段先哲　李　南*　譚凱旋　謝焱石　陳　亮　胡　楊　馮志剛　韓世禮　馬　強(qiáng)

(1. 南華大學(xué)，衡陽 421001; 2. 湖南省核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽 421001)

?

正相高效液相色譜法測定L-蘋果酸中的對映異構(gòu)體D-蘋果酸

段先哲1,2李南1,2*譚凱旋1謝焱石1陳亮1胡楊1馮志剛1韓世禮1馬強(qiáng)1

(1. 南華大學(xué)，衡陽 421001; 2. 湖南省核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，衡陽 421001)

建立了測定L-蘋果酸中對映異構(gòu)體D-蘋果酸的的正相高效液相色譜檢測方法。色譜柱為手性色譜柱CHIRALPAK-IC(4.6×250mm；5μm)，流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速為0.5mL/min，進(jìn)樣量為100μL，檢測波長為210nm，柱溫為35℃。系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)中L-蘋果酸和D-蘋果酸的理論塔板數(shù)大于5000，L-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.9。此方法檢測L-蘋果酸中的D-蘋果酸敏度高，分離度良好。溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，在24小時內(nèi)測定D-蘋果酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.78%，溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度實(shí)驗(yàn)中6次重復(fù)進(jìn)樣D-蘋果酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.59%，精密度良好。L-蘋果酸的檢出限為0.22ng。該方法可用于分離L-蘋果酸及其對映異構(gòu)體D-蘋果酸。

L-蘋果酸對映異構(gòu)體D-蘋果酸正相高效液相色譜法

蘋果酸，又名2-羥基丁二酸，有兩種對映異構(gòu)體，即D-蘋果酸和L-蘋果酸。大自然中，蘋果酸以3種形式存在，即D-蘋果酸、L-蘋果酸及其混合物DL-蘋果酸。L-蘋果酸會在人體中自然產(chǎn)生并具有生物活性，是人體一種必須的有機(jī)酸，作為性能優(yōu)異的食品添加劑和功能性食品廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中；D-蘋果酸的生理活性低，生物體內(nèi)積累過量的 D-蘋果酸時會產(chǎn)生病變[1]；美國糧食和藥物管理局(FDA)規(guī)定DL-蘋果酸不能用于嬰兒食品添加劑[2]。在醫(yī)藥行業(yè)，蘋果酸常作為一種藥物成分添加在一些藥物制劑中，能明顯提高藥物主要成分的吸收率；蘋果酸還可以治療肝病、貧血、免疫力低下等多種疾病；在藥物研究中蘋果酸作為一種藥物成分，就必須嚴(yán)格控制其本身帶來的其它雜質(zhì)，必須嚴(yán)格控制D-蘋果酸的限度，所以對L-蘋果酸及其中的D-蘋果酸的測定方法的研究具有重大意義。目前國內(nèi)對蘋果酸含量測定的方法有酶法[2]、生物傳感器法[3]、雙波長分光光度法[4]、離子色譜法[5-8]、氣相色譜法[9，10]、毛細(xì)管電泳法[11，12]和高效液相色譜法[13-22]等方法。酶法雖操作簡易，但由于催化反應(yīng)的酶本身特異性不高，易于催化其它底物，使測定結(jié)果產(chǎn)生較大誤差。生物傳感器法，需要制作兩種電極，并且需要分別測定D-蘋果酸和L-蘋果酸，操作比較繁瑣。其它方法對蘋果酸的測定都只是針對D-蘋果酸和L-蘋果酸混合物的含量測定，并不能有效區(qū)分這兩種異構(gòu)體。而本研究通過采用手性色譜柱CHIRALPAK-IC和對分析方法的優(yōu)化所建立的正相高效液相色譜法，是一種分離并測定L-蘋果酸及其對映異構(gòu)體D-蘋果酸的準(zhǔn)確、靈敏、高效、便捷的方法。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

島津HPLC-2010C ；CPA225D型電子天平(賽多利斯)。

L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)；DL-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)； L-蘋果酸原料(中照力德化工有限公司；含量：99.31%)。

1.2色譜條件

色譜柱CHIRALPAK-IC (4.6×250mm；5μm)；進(jìn)樣量100μL ； 測定波長210nm ；柱溫：35oC；流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1；流速0.5mL/min。

1.3溶液的配制

稱取一定量的DL-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品加流動相配制成濃度為1mg/mL的DL-蘋果酸溶液；稱取一定量的L-蘋果酸原料加流動相配制成濃度為1mg/mL的L-蘋果酸供試溶液；取L-蘋果酸供試溶液用流動相稀釋100倍，得到其1%自身對照溶液。D-蘋果酸含量按照1%自身對照計(jì)算，其計(jì)算公式為：D-蘋果酸含量(%)=A1/A2(注：A1為供試液中D-蘋果酸峰面積，A2為1%自身對照溶液中L-蘋果酸峰面積)。

2　結(jié)果與討論

2.1檢測波長的選擇

用紫外分光光度計(jì)對L-蘋果酸溶液和DL-蘋果酸溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，最大吸收波長為210nm，所以確定檢測波長為210nm。

