件（預(yù)測網(wǎng)址為 www. umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk）得出MiR-34a和MiR-21的靶基因之一分別是FOXP1和hMSH2。本研究中通過免疫組化法得出FOXP1和hMSH2在新疆PV皮損中的陽性表達率均高于正常皮膚組織，兩組差異具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義（X2=9.087，17.525，均P＜0.01），提示MiR-34a和MiR-21通過調(diào)控各自靶基因FOXP1和hMSH2在銀屑病的發(fā)病中發(fā)揮作用，其機制可能為MiR-34a的過度表達靶向上調(diào)FOXP1，導(dǎo)致銀屑病中Treg細胞增多、炎性細胞因子IFN-γ等分泌增加，從而形成銀屑病特征性炎性皮損；或hMSH2受MiR-21靶向調(diào)控后致啟動子區(qū)高甲基化，使hMSH2錯配修復(fù)功能紊亂，從而導(dǎo)致銀屑病中角質(zhì)形成細胞的增殖異常，異常分化的角質(zhì)形成細胞又反過來激活hMSH2的功能，形成惡性循環(huán)。本研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP1和hMSH2在新疆PV患者皮損中的表達無相關(guān)性（r=-0.73，P＞0.01），表明FOXP1和hMSH2在促進銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用可能是獨立的。但以上實驗結(jié)論需大樣本進一步驗證，F(xiàn)OXP1和hMSH2在銀屑病的發(fā)病過程中還有哪些途徑也尚需進一步研究。

［1］Kong YW，Cannell IG，de Moor CH，et al.The mechanism of micro-RNA-mediated translation repression is determined by the promoter of the target gene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（26）：8866-8871.

［2］Benayoun BA，Caburet S，Veitia RA.Forkhead transcription factors：key players in health and disease［J］.Trends Genet，2011，27（6）：224-232.

［3］胡曉玉，馮曉明.轉(zhuǎn)錄因子Foxp1在免疫系統(tǒng)中的作用研究進展［J］.免疫學(xué)雜志，2015，31（6）：533-536.

［4］Feng X，Ippolito GC，Tian L，et al.Foxp1 is an essential transcriptional regulator for the generation of quiescent naive T cells during thymocyte development［J］.Blood，2010，115 （3）：510-518.

［5］Zhang L，Yang XQ，Cheng J，et al.Increased Th17 cells are accompanied by FoxP3（+）Treg cell accumulation and correlated with psoriasis disease severity［J］.Clin Immunol，2010，135（1）：108-117.

［6］Zhao M，Wang LT，Liang GP，et al.Up-regulation of microRNA-210 induces immune dysfunction via targeting FOXP3 in CD4（+）T cells of psoriasis vulgaris［J］.Clin Immunol，2014，150（1）：22-30.

［7］呂明芬，黃卡特，李秉煦，等.Foxpl及Ki-67在皮膚基底細胞癌的表達［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2011，27（5）：311-313.

［8］黃莉?qū)?，薛汝增，羅光浦，等.p-Akt、p-FoxO1在尋常型銀屑病皮損中的表達［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2014，30 （12）：737-739.

［9］Reichrath J，Rass K.Ultraviolet damage，DNA repair and vitamin D in nonmelanoma skin cancer and in malignant melanoma：an update［J］.Adv Exp Med Biol，2014，810：208-233.

［10］張躍，袁偉，賈常莎.鮑溫病HPV分型和hMLH1，hMSH2蛋白的檢測［J］.中國皮膚性病學(xué)雜志，2014，28（1）：11-14.

［11］Tzao C，Hsu HS，Sun GH，et al.Promoter methylation of the hMLH1 gene and protein expression of human mutL homolog 1 and human mutS homolog 2 in resected esophageal squamous cell carcinoma［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2005，130（5）：1371.

［12］Wang CX，Wang X，Liu HB，et al.Aberrant DNA methylation and epigenetic inactivation of hMSH2 decrease overall survival of acute lymphoblastic leukemia patients via modulating cell cycle and apoptosis［J］.Asian Pac J Cancer Prev，2014，15（1）：355-362.

［13］Seifert M，Scherer SJ，Edelmann W，et al.The DNA-mismatch repair enzyme hMSH2 modulates UV-B-induced cell cycle arrest and apoptosis in melanoma cells［J］.J Invest Dermatol，2008，128（1）：203-213.

［14］Leach FS，Polyak K，Burrell M，et al.Expression of the human mismatch repair gene hMSH2 in normal and neoplastic tissues［J］.Cancer Res，1996，56（2）：235-240.

（收稿：2015-06-28 修回：2015-07-26）

Expression of FOXP1 and hMSH2 in patients with psoriasis vulgaris in Xinjiang region

CHEN Chunli1，WANG Huiqin2，LIU Xinmei1，KANG Xiaojing1，WU Weidong2.
1.Department of Dermatology and Venereology，People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China；2.The Center of Clinical Research，People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830001，China Corresponding author：WU Weidong，E-mail：xjwudong@126.com

Objective：To detect the expression level of FOXP1 and hMSH2 in the lesions of patients with psoriasis vulgaris in Xinjiang region.Methods：The level of FOXP1 and hMSH2 was detected by EnVision immunohistochemistry method in the lesions of 51 patients with psoriasis vulgaris and normal skin of 29 healthy controls.Results：The level of FOXP1 and hMSH2 in lesions was 92.16%and 94.12%which was higher than those in the normal skin（65.52%and 55.17%），with significant differences（P＜0.01）.Conclusion：FOXP1 and hMSH2 may be associated with the onset of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；FOXP1；hMSH2

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號：2015211C201）

1新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科，烏魯木齊，830001

2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊，830001

吳衛(wèi)東，E-mail：xjwudong@126.com#并列第一作者