賈麗君肖菊香西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安74西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，西安76

IDO-siRNA對胃癌細胞株MGC803中IDO與IL-6水平的影響

賈麗君1#肖菊香2
1西安交通大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科，西安7100042西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，西安7100610

目的本實驗以吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）為切入點，對比分析IDO-siRNA干擾前后胃癌細胞株MGC803中IDO及IL-6表達水平變化，研究IDO在胃癌及抑郁中發(fā)生、發(fā)展的作用，探討胃癌促發(fā)抑郁的可能分子機制。方法采用siRNA干擾技術轉染胃癌細胞株MGC803，免疫細胞化學法及RT-PCR法觀察IDO蛋白及基因水平的變化，ELISA法檢測轉染siRNA前后胃癌細胞株上清液中IL-6表達水平，研究IDO對胃癌細胞株以及抑郁相關細胞因子的影響。結果胃癌細胞MGC803經轉染IDO-siRNA后IDO的表達經免疫細胞化學及RTPCR法的檢測均明顯下降（P＜0.05）；轉染IDO-siRNA 24 h后胃癌細胞MGC803的細胞上清液中IL-6的表達較未轉染前明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論IDO在胃癌細胞株MGC803中高表達；IDO-siRNA可抑制胃癌細胞株MGC803中IDO的表達；胃癌細胞株MGC803經IDO-siRNA干擾后分泌的細胞因子IL-6的表達減弱，表明IDO與IL-6的表達存在關聯(lián)，IL-6可能在胃癌及抑郁的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。

胃癌；IDO；IL-6；siRNA

Oncol Prog，2016，14（5）

胃癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率分別位居惡性腫瘤的第五位和第三位，具有發(fā)病率高、發(fā)病隱匿、易轉移和病死率高等特點［1］。胃癌的發(fā)病因素有很多，隨著醫(yī)學模式的轉變，社會心理因素在癌癥的發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用越來越受到關注。近年來，針對惡性腫瘤患者心理健康狀況的研究表明患者情緒障礙發(fā)生率很高，其中以抑郁最為常見。抑郁作為惡性腫瘤患者最常見的心理障礙之一，直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后，降低患者的生活質量［2］。因惡性腫瘤與抑郁之間互相影響，故對腫瘤和抑郁以及二者之間相互關系的研究就具有重要的臨床意義。

吲哚胺2，3雙加氧酶（Indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），是肝臟以外唯一可催化色氨酸分解代謝的限速酶，色氨酸是細胞維持活化和增殖所必需的氨基酸，也是神經遞質5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的前體［3］。研究發(fā)現胃癌中有IDO的高表達，而IDO與抑郁的發(fā)生發(fā)展密切相關［4］，還與腫瘤免疫抑制及腫瘤耐藥等相關。白細胞介素-6（in-terleukin-6，IL-6）是一種多功能的細胞因子，可在多種腫瘤組織和細胞中表達，影響腫瘤的增殖和分化，還可影響神經內分泌功能及5-HT的代謝，從而與抑郁密切相關［5］。IDO與IL-6也可相互作用。IL-6可通過干擾素非依賴途徑參與IDO表達調控，IDO又可通過分解色氨酸在一定程度上增強IL-6的作用［6］。因此研究二者在胃癌細胞株中的表達，并探討兩者之間的相互關系對闡明胃癌及腫瘤相關性抑郁發(fā)生的機制具有重要意義。

1　材料與方法

1.1實驗材料

人胃癌細胞系MGC803來自西安交通大學醫(yī)學院腫瘤研究所；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司；小牛血清購自杭州四季青公司；胰蛋白酶購自Solarbio公司；兔抗人IDO多克隆抗體購自英國ABCAM公司；SP免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；siRNA合成由廣州銳博生物科技有限公司提供；PCR引物合成，RNAiso Plus，逆轉錄試劑盒，TaKaRa Ex Taq試劑盒及DNA marker均購自大連寶生物工程有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)

人胃癌細胞系MGC803由西安交通大學醫(yī)學院腫瘤研究所保存，在含10%胎牛血清和100 U/mL青鏈霉素雙抗的RPMI 1640中，于37℃，飽和濕度及5%CO2的培養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)。

1.3免疫組織化學染色

取對數生長期MGC803細胞以1.0×105/ml密度接種于蓋玻片上，0.3%TritonX-100作用增加胞膜通透性，3%過氧化氫去離子水孵育阻斷內源性過氧化酶活性，10%山羊血清（PBS稀釋）閉阻斷非特異性抗原，加一抗4℃過夜，加羊抗兔二抗工作液孵育，加辣根酶標記的鏈酶卵白素工作液孵育后PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素復染，二甲苯透明，中性樹脂封片，鏡下觀察，先在低倍鏡（×100）下確定目標，每張切片隨機選擇5個高倍鏡視野（×400），應用圖像分析系統(tǒng)進行定量灰度掃描后進行分析。

