李作揚，田銳，于子超，王斌

（大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧大連116023）

翅堿蓬根系降油細菌的篩選及其生長特性研究

李作揚，田銳，于子超，王斌

（大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室，遼寧大連116023）

為建立適用于沿海灘涂石油污染的翅堿蓬-細菌復(fù)合修復(fù)技術(shù)，對翅堿蓬Suaeda heteroptera Kitag根系及其土壤進行常規(guī)細菌分離，并采用柴油為唯一碳源的平板，從中篩選具有降油性能的菌株并對篩選的菌株進行降油性能測定，研究其在不同作用時間 （3、5、7 d）時對柴油的原始降解率，選擇在3個時間段中降油性能均較高的菌株作為目的菌進行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析，測定其生長特性。結(jié)果表明：試驗中共分離純化出28株細菌，其中具有降油性能的細菌有7株，編號分別為S1、G3、G4、G9、G10、G11、G12；7株細菌對柴油的原始降解率，作用3 d時分別為34.21%、3.68%、18.40%、18.95%、0.52%、9.47%、21.05%，作用5 d時分別為44.06%、3.19%、23.90%、24.70%、31.47%、25.90%、46.22%，作用 7 d時分別為 41.09%、1.49%、14.36%、28.22%、14.36%、29.70%、31.68%；S1、G11和G12菌株對柴油具有較高降解率；S1屬微桿菌屬Microbacterium，與Microbacterium saperdate的相似性為98.7%，G11和G12均屬于劉志恒菌屬Zhihengliuella，與Zhihengliuella halotolerans的相似性均為99.8%，3株菌的最適生長溫度范圍均為15～30℃，最適生長鹽度分別為0、20、20，最適生長pH分別為5、7和7。

翅堿蓬；石油降解菌；鑒定

目前，海上石油泄露事故頻發(fā)，使得海洋生態(tài)環(huán)境面臨巨大的威脅和破壞，沿岸地區(qū)海洋經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展受到了嚴重的威脅，因此，海洋生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)與保護越來越受到廣泛的重視。從20世紀70年代起，國內(nèi)外學(xué)者就開始了有關(guān)海洋環(huán)境受石油污染后的生物修復(fù)研究［1-6］。生物修復(fù)是指利用生物代謝活動催化降解有機污染以消除污染、保護環(huán)境的過程。1989年，美國油輪溢油事件中首次大規(guī)模使用了生物修復(fù)技術(shù)，1992年，以色列開發(fā)出一種菌制肥料用于增強烴降解活動［7］。此后，中國學(xué)者在石油生物修復(fù)研究中也進行了一些相關(guān)研究。白潔等［8］對優(yōu)勢石油降解菌進行了篩選，并對其最適生長條件、降解性能和環(huán)境修復(fù)過程中的作用進行了細致研究；劉媚媚等［9］在培養(yǎng)出高效降解菌的同時，對石油降解菌的碳纖維固定化進行了系統(tǒng)研究。但有關(guān)嗜鹽菌株在沿海灘涂石油污染中的生物修復(fù)作用報道較少。

翅堿蓬 Suaeda heteroptera Kitag隸屬于藜科Chenopodiaceae、堿蓬屬Suaeda，屬一年生草本植物［10］，是高鹽堿生態(tài)環(huán)境的重要植被。研究表明，石油烴污染修復(fù)的植物主要有苜蓿Medicago sativa、黑麥草Lolium perenne、酥油草Festuca ovina等非鹽生植物，而海岸帶等地多屬高鹽堿土壤，故耐鹽堿的翅堿蓬優(yōu)勢顯而易見。翅堿蓬不僅對于維持濕地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性、吸收累積重金屬等具有重要作用，而且對石油污染物的去除也具有促進作用。何潔等［11］研究表明，翅堿蓬對Cu、Pb均具有一定的耐受性，且低含量的Cu（100 mg/kg）會促進翅堿蓬生長。因此，翅堿蓬在鹽堿及污染土壤生物修復(fù)中有著重要的地位。本研究中，通過分離篩選翅堿蓬根系土壤中的降油細菌，研究其相關(guān)特性，以期獲取降油細菌菌種資源，構(gòu)建翅堿蓬-降油細菌載體，為建立適用于沿海灘涂石油污染的復(fù)合生物修復(fù)技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

