周　前　于建強(qiáng)　趙立波　李德勝　吳　魁　朱建華　袁景和,*　方曉紅

(1四川大學(xué)物理學(xué)系，成都610064；2高能量密度物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064；3中國科學(xué)院化學(xué)研究所分子納米結(jié)構(gòu)與納米技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京100190；4北方工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京100144；5中國科學(xué)院化學(xué)研究所高分子物理與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京100190；6中國科學(xué)院化學(xué)研究所活體分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京100190)

基于散射信號(hào)的超分辨光學(xué)相減顯微鏡

周前1,2,3于建強(qiáng)4趙立波3李德勝5吳魁6朱建華1,2袁景和3,*方曉紅3

(1四川大學(xué)物理學(xué)系，成都610064；2高能量密度物理及技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064；3中國科學(xué)院化學(xué)研究所分子納米結(jié)構(gòu)與納米技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京100190；4北方工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，北京100144；5中國科學(xué)院化學(xué)研究所高分子
物理與化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京100190；6中國科學(xué)院化學(xué)研究所活體分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京100190)

現(xiàn)有的光學(xué)超分辨顯微成像技術(shù)主要依賴于特殊的熒光標(biāo)記物，其對(duì)于大多數(shù)非熒光樣品的超分辨成像就變得無能為力。因此我們提出將光學(xué)相減顯微技術(shù)應(yīng)用到非熒光樣品的成像當(dāng)中，利用普通共聚焦光斑和面包圈型光斑分別激發(fā)樣品的散射光成像，從而得到樣品同一區(qū)域的兩幅圖像，再通過圖像相減的方法提高了圖像空間分辨率。不同于一般的超分辨成像方法，這種光學(xué)相減顯微鏡不需要特殊的樣品預(yù)處理過程，同時(shí)兩次成像的激發(fā)光強(qiáng)度可以保持在一個(gè)較低水平，避免了樣品損傷的影響。隨后金納米小球和有機(jī)聚合物微絲的散射成像實(shí)驗(yàn)證明了光學(xué)相減顯微鏡可以將空間分辨率提高到215 nm(0.33λ，1λ=650 nm)，并且通過探測(cè)散射信號(hào)得到更多的樣品細(xì)節(jié)信息。

超分辨顯微鏡；圖像相減；非熒光成像；光散射成像

1　引言

幾個(gè)世紀(jì)以來，光學(xué)顯微鏡的發(fā)展極大地提高了人們對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞功能的認(rèn)識(shí)，但由于光學(xué)衍射極限的存在，光學(xué)顯微鏡空間分辨率通常在數(shù)百納米左右，這使得其在細(xì)胞器和分子水平的細(xì)胞生物學(xué)探測(cè)中受到了極大的限制。近來，一些基于熒光探針的超分辨光學(xué)顯微鏡打破了光學(xué)衍射極限的限制，其中包括隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(STORM)1、光活化定位顯微技術(shù)(PALM)2、受激輻射耗盡顯微技術(shù)(STED)3,4等，這些成像技術(shù)依賴特殊的熒光分子基團(tuán)，無法實(shí)現(xiàn)非熒光樣品的超分辨成像。于此同時(shí)也出現(xiàn)了一些非熒光超分辨成像的方法，例如Wang等5利用樣品分子的電子吸收過飽和效應(yīng)，在空間上調(diào)制了激發(fā)光斑點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，從而提高了非熒光樣品成像分辨率。Ye等6設(shè)計(jì)了一種平面超薄透鏡組，入射電場(chǎng)在透鏡組相平面處幾乎只有縱向分量，從而減少了光斑橫向面積，提高光學(xué)空間分辨率。但這些方法往往利用了特殊的分子能級(jí)結(jié)構(gòu)或光學(xué)體系，在適用性和實(shí)現(xiàn)難度上都有很大限制。而另一方面光學(xué)相減顯微技術(shù)(optical subtraction microscopy)通過不同條件下兩次成像相減的方法提高成像的空間分辨率，自理論上提出以來7，其主要用于簡(jiǎn)單快捷地提高熒光成像的空間分辨率和信噪比8－10上。雖然無法達(dá)到之前幾種熒光超分辨技術(shù)數(shù)十個(gè)納米的空間分辨水平，但光學(xué)相減顯微鏡對(duì)激發(fā)光和樣品并無特殊要求，這使得將其應(yīng)用到非熒光樣品成像成為可能。