1.4 IDO-siRNA轉染MGC803胃癌細胞

取對數生長期細胞為實驗對象，分4組：空白對照組（未轉染）、陰性對照組（轉染脂質體組）、陽性對照組（β-actin-siRNA）及IDO-siRNA轉染組。詳細序列如下：

IDO-siRNA β-actin-siRNA陰性對照正義鏈5'GAACGGGACACUUUGCUAAdTdT3'反義鏈3'dTdT CUUGCCCUGUGAAACGAUU5' ssD1021 ssD1022（購買siRNA質粒代碼）siNO5815122147

轉染前1天將胃癌細胞接種到六孔板，siRNA作用后分別于24 h及48 h檢測基因表達，48 h檢測蛋白表達。

1.5 RT-PCR檢測各組細胞IDO mRNA表達

轉染siRNA 48 h后，Trizol試劑提取總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書操作步驟，獲取檢測各實驗組cDNA并進行PCR擴增。引物序列如下：

IDOβ-actin上游：5'GCTTGCAGGAATCAGGATGT3'下游：5'GGCAAAGGTCATGGAGATGT3'上游：5'ATCGTG CGTGACATTAAGGAGAAG3'下游：3'AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG5'

PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，59.7℃退火20 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)。取PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠成像儀分析，以IDO/β-actin條帶灰度值的比值代表其mRNA的相對表達量。

1.6 IL-6表達水平的檢測

分別提取胃癌細胞MGC803、轉染IDO-siRNA或陰性對照24 h后細胞的細胞上清，在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl，然后分別加入未轉染細胞上清、轉染IDO-siRNA 24 h后細胞上清及轉染陰性對照24 h后細胞上清各再10 μl，用封板膜封板后置37℃溫育30 min，加洗滌液洗滌5次后每孔加入酶標試劑50 μl，繼續(xù)溫育及洗滌各1次，顯色，終止，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD）值。

1.7統(tǒng)計學處理

所有數據采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理。由于數據不符合正態(tài)分布，各組間計量資料比較用非參數秩和檢驗，Mann-Whitney U檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1 IDO-siRNA干擾前后人胃癌細胞系MGC803細胞中IDO表達比較

人胃癌細胞系MGC803細胞中IDO表達陽性，主要表達于細胞質中，呈淡黃色至棕褐色顆粒狀；胃癌細胞MGC803經IDO-siRNA干擾后，胞質呈淡藍色，到黃色或棕褐色顆粒狀沉淀少見，IDO蛋白的表達明顯減弱。（圖1）

圖1　IDO-siRNAsiRNA干擾前后人胃癌細胞系MGCMGC803803細胞中IDOIDO蛋白表達（×400400）

2.2 RT-PCR結果

RT-PCR分析表明人胃癌細胞株MGC803中IDO基因在mRNA水平呈高表達。MGC803胃癌細胞轉染IDO-siRNA后，于24 h進行檢測，結果顯示IDO mRNA表達量明顯低于空白對照組、陽性對照組及陰性對照組（P＜0.05）；而空白對照組、陽性對照組及陰性對照組間兩兩比較均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖2，表1）。

圖2　轉染后MGCMGC803803細胞β -actinactin和IDOIDO的表達

表1　 IDOIDO-siRNAsiRNA干擾前后MGCMGC803803細胞IDOIDO mRNAmRNA的表達

2.3 IL-6水平的變化

分別測胃癌細胞MGC803、轉染IDO-siRNA 24 h后細胞上清中IL-6的表達。IDO-siRNA組細胞上清IL-6濃度為（1.366±0.036），低于空白對照組的（1.931±0.038），差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

3　討論

胃癌的發(fā)生是外源性因素和機體內在因素等多種因素綜合作用的結果。社會心理因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展中的作用日益受到關注［7］，因癌癥的轉移易復發(fā)及死亡率高等特殊性，患者往往有較重的心理負擔，加上癌癥所帶來的疼痛，手術導致的形體及功能的改變，化療過程中的惡心嘔吐等不良反應，病程長經濟負擔重等原因，癌癥抑郁的發(fā)生率很高。而抑郁亦對腫瘤產生影響，抑郁障礙啟動神經內分泌系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)環(huán)路，使機體免疫功能下降，影響癌癥的發(fā)生發(fā)展［8］。因抑郁與癌癥之間互相影響，故探討胃癌引發(fā)抑郁及抑郁促進胃癌發(fā)生發(fā)展可能的分子機制，可為改善胃癌患者的抑郁狀況及預后提供臨床思路。