2.2色譜條件的優(yōu)化

取上述DL-蘋果酸溶液按照上述色譜條件進(jìn)行測定，對比了各條件下D-蘋果酸和L-蘋果酸的保留時間和分離情況，見表1。流速變化測定結(jié)果比較表明，流速越高，D-蘋果酸和L-蘋果酸保留時間越短，色譜柱壓力越大，在流速為1.0mL/min時色譜柱壓力為3.4MPa，其值較高，所以為了延長色譜柱的壽命，選擇流速為0.5mL/min。通過調(diào)整流動相三相的比例得知，異丙醇濃度越大，保留時間越短，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度越小，當(dāng)流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=90∶10∶0.1時，保留時間太長；當(dāng)流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=70∶30∶0.1時，保留時間太短，D-蘋果酸和L-蘋果酸的出峰時間間隔太短，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6；當(dāng)流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1時，保留時間合適， D-蘋果酸峰無雜質(zhì)干擾，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為3.2，分離度良好；取L-蘋果酸供試液進(jìn)行測定，進(jìn)樣量50μL和100μL對比結(jié)果顯示，100μL時，D-蘋果酸峰高比較合適。所以最終確定的色譜條件：進(jìn)樣量100uL， 測定波長210nm，柱溫35℃，流動相為正己烷∶異丙醇∶三氟乙酸=80∶20∶0.1，流速0.5mL/min。

表1　色譜條件的優(yōu)化

2.3系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取空白溶劑、L-蘋果酸供試溶液在上述色譜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，空白溶劑對樣品測定不產(chǎn)生干擾，L-蘋果酸的保留時間為11.90min，D-蘋果酸的保留時間為13.52min， L-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.6，D-蘋果酸與相鄰峰的分離度為2.9，理論塔板數(shù)大于5000，此方法檢測L-蘋果酸中的D-蘋果酸敏度高，分離度良好。

表2　方法的系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

2.4溶液穩(wěn)定性

配制1mg/mL L-蘋果酸供試溶液、1%自身對照溶液，按照上述色譜方法分別在0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h進(jìn)樣，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，在24小時內(nèi)測定D-蘋果酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.78%，溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

表3　溶液穩(wěn)定性結(jié)果

注：A為峰面積

2.5精密度

配制1mg/mL L-蘋果酸供試溶液、1%自身對照溶液，按照上述色譜方法重復(fù)進(jìn)樣6針，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，6次重復(fù)進(jìn)樣D-蘋果酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.59%，精密度良好。

表4　精密度結(jié)果

注：A為峰面積

2.6方法的檢出限

配制1mg/mL的L-蘋果酸供試溶液，按照上述色譜方法，不斷的稀釋進(jìn)樣，當(dāng)信噪比S/N為3時，即為L-蘋果酸的檢出限，經(jīng)計(jì)算得出檢出限為0.22ng。

3　結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種簡單有效的測定L-蘋果酸中的其對映異構(gòu)體D-蘋果酸的檢測方法。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)說明此方法檢測L-蘋果酸中的D-蘋果酸靈敏度高，分離度良好。溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，在24小時內(nèi)測定D-蘋果酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.78，溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度實(shí)驗(yàn)中6次重復(fù)進(jìn)樣D-蘋果酸含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.59，精密度良好。L-蘋果酸的檢出限為0.22ng。該方法簡便、快速、有效、靈敏、具有良好的精密度，可作為L-蘋果酸中的對映異構(gòu)體D-蘋果酸的定量分析方法。

[1]Fabio C，Umberto S，Claudio R. Optimization of the determination of organic acids and sugars in fruit juices by ion-exclusion liquid chromatography [J]. Journal of Food Compo and Anal.，2005，18(3)：121-130.

[2] 吳清平, 周小燕. L-蘋果酸研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào), 1990, (1):30-33.

[3]蔣宏偉, 李建華, 姚敏杰,等. D-蘋果酸快速檢測方法的研究[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009, (3):32-34.

[4]干 寧, 葛從辛. 無試劑二氧化鈦凝膠酶傳感器檢測蘋果酸對映異構(gòu)體研究[J].中國食品學(xué)報(bào)，2006,6(6):105-111.

[5]徐志利, 勞瑞珍,鄧兆勇,等. 雙波長分光光度法測定心臟基礎(chǔ)液中L-蘋果酸的含量[J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)[J], 1997, 13 (4): 240-241.

[6]朱巖, 徐素君, 王素芬.不完全抑制電導(dǎo)檢測離子色譜法測定飲料中的蘋果酸[J]. 分析化學(xué)研究簡報(bào),1999, 27(9):1050-1053.

[7]吳玉萍, 宋春滿, 雷麗萍,等. 梯度淋洗離子色譜法測定煙草中的蘋果酸、檸檬酸和陰離子[J]. 分析試驗(yàn)室,2006, 25(7):31-34.