我們提出利用光學(xué)相減顯微技術(shù)，通過兩次光散射成像相減的方法來獲得非熒光樣品的超分辨圖像，通過普通共聚焦光斑激發(fā)的散射成像作為被減圖像，再使用面包圈型光斑激發(fā)同一區(qū)域的散射成像作為減數(shù)圖像，兩者相減來獲得超分辨成像。因?yàn)闊o需特殊的熒光分子基團(tuán)，不必考慮熒光激發(fā)和發(fā)射光譜對(duì)波長的限制，所以兩次散射成像可以使用同一激發(fā)波長。另外光學(xué)相減顯微成像技術(shù)相比于其他超分辨技術(shù)擁有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)：首先，激發(fā)光功率可以減低到普通共聚焦顯微鏡的水平，不同于STED顯微技術(shù)使用高功率激光激發(fā)的情況，減小樣品損傷和潛在的光漂白現(xiàn)象。其次，被減圖像和減數(shù)圖像都通過共聚焦掃描的方式獲得，其成像速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于STORM和PALM顯微技術(shù)。另外，采用樣品分子普遍存在的散射光作為信號(hào)源，具有廣泛的適用性。最后，在整個(gè)成像過程中只使用同一波長的激發(fā)光，并且兩幅圖像的采集相互獨(dú)立，不存在時(shí)間同步的問題，這簡(jiǎn)化了整個(gè)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。實(shí)際上這個(gè)工作證明了光學(xué)相減顯微技術(shù)可以被看作一種新型的結(jié)構(gòu)光照明成像方法，同時(shí)應(yīng)用到熒光和非熒光的超分辨成像當(dāng)中。

2　基本原理和實(shí)現(xiàn)方法

2.1光學(xué)相減顯微鏡的基本原理

在共聚焦成像中，顯微鏡的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)PSF (the point-spread function)可以被描述為

其中 p(x,y)是共聚焦系統(tǒng)針孔的尺寸，?是卷積運(yùn)算符。PSFi(x,y)和PSFj(x,y)分別代表了激發(fā)物鏡和收集物鏡的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，對(duì)于倒置共聚焦顯微鏡，激發(fā)物鏡同時(shí)用作收集物鏡，因此PSFi(x,y)=PSFj(x,y)=PSFl(x,y)，PSFl(x,y)是倒置共聚焦顯微鏡所使用物鏡的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，于是整個(gè)系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)又可以被描述為：

則像平面中光場(chǎng)強(qiáng)度分布I(x,y)被描述為

Iscat(x,y)代表了在焦平面的散射信號(hào)強(qiáng)度分布，滿足以下關(guān)系：Iscat(x,y)=σ(x,y)Ie(x,y)，其中σ(x,y)為散射截面，Ie(x,y)為外界激發(fā)光強(qiáng)分布。至此共聚焦光斑激發(fā)(confocal excitation)的散射圖像Ic(即相減顯微鏡當(dāng)中的被減圖像)和面包圈型光斑激發(fā)(doughnut excitation)的散射圖像Id(即相減顯微鏡當(dāng)中的減數(shù)圖像)可以通過公式(2)和(3)進(jìn)行計(jì)算。它們各自的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù) PSF(x,y)分別寫成PSFc(x,y)和PSFd(x,y)，并可以通過矢量衍射理論計(jì)算出來11－13。