近年來，很多研究表明IDO與單胺能遞質、細胞因子及神經元可塑性密切相關，在抑郁癥的發(fā)病及治療中具有重要作用。研究顯示IDO水平與抑郁樣癥狀呈正相關，且其基線水平與6年后追蹤調查中人群的抑郁樣癥狀呈正相關［9］。動物研究表明中樞或外周給予脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）導致小鼠體內IDO活性增強，出現抑郁樣行為，而提前給予IDO競爭性抑制劑可抑制IDO的活性，抑制小鼠抑郁樣行為的出現［10］。IDO的活性表達導致細胞色氨酸的耗竭及其分解代謝過程中產生的多種物質，已有大量研究表明IDO在腫瘤組織中有高表達，提示IDO與多種惡性腫瘤的免疫逃逸、腫瘤耐藥及預后密切相關，尤其在惡性腫瘤相關性抑郁中起重要作用［11］，是腫瘤的不良預后指標之一，而RNA干擾技術可直接對IDO的表達進行抑制［12］，從而有可能成為一個新的治療方法來控制腫瘤發(fā)展和改善腫瘤抑郁患者的生活質量。

本組研究首先從細胞水平出發(fā)，證明了IDO在胃癌細胞株MGC803中表達。其次成功轉染IDO-siRNA至胃癌MGC803細胞，應用免疫組化及RTPCR法證實胃癌MGC803細胞中的IDO被成功沉默，酶聯(lián)免疫檢測證實了IDO-siRNA能顯著減少胃癌細胞中IL-6的表達。IL-6是一種多功能的細胞因子，主要通過自分泌和旁分泌的方式產生［13］。大量研究表明，IL-6能促進腫瘤的生長，并對其擴散和轉移也有一定作用。隨著抑郁癥細胞因子學說的提出，IL-6在抑郁發(fā)生發(fā)展中的作用也越來越被關注。IL-6可通過影響神經內分泌功能、與氧化應激共同作用引起抑郁［14］，但其確切機制仍有待進一步研究。IDO可通過降解色氨酸抑制一些蛋白的合成從而抑制IL-6的表達，從而緩解抑郁癥狀［15］。本組研究檢測了干擾前后胃癌細胞上清中細胞因子IL-6的水平，結果顯示經IDO-siRNA干擾后胃癌細胞上清中IL-6明顯降低（P＜0.01）。因此，IDO能有效減少胃癌細胞中IL-6的表達，從而延緩腫瘤進展，并減少抑郁癥的發(fā)生。當然也有研究顯示，IL-6能通過干擾素非依賴途徑激活IDO，但是本研究并未進行相關實驗證實。

綜上所述，IDO在胃癌細胞株MGC803中有表達，用IDO-siRNA轉染后，IDO的表達可明顯減弱，且干擾后胃癌細胞株分泌的細胞因子IL-6的表達也降低。因此IDO作為腫瘤與抑郁發(fā)生發(fā)展的橋梁，可為探索胃癌的潛在治療靶點及防治腫瘤相關性抑郁提供理論依據。

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The effectt of IDO-siRNA on indoleamine 2.3-dioxygenase and interleukiinn-- 66 iinn gastric cancer cell line MGC803

JIALi-jun1#XIAO Ju-xiang2
1Department of Oncology，Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710004，China2Department of Oncology，First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China

ObjectivectiveTo observe the expression levels of indoleamine 2，3-dioxygenase（IDO）and the secretion of interleukin-6（IL-6）in gastric cancer cell line MGC803 before and after the application of IDO-siRNA，to investigate the effect of IDO in the development of gastric cancer and cancer related depression.MethodethodGastric cancer cell line MGC803 was transfected with siRNA，the expression changes of IDO-siRNA and IDO protein were determined by RTPCR and immunocytochemistry.The change of IL-6 secretion was measured by ELISA.The effect of IDO on cancer cell line and depression related cytokines was investigated.ResultesultAfter application of IDO-siRNA，the expression of IDO and the secretion of IL-6 in the gastric cancer cell line MGC803 was decreased significantly（P＜0.01）.ConclusionusionIDO is highly expressed in gastric cancer cell line MGC803；IDO-siRNA can inhibit the expression of IDO in gastric cancer cell line MGC803：after application of IDO-siRNA，the secretion of IL-6 was decreased significantly in gastric cancer cell line MGC803，indicating that IDO expression and IL-6 was positively correlated，and IL-6 might be engaged in the development of gastric cancer and related depression.

rdsgastric cancer；indoleamine 2，3-dioxygenase；interleukin-6；siRNA

R735. 2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.05.19

（corresponding author），郵箱：jialijun112@163.com

2015-12-08）