試驗用翅堿蓬采自遼寧省盤錦“紅海灘”地區(qū)，將翅堿蓬連帶根系土壤一起采集，24 h內(nèi)帶回實驗室進行細菌分離。

試驗用培養(yǎng)基為2216E固體培養(yǎng)基，柴油培養(yǎng)基由100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加1 mL無菌0#柴油制成［12］。

1.2方法

1.2.1細菌分離 將翅堿蓬及其土壤樣品分別處理，根系可抖落下的土壤作為樣品T；然后用無菌海水沖洗根部，收集所有沖洗水作為樣品S；取經(jīng)過無菌海水沖洗3遍后的翅堿蓬根系，剪碎后置于無菌研缽中，并加入倍量無菌海水，充分研磨后取上清液作為樣品G。將樣品T、S、G分別用無菌水稀釋101、102、103、104、105倍，分別取 0.1 mL涂布于2216E平板上，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)菌落形態(tài)特征挑取不同單菌落，在2216E平板上多次劃線純化后并保種。

1.2.2降油菌株的篩選 將純化后的菌株分別在以柴油為唯一碳源的平板上劃線，然后置于恒溫培養(yǎng)箱 （25℃）中培養(yǎng)24 h，挑取在柴油平板上生長良好的菌株作為備選降油菌株進行后續(xù)試驗。

1.2.3分離菌株原始降解率的測定 用5 mL無菌生理鹽水將備選降油菌株從2216E斜面培養(yǎng)物上洗下，稀釋至濃度為9×109cells/mL的菌懸液，以1%的接種量接種于100 mL以柴油為唯一碳源的液體柴油培養(yǎng)基中，將菌株置于25℃、150 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個平行，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照組，分別培養(yǎng)3、5、7 d后測定其降油率作為復(fù)篩依據(jù)，選擇原始降解率高的菌株作為目標菌株進行后續(xù)試驗。

石油降解率的測定方法：向培養(yǎng)瓶中加入50 mL石油醚，充分振蕩后靜置，待分層后用移液槍取上層液500 μL放入25 mL比色管中，并用石油醚定容至25 mL。混勻后，在紫外分光光度計上掃描柴油的最大吸收波長，在最大波長處測量各試驗組及對照組的吸光值 （OD），按照石油降解率公式計算平均降解率［13-14］：

其中：OD0為對照組殘余柴油的吸光值；ODi為試驗組殘余柴油的吸光值。

1.2.4降油菌株的鑒定 按照 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對復(fù)篩所得降解性能較好的降油菌株進行鑒定，其中生理生化特征利用API 20NE和API ZYM試劑條進行，接種2216E液體培養(yǎng)物以保證測試過程中NaCl濃度達到菌體生長要求。同時委托生工生物工程 （大連）股份有限公司進行試驗菌株的16S rDNA序列測定，將16S rDNA測序結(jié)果在GenBank中進行比對，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以進一步確定其分類地位。

1.2.5降油菌株的生長特性

（1）最適生長溫度。將篩選得到的降解菌株于2216E液體培養(yǎng)基在25℃下活化24 h后，挑取一杯接種于2216E液體培養(yǎng)基中，分別置于0、10、15、20、25、30、35、40℃下靜置培養(yǎng)24 h，每個溫度設(shè)置3個平行。以不接菌的培養(yǎng)基作為對照，利用紫外分光光度法測定各組菌體的吸光值（OD600 nm）。

（2）最適生長pH。按照上述方法，將石油降解菌接種到pH分別為5、6、7、8、9、10的2216E液體培養(yǎng)基中，每個pH設(shè)置3個平行，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照，25℃下靜置培養(yǎng)24 h，利用紫外分光光度法測定各組菌體的吸光值。

（3）最適生長鹽度。同法，將石油降解菌分別接種于鹽度分別為0、5、10、20、30的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，25℃下靜置培養(yǎng)24 h，每個鹽度設(shè)置3個平行，以不接菌的培養(yǎng)基作為對照，利用紫外分光光度法測定各組菌體的吸光值。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法進行顯著性檢驗，采用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1翅堿蓬樣品細菌的分離