對(duì)于我們的光學(xué)相減顯微鏡，兩幅圖像的激發(fā)波長都設(shè)定為λ=650 nm，并且以圓偏振光進(jìn)入物鏡后口消除各向異性對(duì)成像的影響，物鏡數(shù)值口徑(NA)為1.4。對(duì)于一個(gè)獨(dú)立點(diǎn)的散射成像，其Ic和Id的計(jì)算結(jié)果分別為圖1的(a)和(b)，圖1(c)則表示了兩者相減得到的相減圖像(Is)的橫截面。

在像平面中相減圖像的強(qiáng)度分布Is可以由以下式獲得：

其中r為一個(gè)可調(diào)參數(shù)，如圖1(c)所示，在被減圖像Ic中單點(diǎn)的半高寬(FWHM)約為314 nm，而隨著r值的增加，即減數(shù)圖像權(quán)重增大時(shí)，相減圖像的空間分辨率也隨之提高。當(dāng)r=1時(shí)，Is的橫截面的半高寬為240 nm，當(dāng)r=2時(shí)，其減小至207 nm。理論上空間分辨率可以隨r值增大而無限提高，但實(shí)際實(shí)驗(yàn)中受到面包圈型光斑中心光強(qiáng)無法完全為零，加上成像噪聲的影響，當(dāng)r過大時(shí)，會(huì)導(dǎo)致被減圖像信號(hào)完全被減數(shù)圖像淹沒的情況，從而損失大量原有的圖像細(xì)節(jié)，為了保證相減圖像具有較高的信噪比，實(shí)驗(yàn)中r值通常事先設(shè)定為，并在此基礎(chǔ)上適當(dāng)改變r(jià)值，通過計(jì)算不同r值條件下的相減圖像信噪比，來確定相減圖像信噪比達(dá)到最佳狀態(tài)時(shí)r值的大小。

圖1　單點(diǎn)的相減成像模擬結(jié)果Fig.1　Simulated subtraction imaging of an isolated scattering point(a)Ic:confocal excitation image intensity;(b)Id:doughnut excitation image intensity,λ=650 nm in(a)and(b);(c)normalized line intensity profiles of Ic,Idand subtraction image Is,when r=1 and r=2, r is a controllable parameter based on the signal to noise ratio of subtraction image.

圖2　超分辨光學(xué)相減顯微鏡的示意圖Fig.2　Schematic diagram of the super resolution subtraction microscopeSC:super continuum laser;SPF:short pass filter;BPF:bandpass filter; PBS:polarizing beam splitter;S1,S2:shutters;BE1,BE2:beam expanders;SMF:single mode fibers;VPP:vortex phase plate; BS1,BS2:beam splitter;QW:quarter wave plate; PMT:photomultiplier tube detector