[8]王海藍(lán),李雪萍,陳維信. 離子色譜法測定貯藏期間菠蘿果實(shí)的有機(jī)酸變化[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2010,31(10):1720-1725.

[9]閆巍, 焦霞, 葉明立,等. 離子色譜法測定威力酸中的有機(jī)酸[J]. 分析試驗(yàn)室,2008, 27(2):38-40.

[10]施豐成, 鄧發(fā)達(dá), 朱立軍,等. 烤煙中草酸、蘋果酸和檸檬酸含量的分析研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào), 2010,16(1):6-10.

[11] 羅 瓊, 薛 冬, 楊 俊,等. 不同卷煙和煙葉中主要非揮發(fā)性有機(jī)酸含量的差異[J]. 煙草科技, 2009, (12):33-37.

[12]姚玉新, 翟 衡, 趙玲玲,等. 蘋果果實(shí)酸/低酸性狀的SSR分析[J]. 園藝學(xué)報(bào), 2006, 33 (2): 244-248.

[13]孔紅星, 劉正西, 李利軍. 高效毛細(xì)管電泳—直接紫外檢測法的應(yīng)用研究[J]. 廣西工學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 14(2):31-33.

[14]陸敏, 李路華, 馮俊霞,等. 高效液相色譜法同時測定常見水果中的四種有機(jī)酸[J].食品工業(yè)科技, 2009, 30(7):312-316.

[15]李康樂，吳梧桐， 宋祥珍，等. 高效液相色譜法同時測定藥用蘋果酸中的馬來酸與富馬酸[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 1994, 25(2): 106-108.

[16]李昌曉,鐘章成,陶建平, 不同水分條件下池杉幼苗根系的蘋果酸、莽草酸含量及生物量[J]. 林業(yè)科學(xué), 2008, 44(10):1-7.

[17]陳發(fā)興,劉星輝, 陳立松. 枇杷果肉有機(jī)酸組分及有機(jī)酸在果實(shí)內(nèi)的分布[J]. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2008, 16(3): 236-243.

[18]唐慧慧,蔡清宇,毛 翼. HPLC法測定凈烏梅及烏梅炭中檸檬酸和蘋果酸的含量[J]. 中藥材, 2007, 30(1):52-54.

[19]任建武,王 雁,彭鎮(zhèn)華,等. 3種石斛葉片蘋果酸含量日變化動態(tài)研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 32(3): 547 -552.

[20]呂兆林,林西,鄧文紅,等. HPLC法測定蘋果灑中蘋果酸及乳酸含量[J]. 精細(xì)與專用化學(xué)品, 2012, 20(1):9-13.

[21]羅陽, 賀曉光, 楊 軍, 等.HPLC法測定賀蘭山東麓釀酒葡萄中蘋果酸含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(33):20541-20542.

[22]張 聰, 金德慶, 張繼全. RP-HPLC法測定不同產(chǎn)地山茱萸中沒食子酸與蘋果酸的含量[J]. 上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 18(3):33-35.

Determination of enantiomer D-malic acid in L-malic acid by normal-phase high performance liquid chromatography.

Duan Xianzhe1,2, Li Nan1, 2*, Tan Kaixuan1, Xie Yanshi1, Chen Liang1, Hu Yang1, Feng Zhigang1,Han Shili1, Ma Qiang1

(1.UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China; 2.CooperativeInnovationCenterforNuclearFuelCycleTechnologyandEquipment,Hengyang421001,China)

The chromatographic column was CHIRALPAK-IC ( 4.6×250mm；5um)；the mobie phase was N-hexane∶isopropyl alcohol∶trifluoroacetic acid (80:20:0.1), the flow rate was 0.5ml/min, the injection volume was 100μL, the detection wavelength was at 210 nm, and the column temperature was 35℃. In the suitability experiment, the theoretical plate number of L-malic and D-malic acids were more than 5000, the resolution between L-malic acid and its adjacent peak was 2.6, and the resolution between D-malic acid and its adjacent peak was 2.9, indicating that this method had a high sensitivity and good resolution. In the solution stability experiment, the relative standard deviation of D-malic acid concentration was 5.78% within 24 hours, demonstrating that the solution was stable within 24 hours. In the precision experiment, the relative standard deviation of the D-malic acid concentrations in six repeated sampling was 3.59%, showing a satisfactory precision of this method. The detection limit of L-malic acid was 0.22ng. This method could be used for quantitative determination of D-malic acid in the L-malic acid.

L-malic acid; enantiomer; D-malic acid; high performance liquid chromatography

國家自然科學(xué)基金(41503016)；湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(15B201)；中國博士后科學(xué)基金(2015M582334)；南華大學(xué)博士啟動基金(2014XQD08)；國防基礎(chǔ)科研計(jì)劃項(xiàng)目(B3720110004)；南華大學(xué)“蒸湘學(xué)者計(jì)劃”。

段先哲，男，1985年出生，博士，主要從事地球化學(xué)、儀器分析等方面的研究工作。

李南，女，1985年出生，碩士，主要從事分析化學(xué)、儀器分析等方面的研究工作，E-mail：linan19851018@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.02.006