T、S、G 3種樣品中，根據(jù)菌落形態(tài)共分離純化出28株代表菌株，其中樣品T有14株，樣品G 有13株，樣品S有1株，分別編號為T2、T3、T6、T8、T9、T12、T14、T15-1、T17、T18、T19、T19-1、T20、T21、G1、G3、G4、G5、G6、G6-1、G7、G8、G9、G10、G11、G12、G13、S1。

2.2降油細菌的篩選

2.2.1篩選細菌的菌落形態(tài) 通過柴油平板篩選，共得到7株能以柴油為唯一碳源生長的細菌，分別為S1、G3、G4、G9、G10、G11、G12，具體菌落形態(tài)見表1。

表1　分離菌株的形態(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of the isolated strains

2.2.2篩選降油細菌的形態(tài) 顯微鏡下7株菌的形態(tài)顯示：S1菌株細胞呈微小桿狀，為革蘭氏陽性；G3、G4、G9、G11、G12菌株均呈桿狀，為革蘭氏陰性；G10菌株呈球狀，為革蘭氏陰性。

2.3降油菌株的初始降解性能

在紫外分光光度計上對商品柴油進行掃描，得到最大吸收波長為221 nm，在此波長下測得各組的吸光值，再利用公式計算降解率。從圖1可見：作用3 d時，降解率最高為S1菌株 （34.21%），其次為G12菌株 （21.05%），其余按降解率由高到低依次為 G9、G4、G11、G3、G10菌株（18.95%、18.40%、9.47%、3.68%和0.52%）；作用5 d時，降解率最高為G12菌株 （46.22%），其次為S1菌株 （44.06%），其余降解率由高到低依次為G10、G11、G9、G4、G3菌株 （31.47%、25.90%、24.70%、23.90%和3.19%）；作用7 d時，降解率最高為 S1菌株 （41.09%），其次為G12菌株 （31.68%），其余依次為G11、G9、G4、G10、G3菌株（29.70%、28.22%、14.36%、14.36和1.49%）。多重比較結(jié)果表明：作用3 d時，S1菌株的降解率顯著高于G3、G10、G11菌株 （P＜0.05），G3、G10菌株的降解率顯著低于其他菌株 （P＜0.05）；作用5 d時，S1、G12菌株的降解率顯著高于 G3、G4、G9菌株 （P＜0.05），G3菌株的降解率顯著低于除G4、G9菌株之外的其他菌株（P＜0.05），G10菌株的降解率提高最快，甚至超過了G4、G9和G11菌株；作用7 d時，S1、G12菌株的降解率顯著高于G3、G4、G10菌株（P＜0.05），G11菌株的降解率也較高，故選擇S1、G11和G12菌株為目標菌株進行后續(xù)試驗。

圖1　降油菌株作用3、5、7 d時的柴油降解率Fig.1 Diesel degradation rate by oil degradating bacteria within 3，5，and 7 days

2.4菌株的鑒定

2.4.1生理生化特征 3株目標菌株的生理生化特征見表2，G11、G12菌株主要特征符合劉志恒菌屬，S1菌株主要特征符合微桿菌屬。

表2　S1、G11和G12菌株的生理生化特征Tab.2 Biochemical and physiological characteristics of strains S1，G11 and G12

將S1、G11、G12 3個菌株的16S rDNA序列結(jié)果輸入NCBI中進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，S1菌株與微桿菌 Microbacterium saperdate的相似性達到98.7%，G11、G12菌株與耐鹽劉志恒菌Zhihengliuella halotolerans的相似性達到 99.8%，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建此3株菌及其屬內(nèi)其他菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹?？梢源_定，S1菌歸屬于微桿菌屬，為微桿菌，G11、G12菌歸屬于為劉志恒菌屬，為劉志恒菌 （圖2）。

2.4.2菌株的生長特性 生長特性結(jié)果顯示：S1菌株最適生長溫度為30℃，生長溫度范圍為15～35℃，在鹽度為0時生長最好，在鹽度為5～10時生長較好，最適pH為5～6；G11、G12菌株最適生長溫度均為30℃，最適生長鹽度均為20，最適生長pH均為7（圖3～圖5）。