2.2實(shí)驗(yàn)裝置

我們所使用的光學(xué)相減顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)是基于之前被報(bào)道過的自制STED顯微鏡14的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)完成的(如圖2所示)。整個(gè)系統(tǒng)使用了普通倒置光學(xué)顯微鏡(IX71,Olympus,Japan)作為基本平臺(tái)，利用超連續(xù)皮秒脈沖激光器(Fianium,Southampton,UK)作為光源，其波長范圍從可見光波段到近紅外波段(450－1750 nm)，脈沖寬度為350 ps，重復(fù)頻率為1 MHz。在激光器出口處設(shè)置一塊窄帶濾波片(BPF,FF01-650/13-25,Semrock,New York,USA)用以選擇出650 nm作為激發(fā)波長。之后經(jīng)過偏振光分離晶體(CVI,Albuquerque,USA)將光路分為偏振狀態(tài)相互垂直的兩路線偏振光，分別作為被減成像和減數(shù)成像的激發(fā)光源。兩路光又分別經(jīng)過兩組擴(kuò)束透鏡組(BE1,BE2)之后耦合到單模保偏光纖(SMF,THORLABS,New Jersey,USA)中以保證光束質(zhì)量并簡(jiǎn)化整個(gè)成像系統(tǒng)。其中減數(shù)成像的激發(fā)光路又經(jīng)由螺旋位相板(VPP,RPC Photonics,Rochester,NY,USA)以獲得0－2π的螺旋位相調(diào)制，在物鏡焦平面處形成面包圈型光斑，螺旋位相板厚度對(duì)應(yīng)激發(fā)波長650 nm，以保證面包圈型光斑質(zhì)量。單模光纖輸出的兩路光先通過一塊平面分束鏡(BS1,THORLABS,New Jersey, USA)耦合共線，再利用一塊半反半透分束鏡(BS2, THORLABS,New Jersey,USA)引入油介質(zhì)物鏡(UPlan Sapo,NA=1.4,100×,Olympus,Japan)后口以及實(shí)現(xiàn)激發(fā)光和散射信號(hào)光的分離。另外，一塊四分之一波片(THORLABS,New Jersey,USA)被放置在分束鏡BS1和BS2之間，以保證兩路激發(fā)光都為圓偏振光。樣品的散射信號(hào)通過同一物鏡收集之后，經(jīng)過一個(gè)共聚焦針孔后由光電倍增管探測(cè)器(PMT,THORLABS,New Jersey,USA)探測(cè)。整個(gè)系統(tǒng)的圖像掃描通過安裝在顯微鏡平臺(tái)上的壓電位移臺(tái)(P-545.3C7,PI,Germany)單線掃描移動(dòng)來實(shí)現(xiàn)。PMT探測(cè)器和位移臺(tái)都連接在一塊數(shù)據(jù)采集卡(PCIe-6353,NI,USA)當(dāng)中，以實(shí)現(xiàn)信號(hào)采集以及探測(cè)器與位移臺(tái)同步等控制，而被減成像和減數(shù)成像的切換則通過兩個(gè)快門(S1和S2, LS3T2,Uniblitz,USA)的開關(guān)來控制。

被減成像和減數(shù)成像的激發(fā)功率一般為10μW左右(物鏡后口測(cè)得)，重復(fù)頻率為1 MHz，并且由于兩者成像過程相對(duì)獨(dú)立，所以不存在時(shí)間同步和對(duì)準(zhǔn)。最后得到的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析和演示都通過我們自己編寫的Matlab程序進(jìn)行。

2.3樣品的制備

金納米小球樣品：采用購買的金溶膠溶液(Φ 80 nm gold bead,Accurate Chemical&Scientific Corporation,New York,USA)和10－3mol?L－1的聚乙烯醇溶液(PVA，Sigma-Aldrich Corporation,USA) 以1:10的體積比混合后，超聲30 min得到的混合溶液，隨后旋涂(4000 r?min－1,30 s)至洗凈的玻璃片上并晾干。

有機(jī)聚合物微絲：10%(w)聚異丁烯酸異丁酯的二甲基甲酰胺(DMF)溶液作為聚合物，通過電紡絲的方法在玻璃片表面制備有機(jī)聚合物微絲。聚合物針尖與玻璃片之間的電壓為1.5 kV?cm－1。有機(jī)溶劑流速為100μL?h－1。

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

3.1金納米顆粒的相減成像

我們首先利用80 nm金納米顆粒成像來驗(yàn)證相減顯微成像方法提高空間分辨率的能力。圖3表示了樣品同一區(qū)域(10μm×9μm)的普通共聚焦激發(fā)散射成像Ic(被減圖像)和相減顯微成像Is結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中單個(gè)掃描步長為50 nm，采集時(shí)間為1 ms，被減圖像和減數(shù)圖像的激發(fā)光在物鏡后口所測(cè)得的功率都為12μW，脈沖重復(fù)頻率為1 MHz，可調(diào)參數(shù)r=1.2。如圖3(a)中所示的兩個(gè)相鄰金納米顆粒(白色箭頭所指處)，其無法通過普通共聚焦成像清楚地區(qū)分開來，而在經(jīng)過Ic和Id相減處理之后得到Is，兩個(gè)金納米顆粒分別在Ic和Is的橫截面圖如圖3 (d)所示，可見兩個(gè)顆粒被清楚的區(qū)分開來。圖3(e)顯示了單個(gè)金納米顆粒分別在共聚焦圖像和相減圖像當(dāng)中的橫截面(圖3(a)和圖3(c)藍(lán)色箭頭所指處)，可測(cè)得共聚焦成像(圖3(a))中金納米顆粒的半高寬在319 nm，但在相減成像(圖3(c))結(jié)果中金納米顆粒半高寬減小到了215 nm，約為0.33λ，相比于共聚焦成像的結(jié)果，空間分辨率有了明顯的提高。

3.2有機(jī)聚合物微絲的相減成像

我們使用有機(jī)聚合物微絲作為成像樣品進(jìn)一步驗(yàn)證相減顯微鏡的空間分辨能力(圖4)。為了確定聚合物微絲的真實(shí)尺度，我們采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)聚合物微絲進(jìn)行了成像，如圖4(a)所示，聚合物體系由細(xì)小的微絲和尺寸較大的紡錘體組成，微絲的寬度通常在180－500 nm之間，而紡錘體寬度通常在數(shù)個(gè)微米。針對(duì)聚合物微絲進(jìn)行光學(xué)相減成像，兩幅圖像的掃面范圍為30μm× 30μm，單個(gè)步長為60 nm，采集時(shí)間為1 ms，激發(fā)光功率都為12μW，重復(fù)頻率為1 MHz，調(diào)節(jié)參數(shù)r=0.85。對(duì)比掃描電子顯微鏡的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于紡錘體而言只有紡錘體邊緣的散射信號(hào)能被光學(xué)顯微鏡探測(cè)到，這是由于在介質(zhì)邊界處具有更強(qiáng)烈的散射信號(hào)所致。通過對(duì)比共聚焦圖像(圖4(b))和相減圖像(圖4(c))的結(jié)果可知，空間分辨率有了較大的提高，一些共聚焦成像中無法顯示的圖像細(xì)節(jié)在相減成像得到了展現(xiàn)。例如兩幅圖中白色箭頭所指的一個(gè)小紡錘體位置，紡錘體邊緣在共聚焦成像中重合到了一起，而在相減成像中兩者被清楚地區(qū)分了開來(圖4(d))。在藍(lán)色箭頭所示單個(gè)微絲的位置，在相減成像中微絲兩個(gè)邊緣也被探測(cè)成像出來，而共聚焦成像中只是單線的形狀(圖4(e))。因此可以證明在復(fù)雜樣品的成像中，相減顯微成像技術(shù)也能顯著提高圖像的空間分辨率。

圖3　通過相減顯微技術(shù)得到的金納米顆粒的超分辨成像Fig.3　Super-resolution imaging of the gold nanobeads by the subtraction microscopy(a)confocal excitation image;(b)doughnut excitation image;(c)super-resolution subtraction image; (d)normalized intensity profiles along lines indicated by white arrows in(a)and(c); (e)normalized intensity profiles along lines indicated by blue arrows in(a)and(c).The bar scale is 1 μm in(a),(b),and(c).

圖4　有機(jī)聚合物微絲的相減顯微成像Fig.4　Super-resolution imaging of the polymer nanofibers with the subtraction microscopy(a)scanning electron microscope(SEM)image of polymer nanofibers,the bar scale is 1 μm in inset;(b)confocal image; (c)super-resolution subtraction image,the bar scale is 3 μm in(b)and(c);(d)normalized intensity profiles along lines indicated by white arrows in (b)and(c);(e)normalized intensity profiles along lines indicated by bule arrows in(b)and(c).