圖2　S1、G11和G12菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹的位置Fig.2 Phylogenetic tree of strains S1，G11 and G12

圖3　S1菌株的生長條件Fig.3 Growth conditions of strain S1

圖4　G11菌株的生長條件Fig.4 Growth conditions of strain G11

圖5　G12菌株的生長條件Fig.5 Growth conditions of strain G12

3 討論

翅堿蓬具有耐鹽生長以及對多種污染物耐受的特性［10］，翅堿蓬的抗污染能力與其根系微生物有著密切的關(guān)系。翅堿蓬在石油污染土壤的修復(fù)中，其根系微生物起到了關(guān)鍵作用［15］，王新新等［17］從翅堿蓬根基土壤中分離到多株耐鹽石油烴降解菌。本研究中采集了遼寧盤錦地區(qū)生長的翅堿蓬，將其分為3種樣品進行分離，其中樣品T主要為土壤菌株，樣品S主要為與根系呈附著狀態(tài)的菌株，樣品G為除去附著微生物后根系組織均漿中的菌株，可能包括共生或互生關(guān)系的菌株。根據(jù)菌株分離結(jié)果，雖然樣品T和樣品S中存在較多形態(tài)相同的菌株，但樣品S中的S1菌株在樣品T中不存在，可作為代表菌株保存。所選擇的28株代表菌中復(fù)篩出能以柴油為唯一碳源的降油菌7株，除S1菌株外，其余菌株來源于樣品G，因此，翅堿蓬根系的共互生菌中存在較多可利用石油烴的菌株，它們有可能與翅堿蓬組成一個協(xié)同作用體［2-3，18］。在植物生物修復(fù)中，根際微生物在根系分泌物的作用下，可加速農(nóng)藥、石油等土壤有機污染的降解；對于個別難降解的有機污染物，根系分泌物還可在降解中與微生物發(fā)生共降解作用，據(jù)報道，難以降解的有機物污染物的降解大多利用此作用［4-6，19］。本研究中從菌株分離結(jié)果推測，G11和G12菌株有可能與翅堿蓬根系形成互生或共生關(guān)系，具體機制有待深入研究。

本研究中，根據(jù)7株具有石油烴利用能力菌株對柴油的原始降解率結(jié)果分析，作用3 d時，除S1 和G12菌株降解率超過20%外，其余菌株降解率均較低；作用5 d后，除G3菌株外，其他菌株降解率均有所提高，其中S1、G12菌株降解率仍然最高，G10、G11菌株也有較大幅度提升；作用7 d后，降解率保持較高的為S1、G11和G12菌株，分別為41.09%、31.68%和29.70%。經(jīng)鑒定，S1為微桿菌屬Microbacterium，與Microbacterium saperdate的相似性高達98.7%，G11、G12菌株皆為劉志恒菌屬Zhihengliuella［20］。王春明等［16］對微桿菌3-28菌株降解萘、菲、蒽、芘的性能進行了研究，結(jié)果表明，3-28菌株對此4種物質(zhì)有著較高的降解能力，作用5 d后，萘、菲完全降解，而蒽、芘在作用 28 d時的降解率分別達到了 97.54%、90.2%。Chen等［21］的研究中有對其模式菌株Zhihengliuella halotolerans的相關(guān)報道，但目前對于劉志恒菌屬，特別是其降油性能方面，國內(nèi)外文獻中鮮有報道。本研究中，G11、G12菌株的降解率有明顯差別，具體原因有待進一步研究。