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了光學(xué)相減顯微技術(shù)能夠利用散射光作為信號(hào)源實(shí)現(xiàn)非熒光樣品的超分辨成像。不同于之前的超分辨成像技術(shù)需要利用熒光分子基團(tuán)，光學(xué)相減顯微技術(shù)的兩路激發(fā)光原則上可以使用任意波長，無需高激發(fā)功率和復(fù)雜樣品制備過程，減小了樣品的光損傷。

4　結(jié)論

提出了利用光學(xué)相減顯微鏡獲得非熒光樣品超分辨成像，通過共聚焦散射成像作為被減圖像，面包圈形光斑激發(fā)的散射成像為減數(shù)圖像，兩圖像相減的方法提高圖像的空間分辨率，兩者的激發(fā)波長可以為任意的單一波長，并且激發(fā)功率可以在較低水平。使用相減顯微成像技術(shù)對(duì)金納米顆粒以及有機(jī)聚合物微絲進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明金納米顆粒半高寬從316 nm下降至215 nm，約為0.33λ；而聚合物微絲樣品圖像的空間分辨率也有明顯的提高。由于實(shí)驗(yàn)采用散射光作為信號(hào)源，證明了光學(xué)相減顯微鏡適用于任何光學(xué)信號(hào)來源，其在生物醫(yī)學(xué)以及其他領(lǐng)域的應(yīng)用前景也得到了擴(kuò)展。

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最后借用何顯斌教授的一句話:“只有當(dāng)刑罰以正義和人道為基本價(jià)值取向的時(shí)候，刑法的價(jià)值—秩序和自由才能實(shí)現(xiàn)并確保和諧的共生關(guān)系。”［8］我們?cè)O(shè)立刑法是為了很好的維護(hù)正常的自由、秩序，而不是濫用刑罰。

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Super-Resolution Optical Subtraction Microscopy Using Optical Scattering Imaging

ZHOU Qian1,2,3YU Jian-Qiang4ZHAO Li-Bo3LI De-Sheng5WU Kui6
ZHU Jian-Hua1,2YUAN Jing-He3,*FANG Xiao-Hong3
(1Department of Physics,Sichuan University,Chengdu 610064,P.R.China;2Key Laboratory of High Energy Density Physics and Technology of Ministry of Education,Chengdu 610064,P.R.China;3Key Laboratory of Molecular Nanostructure and Nanotechnology,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;4College of Science, North China University of Technology,Beijing 100144,P.R.China;5State Key Laboratory of Polymer Physics and Chemistry,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China;6Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems,Institute of Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,P.R.China)

The existing form of super-resolution microscopy based on specific fluorescent tagging is unable to obtain super-resolution images of non-fluorescent samples.Hence,we have developed optical subtraction microscopy for obtaining super-resolution imaging in such cases.This method is based on image subtraction between the two optical scattering images from general confocal excitation and doughnut-shaped excitation, respectively.Unlike super-resolution fluorescence microscopy,subtraction microscopy requires no preprocessing of the sample,and the excitation power can be kept low to avoid sample damage.The non-fluorescent imaging of gold nanobeads and polymer nanofibers has been realized to demonstrate the feasibility of super-resolution subtraction microscopy.The lateral resolution decreases to 215 nm(0.33λ,1λ=650 nm)in subtraction imaging,and greater imaging detail of the sample is achieved via optical scattering.

Super-resolution microscopy;Subtraction imaging;Non-fluorescence imaging; Optical scattering imaging

February 25,2016;Revised:March 22,2016;Published on Web:March 23,2016.

O644

［Article］10.3866/PKU.WHXB201603234www.whxb.pku.edu.cn

*Corresponding author.Email:jhyuan@iccas.ac.cn;Tel:+86-10-62561679.

The project was supported by the National Key Basic Research Program of China(973)(2013CB933701),National Natural Science Foundation of China(21127901,91413119)and Key Technology Talent Program of ChineseAcademy of Sciences.

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(973)(2013CB933701),國家自然科學(xué)基金(21127901,91413119)和中國科學(xué)院“關(guān)鍵技術(shù)人才”項(xiàng)目資助