從菌株的生長特性結(jié)果可知，3株菌 （S1、G11、G12）的生長溫度范圍均為15～35℃，最適生長鹽度分別為0、20、20，最適生長pH分別為5、7、7。S1菌株降解率最高，雖然其最適生長條件與海洋生態(tài)環(huán)境條件有差距，但在鹽度為20、pH為8的條件下也能良好生長，3株菌均能適應(yīng)沿海灘涂的理化條件生長。近年來，國內(nèi)外學(xué)者進行了大量植物-微生物單一菌種及菌群聯(lián)合修復(fù)污染土壤的研究，Soleimani等［22］將內(nèi)生真菌Neotyphodium coenophialum和Neotyphodium uncinatum侵染高羊茅Festuca arundinacea Schreb.和草甸羊茅Festuca pratensis Huds.培養(yǎng)7個月后發(fā)現(xiàn)，真菌侵染的植物根系不僅生物量有明顯增加，石油污染土壤中的總石油烴 （TPH）和多環(huán)芳烴 （PAHs）降解率也分別達到了80% ～84%和64% ～72%。Hernandez-Ortega等［23］研究百花草木犀 Melilotus albus與叢植菌根真菌 （AMF）聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤時也發(fā)現(xiàn)，AMF能夠減少柴油對植株的毒性，同時提高生物量，間接提高菌株的降油率。植物與特定的菌根真菌或根際菌群協(xié)同作用，增加對污染物的吸收和降解是一個很有價值的研究方向，目前此方面研究較少。Caman等［24］以柳樹為研究對象，利用樹木根部的根際微生物促進石油烴的生物降解，以修復(fù)威斯康星州一塊被柴油污染的土壤，結(jié)果十分理想，作用24周時土壤中40%～90%的柴油被降解；劉鵬等［25］利用高效石油降解菌結(jié)合種植大豆、堿草等植物對石油污染土壤進行聯(lián)合修復(fù)，作用 135 d時石油烴降解率達 63.65% ～83.26%，同時發(fā)現(xiàn)，根際土壤的石油烴含量明顯低于非根際土壤。本研究中分離篩選的3株目的菌株，在短時間內(nèi)即可達到較高的降油效果，有望成為構(gòu)建翅堿蓬-細菌復(fù)合修復(fù)載體的備選菌株，其較長時間的降油性能以及對石油烴不同成分的降解性能需進一步研究。

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Screening and growth of oil-degrading bacteria from roots of seepweed herb Suaeda heteroptera Kitag

LI Zuo-yang，TIAN Rui，YU Zi-chao，WANG Bin
（Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province，Dalain Ocean University，Dalian 116023，China）

In this study，culturable bacteria were isolated from soil and roots of seepweed herb Suaeda heteroptera from which the oil-degrading strains were screened using plates containing diesel oil as the sole carbon source in order to provide dominant strains for the establishment of practical composite technology using Suaeda heteropterabacteria carrier to repair the oil pollution in coastal beach.During the experiment，the original degradation rates of diesel were measured by the oil-degrading strains，through which the strains with high degradation rates were selected as the target strains in order to investigate their degradation of diesel and growth in 3，5，and 7 d.The strains with excellent degradation property were identified by morphological observation and analysis of 16S rDNA sequences and physio-biochemical characteristics.A total of 28 strains were isolated，in which 7 strains numbered as S1，G3，G4，G9，G10，G11 and G12 were tested to have oil degrading ability.It was found that the original diesel degradation rate was 34.21%in S1，3.68%in G3，18.40%in G4，18.95%in G9，0.52%in G10，9.47%in G11，and 21.05%in G12 in 3 d；44.06%，3.19%，23.90%，24.70%，31.47%，25.90%，and 46.22%at 5 d，and 41.09%，1.49%，14.36%，28.22%，14.36%，29.70%，and 31.68%at 7 d，S1，G11 and G12 showing the excellent degradation.S1 shared the maximal 16S rRNA gene sequence similarity with the type strain Microbacterium saperdate（98.7%），was affiliated with the genus Microbacterium.G11 and G12 which exhibited the highest 16S rRNA gene sequence similarity with the type strains of Zhihengliuella halotolerans （99.8%）were both affiliated with the genus Zhihengliuella.The suitable growth temperature for S1，G11 and G12 was 15-30℃，the optimal salinity for their growth were 0，20 and 20，and the optimal pH 5，7 and 7，for growth respectively.

Suaeda heteroptera Kitag；oil-degradation bacterium；identification

Q935

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.01.006

2095-1388（2016）01-0030-07

2015-05-03

國家海洋公益性行業(yè)科研專項 （201305002，201305043）

李作揚 （1992—），女，碩士研究生。E-mail：lizuoyang1314@126.com

王斌 （1962—），女，教授。E-mail：wangbin@dlou.edu.cn